Fabricación de concentrado, de oxígeno a base de lípidos microburbujas Emulsiones por High Shear Homogeneización y Concentración de serie

El objetivo general de este procedimiento es fabricar un gran volumen de microburbujas autorganizadas, basadas en lípidos y de oxígeno, o OMS, para la administración intravenosa de oxígeno. Esto se logra utilizando un homogeneizador de alta cizalladura y un tanque hermético al gas para fabricar y concentrar en serie las OMS. El segundo paso consiste en utilizar jeringas modificadas para extruir una emulsión de LOM que contiene 70 por ciento en volumen de oxígeno.

A continuación, la emulsión se concentra mediante centrifugación para obtener una espuma de oxígeno al 90 por ciento en volumen. El paso final consiste en realizar un control de calidad calculando el porcentaje en volumen de oxígeno y evaluando la distribución del tamaño de partícula mediante tecnología de dispersión de luz. En definitiva, la homogeneización a alta cizalladura produce dos litros de OMS que contienen un 90 % de oxígeno en volumen.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos de fabricación existentes, como la sonicación y la amalgamación, es que la homogenización produce microburbujas autorreensambladas en volúmenes del orden de litros, un volumen necesario para realizar pruebas en animales grandes sobre la administración terapéutica de oxígeno. Uno de los usos de esta técnica es tratar pacientes con hipoxemia severa, ya que las microburbujas llenas de oxígeno transfieren oxígeno al desoxihemoglobina en cuestión de segundos y transportan tres veces la cantidad de oxígeno del torrente sanguíneo. La demostración de este método es importante en función de la profundidad de la cabeza del homogenizador.

El mantenimiento de un entorno puramente oxidado y la diferenciación entre la fase de LMS concentrada y la fase acuosa pueden resultar difíciles de apreciar. El sistema para la fabricación de microburbujas de oxígeno basadas en lípidos, o OMS, consiste en un tanque de retención y concentración o HCT equipado con un mezclador de una sola etapa, un homogeneizador en línea de alta cizalladura, una bomba peristáltica para mover el fluido entre el HCT y el homogeneizador, y un intercambiador de calor.

Para comenzar la configuración del sistema, coloque un recipiente colector de vidrio esterilizado de cuatro litros con boca ancha, equipado con dos puertos en la base y tres puertos laterales, debajo del mezclador de una sola etapa. Conecte uno de los puertos de la base, el puerto número uno del HCT, a un tubo transparente estéril de tres octavos de pulgada de diámetro interno, de aproximadamente 10 pulgadas de largo, que tenga una llave de paso de tres vías en el extremo para la recolección de la emulsión concentrada. A continuación, conecte el segundo puerto de la base, el puerto número dos, a un tubo estéril de tres octavos de pulgada de diámetro interno, de aproximadamente 36 pulgadas de longitud. Pase este tubo a través de la bomba de rodillos.

La entrada del homogeneizador de alta cizalladura está equipada con una pieza en T que incluye dos puertos. Conecte un tubo desde el puerto número dos a través de la bomba peristáltica y conéctelo al puerto lateral de la pieza en T. Conecte el otro puerto a un tanque de oxígeno utilizando un medidor de flujo de gas oxígeno de bajo flujo.

Conecte el puerto de salida del homogeneizador de alta cizalladura al puerto de entrada de un intercambiador de calor en línea mantenido a cuatro grados Celsius. Conecte el puerto de salida del intercambiador de calor al puerto de retorno del HCT, creando un sistema de circuito cerrado. Conecte el tanque de oxígeno mediante un medidor de flujo al HCT a través del puerto número cuatro.

Por último, conecte un monitor de composición de gas abierto a la atmósfera al puerto superior del HCT. Para comenzar este procedimiento, coloque 20 gramos de GMP one two DYS steer oil, SN glycerol three PHOSPHOCHOLINE o DSPC y 10 gramos de colesterol en la base del HCT. Añada un litro de plasma light A al HCT y agite manualmente durante un minuto, integrando la mayor cantidad posible de lípido en la fase acuosa.

Baje el mezclador de una sola etapa hasta introducirlo en la fase acuosa, asegurándose de que toda la cabeza del mezclador quede cubierta por la fase acuosa. Para evitar que el aire ambiente contamine el espacio de cabeza, utilice sellos de goma o cinta adhesiva para garantizar que la parte superior del HCT sea hermética al gas y no tenga puertos laterales abiertos. Encienda la fuente de gas conectada al puerto número cuatro y espere hasta que la fracción de oxígeno en el espacio de cabeza del HCT alcance un valor superior al 95 %. Con el mezclador de una sola etapa, mezcle la emulsión precursora durante cinco minutos. A 5.000 RPM, la mezcla resultante debe presentar un color blanco pálido y no contener grumos visibles de lípidos.

Una vez mezclada, la mezcla no utilizada de lípidos y agua puede almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta 30 días antes de la administración única. Use la bomba de rodillos para cebado de todo el sistema de circuito cerrado con la emulsión precursora, encendiendo la bomba a 1,3 litros por minuto o LPM. Una vez que el sistema esté cebado, mantenga la bomba encendida a 1,3 LPM para comenzar la fabricación de las LO.

Encienda el homogeneizador de cizallamiento alto en línea a 7.500 RPM. Inmediatamente después, encienda el flujo de oxígeno hacia la parte de entrada del homogeneizador a 0,5 LPM. Mantenga el mezclador de una sola etapa en el HCT a 3.500 RPM.

Los Oms se forman en la interfaz entre las palas del rotor y las pantallas de emulsión dentro del homogeneizador en línea. En los primeros minutos, el fluido debe volverse visiblemente más viscoso. Haga funcionar el sistema durante 15 minutos y luego apague el homogeneizador de alta cizalladura y la entrada de oxígeno al mismo.

Esto mitiga la separación de fases y mantiene el producto relativamente uniforme dentro del HCT. Tenga en cuenta que el volumen de la emulsión cargada con gas debe aumentar aproximadamente de dos a tres veces durante la fase de concentración en serie. Las jeringas de bloqueo de 140 mililitros para recolectar el OMS fabricado se han modificado previamente extrayendo 100 mililitros de aire dentro de la jeringa y luego cortando con sierra el émbolo y el material de la jeringa excedentes por encima de la marca de 140 mililitros.

Coloque una jeringa estéril modificada en la llave de paso conectada al puerto basal número uno del recipiente de recolección; utilice pinzas dentadas para bajar el émbolo y aspirar 100 mililitros de líquido, tape firmemente la jeringa y repita hasta que se haya eliminado todo el líquido. Centrifugue las jeringas con el extremo tapado orientado hacia abajo en una centrífuga de cubeta refrigerada a 225 ×g durante 10 minutos. Tras la centrifugación, serán visibles tres capas de material; expulse y deseche la capa inferior excedente de la fase acuosa turbia.

La segunda capa es blanca brillante y contiene oms concentradas. Transfiera la espuma concentrada a una jeringa de vidrio impermeable al gas utilizando una llave de paso de tres vías para evitar la contaminación por gases ambientales. Descarte la capa final, que contiene gas de oxígeno libre procedente de las oms rotas.

La calidad de la espuma puede evaluarse calculando la concentración de gas de la siguiente manera. Una espuma de alta calidad alcanzará una concentración de gas mayor o igual al 90 por ciento en volumen como un segundo control de calidad; tamaño de microburbujas mediante dispersión de luz óptica para determinar si el tamaño de las partículas se encuentra dentro del rango esperado. Debe tenerse en cuenta que un cambio en el tiempo de homogenización o en la formulación podría alterar el tamaño de las burbujas, tapando herméticamente las jeringas de vidrio que contienen oms concentrado.

Con un adaptador de bloqueo para jeringa, las jeringas pueden almacenarse a 22 grados Celsius, cuatro grados Celsius o menos 20 grados Celsius. Temperaturas más bajas pueden proporcionar una mayor estabilidad de vida útil. Mediante este protocolo, se pueden fabricar hasta dos litros de OMS concentrado en 90 minutos.

La visualización de una muestra de 10 microlitros de OMS mediante microscopía óptica reveló OMS esféricas, así como una cantidad relativamente alta de restos lipídicos. Cuando se evaluó la misma muestra de OMS mediante dispersión óptica, el diámetro medio de las partículas fue de 2,624 ± 0,332 micrómetros. Más del 90 % de las OMS tenían un diámetro menor a 10 micrómetros y la población era polidispersa.

La viscosidad de la emulsión dependió en gran medida de la fracción de gas y, por lo tanto, de la concentración de microburbujas. Se estudiaron alícuotas de dos mililitros de emulsión de LOM al 60, 70 y 90 por ciento en volumen de gas mediante un barrido de flujo en estado estacionario utilizando una placa paralela de 40 milímetros.

La geometría según se variaba el estrés de 0,1 a 1000 pascales mostró que el OMS gaseoso que contenía 60 por ciento en volumen de gas presentaba un perfil radiológico similar al de la sangre humana. El contenido de oxígeno del OMS se probó añadiendo volúmenes variables de oxígeno contenidos en un OMS al 60 por ciento en volumen a alícuotas de sangre humana desaturada con un déficit de oxígeno conocido. La relación entre el volumen de oxígeno añadido dentro del OMS y el aumento volumétrico del contenido de oxígeno en la sangre fue de 1,053 más o menos 0,03025.

Sugiere que las SOM probadas contienen casi un 100 % de oxígeno, presentan pocos bolsillos de gas atrapado y transfieren eficazmente toda su carga de oxígeno a la sangre humana in vitro. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para fabricar dos litros de SOM en 90 minutos si se realiza adecuada y eficientemente. Durante el intento de este procedimiento, es importante recordar mantener la inspección visual de las SOM acumuladas y realizar un control de calidad sobre la concentración de la espuma de SOM. Tras este procedimiento de fabricación, las SOM pueden utilizarse para la inyección intravenosa a gran escala y la administración de gases terapéuticos.