Name: Fabricación de concentrado, de oxígeno a base de lípidos microburbujas Emulsiones por High Shear Homogeneización y Concentración de serie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Aprende a fabricar microburbujas de oxígeno lipídicas mediante homogeneización de alto cizallamiento y concentración por centrifugación. Este método produce dos litros de emulsión con 90% de oxígeno para aplicaciones terapéuticas intravenosas.

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Financiación: Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y de Material Command (USAMRMC) y gestionado por el Centro de Investigación de Telemedicina y Tecnología Avanzada. Shunxi Ji contribuyó a la modificación de las jeringas como se describe aquí.

1. Sistema de Configuración El sistema consta de una explotación y concentrando tanque (HCT) equipado con un único mezclador etapa, un homogeneizador de alta cizalla en línea, una bomba de rodillo para mover fluido entre el HCT y el homogeneizador, y un intercambiador de calor (Figura 1). <ol><li> Coloque una esterilizados, de boca ancha 4 L recipiente de recogida de vidrio equipado con 2 puertos base y 3 puertos laterales debajo de la mesa de mezclas de una sola etapa. Bajar el cabezal mezclador a la boca del recipiente y asegurar un ajuste estanco a los gases con juntas de goma o cinta (con el fin de evitar que el aire ambiente a partir de la contaminación del espacio de cabeza). </li><li> Coloque uno de los puertos base (Figura 1, # puerto 1) del HCT con 3/8 estéril &quot;(ID) tubo transparente, aproximadamente 10&quot; de largo, provista de una llave de 3 vías en la punta para la recolección de la emulsión concentrada . </li><li> Montar el segundo puerto base (Figura 1, # puerto 2) con estériles de 3/8 &quot;(ID) tubos, approximately 36 &quot;de longitud. Alimentar este tubo a través de una bomba de rodillos. Coloque la entrada del homogeneizador de alta cizalla con una pieza en T que incluye dos puertos y conectar de la siguiente manera: conectar la tubería desde el puerto # 2, a través de la bomba de rodillos y conectar con el puerto lateral de la pieza en T. Conecte el otro puerto para un tanque de oxígeno utilizando un medidor de flujo de gas de oxígeno de bajo flujo. </li><li> Conectar el puerto de salida del homogeneizador de alto cizallamiento al puerto de entrada de un intercambiador de calor en línea se mantiene a 4 ° C. Conectar el puerto de salida del intercambiador de calor para el puerto de retorno de la HCT (Figura 1, el puerto # 3), la creación de un sistema de bucle cerrado. </li><li> Adjuntar un tanque de oxígeno (a través de un medidor de flujo) a la HCT (Figura 1, el puerto # 4). Conectar un monitor de la composición del gas que está abierto a la atmósfera para el puerto superior de la HCT (Figura 1, el puerto # 5). </li><li> Si se desea la esterilidad, esterilizar los componentes de vidrio y de metal antes de cada uso por autoclave. Esterilizar los componentes de tubos y co plásticonnectors por óxido de etileno antes de cada uso. Esto es especialmente importante si el producto va a ser probado in vivo. </li></ol> 2. LOM Fabricación <ol><li> Colocar 20 g de GMP 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) y 10 g de colesterol en la base de la HCT. Añadir 1 l de plasma-Lyte A a la HCT y agitar la mano durante 1 min, la integración tanto de lípidos como sea posible en la fase acuosa. </li><li> Bajar el mezclador de una sola etapa en la fase acuosa, asegurándose de que todo el cabezal de la batidora está cubierta por la fase acuosa. Asegúrese de que la parte superior de la HCT es tight gas (véase el paso 1.1 anterior) y que no hay puertos laterales abiertos. Encienda la fuente de gas conectado al puerto # 4 y esperar hasta que la fracción de oxígeno del espacio de cabeza HCT alcanza&gt; 95%. A 10 L / min (LPM), esto se llevará ~ 10 min. </li><li> Uso del mezclador de una sola etapa, mezclar la emulsión precursora durante 5 min a 5000 rpm. La mezcla resultante debería aparecer de color blanco pálido y no contienen lipi visibled grumos. Una vez mezclado, mezcla lípido-agua no utilizada se puede almacenar a 4 º C durante un máximo de 30 días antes de un solo uso. </li><li> Primer el sistema de circuito cerrado con toda la emulsión precursora mediante la activación de la bomba de rodillos a 1.3 LPM. Una vez que el sistema está preparado, mantenga la bomba al 1,3 LPM. </li><li> Para comenzar la fabricación de las LOM, encienda el homogeneizador de alto cizallamiento en línea a 7.500 rpm. Inmediatamente después, gire en el flujo de oxígeno a la parte de entrada del homogeneizador a 0.5 LPM. Mantenga el mezclador de una sola etapa (en el HCT) sobre a 3.500 rpm. LOM se forman en la interfase de las palas del rotor y las pantallas de emulsor en el homogeneizador en línea (Figura 2). En cuestión de minutos, el líquido debe convertirse visiblemente más viscoso. Un enfoque más riguroso es determinar la viscosidad como una función del tiempo, lo que puede hacerse mediante la eliminación de partes alícuotas desde el puerto 1 durante la fabricación y el análisis con un viscosímetro. Nota: Si las burbujas de aire visibles están presentes en el tubo que sale de la mezcladora, de oxígenofluir al homogeneizador en línea es demasiado alto. Se valora por el flujo de gas hasta que el líquido es opaco y no contiene burbujas de gas visibles. </li><li> Ejecute el sistema durante 15 minutos, y luego apague la alta homogeneizador de cizallamiento y la entrada de oxígeno a la misma. Continuar para ejecutar el mezclador de una sola etapa en el HCT hasta que se retire la emulsión; Esto mitiga la separación de fases y mantiene el producto relativamente uniforme dentro de la HCT. Nota: El volumen de la emulsión lleno de gas debería aumentar aproximadamente 2 a 3 veces durante la fase de concentración de serie. Si no es así, compruebe para asegurarse de que el oxígeno está fluyendo hacia el homogeneizador de alta cizalla y que las concentraciones de lípidos en la emulsión precursora son correctas. Eficiencia de la producción disminuye a medida que disminuye la concentración de lípidos. </li></ol> 3. Colección, Concentración, evaluación y almacenamiento de LOM <ol><li> Adjunte una estéril, modificado 140 ml jeringa luer-lock a la llave de paso de puerto base # 1 en el recipiente de recogida. Elaborar 100 ml de líquido. Estrechamente tapa de la jeringa y repetir hasta que todo el líquido se ha eliminado. <ol><li> Modificar jeringas mediante la retirada de 100 ml de aire en la jeringa y luego cortar la exceso de material de la jeringa de émbolo y por encima de la marca de 140 ml. Llenar y jeringas vacías utilizando fórceps dentadas para elaborar el émbolo. Esta modificación permite la centrifugación más fácil. </li></ol></li><li> Jeringas centrífuga con el extremo tapado orientada hacia abajo en una refrigerada (4 º C) centrífuga cucharón a 225 g durante 10 min. </li><li> Tres capas de material aparecerán después de la centrifugación. Expulsar a la capa inferior de exceso de la fase acuosa turbia y deseche. La segunda capa es de color blanco brillante y contiene LOM concentrados. Transferencia de espuma concentrada a una jeringa impermeable a los gases usando una llave de paso de tres vías para evitar la contaminación gas ambiente. Desechar la capa final, que contiene gas oxígeno libre de LOM rotos. </li><li> Calidad de la espuma se puede evaluar por alcanzar ≥ 90% de gas de espuma concentrada. Calculcomió concentración de gas de la siguiente manera: Gas = Volumen% [(peso volumen de la espuma / espuma) - 1] x 100 <ol><li> Como un control de segunda calidad, las microburbujas de tamaño por oscurecimiento de luz para determinar si el tamaño de partícula está dentro del rango esperado. Cabe señalar que un cambio en el tiempo de homogeneización o formulación podría alterar el tamaño de burbuja. </li></ol></li><li> Estrechamente tapar la jeringa de vidrio con un racor Luer. LOM concentrados se pueden diluir con plasma-Lyte A en el momento de uso. Las jeringas se pueden almacenar a 22, 4, o -20 º C; temperaturas más frías pueden proporcionar una mayor estabilidad en el almacenamiento 7. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los pasos más importantes para la creación de LOM concentrados, altamente oxigenados son: 1) asegurarse de que la cámara de aire dentro de la HCT sigue plenamente oxigenada; 2) asegurarse de que la pureza de los excipientes lipídicos es óptima (incluyendo las condiciones de almacenamiento y uso de productos GMP); 3) asegurar que los lípidos en polvo se mezclan completamente con la fase acuosa antes de imprimar el sistema; y 4) prestando mucha atención al aumento de la fracción de gas dentro de la HCT para asegurarse de ...

Las microburbujas compuestas de la proteína, polímero, y cáscaras de lípidos se han desarrollado como vectores para la administración de fármacos, la terapia génica, y agentes de contraste de ultrasonido 1-5. Debido a que estos usos terapéuticos requieren persistencia intravascular de microburbujas, tales microburbujas son comúnmente llenos con gases inertes, de alto peso molecular, tales como los perfluorocarbonos 6, que tienen baja solubilidad en sangre y estabilizan la burbuja de 3,4. Recientemente, las microburbujas de oxígeno a base de lípidos (LOM) se han diseñado para administrar dosis terapéuticas de oxígeno, lo que puede preservar el suministro de oxígeno de los órganos diana y evitar la inestabilidad hemodinámica durante periodos de obstrucción de la vía aérea o la hipoxemia 7. Emulsiones diseñados para la administración intravenosa de gas requieren diferentes características de diseño que los utilizados para los agentes de contraste de ultrasonido o la entrega de fármacos. En primer lugar, debido a que el cuerpo consume grandes volúmenes de gas de oxígeno (~ 200 ml / min), LOM deben ser producidos yinyectado a gran escala. Esto requiere que el proceso de fabricación sea eficiente. En segundo lugar, el proceso de fabricación debe ser de circuito cerrado con el fin de evitar la contaminación de nitrógeno a través de la exposición de LOM (que debe ser llenado con 100% de oxígeno) al aire ambiente. En tercer lugar, porque el propósito de LOM es la entrega de gas por vía intravenosa, la fracción de gas de LOM se debe maximizar, reconociendo las limitaciones impuestas por la viscosidad de la emulsión 7. Finalmente, como con cualquier inyectable intravenosa, un control preciso sobre la distribución del tamaño de partícula es esencial para evitar la obstrucción microvascular 8. Hay varios métodos establecidos para la fabricación de microburbujas. La sonicación utiliza de alta intensidad, ultrasonido de baja frecuencia aplicada a la interfaz aire-líquido de una emulsión que incluye un agente tensioactivo, tal como un fosfolípido anfipático, en la presencia de un espacio de cabeza de gas para producir microburbujas 7,9. Este proceso se puede controlar mediante la variación de ultrala frecuencia del sonido, la potencia y duración del pulso, y la distribución del tamaño resultante se pueden adaptar para producir microburbujas de una distribución de tamaño específica, aunque sonicación rara vez se utiliza en la fabricación de microburbujas utilizados clínicamente. Fusión es la intensa agitación mecánica de un agente tensioactivo y gas en un sistema cerrado, que es también difícil de escalar para acomodar grandes volúmenes 2. Microfluídica basada en la gotita permite un control preciso de la distribución del tamaño de microburbujas 10-13. Aunque tradicionalmente difícil de escalar, multicanal, microfluidos de alta velocidad se han descrito lo que aumenta la eficiencia de producción de microburbujas 13. Las microburbujas fabricados utilizando cualquiera de estos métodos pueden requerir procesos de reducción de tamaño post-producción, tales como el fraccionamiento centrífuga 14,15 y microburbujas de flotación 16,17. Otro método establecido para la fabricación de microburbujas altamente estables es homogeniz cizallamientoación 6, que puede resultar en un patrón hexagonal de fosfolípido estabilizador sobre la superficie de microburbujas 18. Sobre la base de este concepto, se describe la incorporación de un homogeneizador de alto cizallamiento en línea para crear auto-montaje de LOM 19. En este proceso, el homogeneizador utiliza cuchillas que gira rápidamente en estrecha proximidad a finas pantallas duales emulsor de malla, la creación de alto cizallamiento mecánico e hidráulico para la creación de microburbujas. Concentración de serie de la emulsión de lípidos a través de este sistema se obtiene una fracción de gas cada vez más concentrada, que puede ser incluso concentra adicionalmente por centrifugación.

<table><tbody><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>770365</td><td>Producto alternativo: no GMP de NOF America (Coatsome MC-8080)</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Lyte A</td><td>VWR</td><td>80089-818</td><td>Alternativamente puede utilizar NaCl</td></tr><tr><td>Recipiente de recolección de vidrio</td><td>Specialty Glass, Inc.</td><td>Contacto personalizado</td><td>: Pam Zurbrick - 281-595-2210</td></tr><tr><td>Monitor de composición de gases (oxígeno)</td><td>Precision Medical</td><td>PM5900L</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de rodillos Sarns 8000</td><td>Calicut Medical</td><td>16407</td><td>Parte de un sistema de perfusión modular</td></tr><tr><td>Intercambiador de calor BIOtherm</td><td>Medtronic</td><td>ECMOtherm-II</td><td></td></tr><tr><td>Verso mezclador en línea de laboratorio</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>TH-IL-102-VERSO</td><td>Utilice cabezales de trabajo multietapa y extensión frontal con pieza</td></tr><tr><td>en T Pieza en T para el puerto de entrada Silverson Verso</td><td>Innovaciones de proceso</td><td>Contacto personalizado</td><td>: Brian Leavitt - 508-423-2266</td></tr><tr><td>Mezclador de laboratorio L5M-A</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>NC0136483</td><td>Utilice malla de emulsión de malla (fina)</td></tr><tr><td>Pinza dentada Rochester-Ochsner</td><td>Jeringa Fisher Scientific</td><td>13-812-18</td><td></td></tr> de <tr><td>140 ml</td><td>Kendall Healthcare Monoject</td><td>8881114030</td><td>Asegúrese de que haya un bloqueo luer.</td></tr><tr><td>IX71 Microscopio de luz invertida</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Retiga-2000R cámara microscópica</td><td>QImaging</td><td>RET-2000R-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Accusizer 780A Autodilución</td><td>PSS-NICOMP Sistemas de dimensionamiento de partículas</td><td>Fuera de producción</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de concentrado, de oxígeno a base de lípidos microburbujas emulsiones por high shear homogeneización y concentración de serie

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Microburbujas rellenas con gas que se han desarrollado como agentes de contraste de ultrasonidos y de administración de fármacos. Las microburbujas se pueden producir mediante el procesamiento de tensioactivos usando sonicación, agitación mecánica, dispositivos de microfluidos, o la homogeneización. Recientemente, las microburbujas de oxígeno a base de lípidos (LOM) han sido diseñados para suministrar oxígeno por vía intravenosa durante las emergencias médicas, revirtiendo la hipoxemia en peligro la vida, y la prevención de lesiones posteriores de órganos, paro cardíaco y muerte. Se presentan métodos para la producción a escala de microburbujas altamente oxigenados usando un homogeneizador de alta cizalla en bucle cerrado. El proceso puede producir 2 L de LOM concentrado (90% en volumen) en 90 min. Burbujas resultantes tienen un diámetro medio de ~ 2 m, y un perfil reológico compatible con la de la sangre cuando se diluye al 60% en volumen. Esta técnica produce LOM en alta capacidad y con una alta pureza de oxígeno, lo que sugiere que esta técnica puede ser útil para los laboratorios de investigación traslacional.

Homogeneización de alta cizalladura permite la producción eficiente (es decir, dentro de una tarde) de LOM suficientes para un estudio en animales y no requiere conocimientos técnicos. Una vez hábil, hasta 2 litros de LOM concentradas se puede fabricar en 90 min. Tamaño de microburbujas y morfología se evaluó mediante microscopía óptica y por oscurecimiento de luz. Cuando se visualizó una muestra de 10 l de LOM, se observaron LOM esféricas, así como una relativa escasez de restos de...

Se describen métodos para la fabricación de grandes volúmenes de microburbujas de oxígeno a base de lípidos (LOM) diseñados para la administración intravenosa de oxígeno usando homogeneización de alta cizalladura y la concentración de serie.

Fabricación de concentrado, de oxígeno a base de lípidos microburbujas Emulsiones por High Shear Homogeneización y Concentración de serie

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

El objetivo general de este procedimiento es fabricar un gran volumen de microburbujas autorganizadas, basadas en lípidos y de oxígeno, o OMS, para la administración intravenosa de oxígeno. Esto se logra utilizando un homogeneizador de alta cizalladura y un tanque hermético al gas para fabricar y concentrar en serie las OMS. El segundo paso consiste en utilizar jeringas modificadas para extruir una emulsión de LOM que contiene 70 por ciento en volumen de oxígeno.A continuación, la emulsión se concentra mediante centrifugación para obtener una espuma de oxígeno al 90 por ciento en volumen. El paso final consiste en realizar un control de calidad calculando el porcentaje en volumen de oxígeno y evaluando la distribución del tamaño de partícula mediante tecnología de dispersión de luz. En definitiva, la homogeneización a alta cizalladura produce dos litros de OMS que contienen un 90 % de oxígeno en volumen.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos de fabricación existentes, como la sonicación y la amalgamación, es que la homogenización produce microburbujas autorreensambladas en volúmenes del orden de litros, un volumen necesario para realizar pruebas en animales grand

manufacture-concentrated-lipid-based-oxygen-microbubble-emulsions

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Bioingeniería

La combinación de generación monodispersas gota con ordenamiento inercial de células y partículas, se describe un método para encapsular un número deseado de células o partículas en una sola gota a tasas kHz. Se demuestra la eficiencia de dos veces superiores a las de la encapsulación no ordenada de las gotas de una y dos partículas.

De alto rendimiento de una sola célula y múltiple las células de micro-encapsulación

Este protocolo describe un método de extrusión para preparar vesículas lipídicas de tamaños sub-micra con un alto grado de homogeneidad. Este método utiliza un sistema de presión controlada con tasas controladas de nitrógeno de flujo para la preparación de liposomas. La preparación de...

Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

De chorro de microfluidos contra una bicapa lipídica interfaz de gotita ofrece una manera fiable para generar vesículas con el control de la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación de material. Esta técnica se puede aplicar para estudiar una variedad de sistemas biológicos en los que se desean biomoléculas compartimentadas.

Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

La generación de emulsiones dobles microfluídicas generalmente involucra dispositivos con humectabilidad estampada o componentes de vidrio fabricados a medida. Aquí describimos la fabricación y prueba de un generador de doble emulsión de polidimetilsiloxano (PDMS) que no requiere tratamiento superficial ni procesos de fabricación complicados, y es capaz de producir emulsiones dobles de hasta 14 μm.

Generación de doble emulsión utilizando un flujo Focus Dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-axial

Un dispositivo de flujo Co inversión de fase se demuestra para generar gotas de alta viscosidad monodispersa sobre 1 Pas, que es difícil de realizar en microfluídica de gota.

Fabricación de gotas de alta viscosidad usando dispositivos capilares microfluídicos con estructura de flujo de co inversión de fase

El protocolo presenta los parámetros optimizados para preparar liposomas termosensibles utilizando el dispositivo de microfluidos de micromezcladores de espiga escalonado. Esto también permite la co-encapsulación de doxorubicina y verde indocyanina en los liposomas y la liberación fototérmica-activada de doxorubicina para la liberación controlada / desencadenada de fármacos.

Producción microfluídica de liposomas sensibles a la temperatura que contienen lysolipido

Este protocolo describe un método para generar grandes volúmenes de microburbujas de decafluorobutano encapsuladas en lípidos utilizando sonicación de punta de sonda y posteriormente condensarlos en nanogotas de cambio de fase utilizando extrusión de alta presión y filtración mecánica.

Producción de nanogotas de decafluorobutano de cambio de fase filtradas por membrana a partir de microburbujas preformadas

El presente protocolo describe el ensamblaje de liposomas asistido por octanol (OLA), una técnica microfluídica para generar liposomas biocompatibles. OLA produce liposomas monodispersos de tamaño micrométrico con encapsulación eficiente, lo que permite la experimentación inmediata en chip. Se prevé que este protocolo sea particularmente adecuado para la biología sintética y la investigación de células sintéticas.

Conjunto de liposomas asistido por octanol en chip para bioingeniería

Este protocolo describe la fabricación de microburbujas lipídicas y un método compatible de radioetiquetado de microburbujas de un solo recipiente con una eficiencia de etiquetado del &gt;95% sin purificación que conserva las propiedades fisicoquímicas de las microburbujas. Este método es eficaz en diversas formulaciones de microburbujas lipídicas y puede adaptarse para generar microburbujas radiactivas y/o fluorescentes.

Fabricación y etiquetado de microburbujas con trazadores fluorescentes y radiactivos

Ultrasonido dirigido destrucción de microburbujas (UTMD) se puede utilizar para dirigir el sitio de entrega específicos de moléculas bioactivas, incluyendo genes terapéuticos, para dirigirse a los órganos accesibles a la ecografía, como el corazón y el...

Introducción a la técnica de ultrasonido enfocado destrucción de microburbujas

Aprende a fabricar microburbujas de oxígeno lipídicas mediante homogeneización de alto cizallamiento y concentración por centrifugación. Este método produce dos litros de emulsión con 90% de oxígeno para aplicaciones terapéuticas intravenosas.

Fabricación de concentrado, de oxígeno a base de lípidos microburbujas Emulsiones por High Shear Homogeneización y Concentración de serie (Video) | JoVE Journal

Fabricación de concentrado, de oxígeno a base de lípidos microburbujas Emulsiones por High Shear Homogeneización y Concentración de serie

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