Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM)

El objetivo general de este procedimiento es observar los cambios dinámicos en la proteína FTSZ durante la división celular en bacterias. Esto se logra mediante la aplicación de células sutiles de bacilo que expresan la fusión GFP dicha FTS a la superficie de una pequeña almohadilla de aros. Luego, la almohadilla se invierte y se transfiere a una placa de Petri con un fondo deslizante de cubierta de vidrio.

El segundo paso es adquirir imágenes de lapso de tiempo de las bacterias durante la división celular utilizando una microscopía de iluminación estructurada en 3D o un sistema de imágenes SIM 3D. A continuación, se evalúa la calidad de los datos brutos y se descartan las imágenes con una disminución de intensidad superior al 30% debido al fotoblanqueo. El paso final es analizar cuantitativamente los cambios en la localización de la proteína durante la división celular midiendo la distribución de la intensidad de fluorescencia de la proteína F-T-S-Z-G-F-P a lo largo del tiempo.

En última instancia, se utiliza la SIM 3D rápida para mostrar qué tan dinámicas son las proteínas dionas durante la división celular en las bacterias. La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes como la microscopía confocal, es que obtenemos información tridimensional sobre los cambios que se producen en la división celular en células vivas. Aunque este método proporciona información sobre la citocinesis bacteriana, también podría aplicarse a otros sistemas en los que queremos observar los cambios dinámicos de las proteínas, como las células de mamíferos M.

La primera vez que tuvimos la idea de esto fue cuando vimos que las imágenes de simulación 3D tradicionales de células bacterianas fijas mostraban que la proteína FDZ no estaba distribuida homogéneamente alrededor del anillo zed. Queríamos examinar más a fondo si esta distribución estaba relacionada con los cambios que ocurrieron durante la constricción del anillo Zed. Por lo general, las personas que son nuevas en esta técnica tendrán dificultades debido a que no pueden hacer coincidir el índice de refracción de su aceite con su muestra, y esto conducirá a imágenes de mala calidad.

Para preparar las células más sutiles del bacilo para la obtención de imágenes, haga crecer las células hasta la mitad de la fase exponencial como se detalla en el protocolo de texto. A continuación, fije un marco adhesivo en un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar retirando primero la fina lámina de poliéster. Luego aplique la superficie adhesiva expuesta del marco a la superficie del portaobjetos del microscopio para crear efectivamente un pozo cuadrado en la parte superior del portaobjetos, deje la lámina gruesa de poliéster unida al marco para evitar que se pegue el portaobjetos de la cubierta en los pasos posteriores.

A continuación, derrita una solución de aro en el microondas hasta que hierva la pipeta 67 microlitros de los aros derretidos en el marco adhesivo. Coloque inmediatamente un cubreobjetos encima de los aros para crear una superficie plana y déjelo a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. Retire el cubreobjetos durante uno o dos minutos mientras se recolecta la muestra.

Recolectar una alícuota de un mililitro de la muestra después de la centrifugación a 8.000 RPM durante los segundos decantar el sobrenadante resuspender el pellet en 200 microlitros de medio fresco. Tome 2,5 microlitros de la muestra concentrada y pipetee en la almohadilla aros preparada previamente. Extienda la muestra uniformemente a lo largo de la superficie plana de la almohadilla aros.

A continuación, retire el marco adhesivo del portaobjetos del microscopio con unas pinzas sin tocar la almohadilla aros. Transfiera la almohadilla aros del microscopio. Deslice hacia una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro con un fondo deslizante de cubierta de vidrio.

Para imágenes de alta resolución. Invierta la almohadilla aros para que la suspensión de la celda esté en contacto con el cubreobjetos de la placa de Petri. El día del experimento, encienda el sistema de imágenes OMX 3D SIM al menos una hora antes de la obtención de imágenes para permitir que el sistema y los láseres se estabilicen por completo.

A continuación, encienda los diferentes componentes enumerados en el protocolo de texto en la estación de trabajo del controlador principal. Abra el software OMX haciendo clic en el icono. Establezca la ruta del archivo para el almacenamiento de datos en una carpeta de datos adecuada.

A continuación, inicie el software de trabajo suave. Encienda los láseres necesarios para los experimentos en la pantalla principal en la sección de parámetros de luz. Active la cámara FITC desde la selección de canal y proceda a verificar los parámetros enumerados en el protocolo de texto.

Aplica una gota de aceite en la parte superior del objetivo. Coloque la placa de Petri de muestra que contiene las células preparadas en el inserto de la etapa y cúbrala con la tapa calefactora circular. Baje la etapa hasta que el aceite toque el fondo de la placa de Petri de muestra.

Deje que el plato se equilibre durante 15 minutos En la etapa con una configuración de exposición baja, concéntrese en la muestra usando los controles de la etapa de posicionamiento nano. Enfoque hacia arriba y hacia abajo a través de la muestra para determinar si la luz se distribuye uniformemente por encima y por debajo del plano focal de la muestra. A continuación, utilice tamaños de paso de 0,5 micras y marque la parte superior e inferior de la pila de imágenes antes de volver al centro de la muestra en la pestaña del experimento, haga clic en el botón obtener grosor para establecer el grosor de adquisición de la muestra.

Determine el valor de intensidad máxima de la imagen de muestra con los ajustes de exposición actual y porcentaje de luz transmitida. Este valor se encuentra debajo de la ventana de la imagen. Para imágenes de lapso de tiempo, ajuste la exposición y el porcentaje de luz transmitida para obtener una intensidad máxima de 1100 a 1400.

Sobre el fondo. Para la imagen, active la sección de lapso de tiempo en la pestaña del experimento. Establezca la velocidad de fotogramas requerida y el tiempo total en el archivo de datos.

Introduzca un nombre de archivo adecuado. Haga clic en el botón Ejecutar para comenzar la adquisición de imágenes al inicio de la adquisición de imágenes. Observe el valor de intensidad máxima de la imagen al principio de la adquisición de la imagen para el primer fotograma de la serie temporal.

Al final de la adquisición del primer fotograma, compruebe que no ha habido más de un 10% de disminución en la intensidad de la señal a través del Zack para este primer fotograma. Al final de la adquisición de la serie temporal, abra el archivo de imagen sin procesar resultante con un sufijo DV y compruebe la disminución de la intensidad máxima de la señal desde el principio de la serie temporal hasta la imagen final. Descarte cualquier punto de tiempo en el que haya habido más del 30% de blanqueo fotográfico desde el menú de proceso, active la ventana de reconstrucción SI.

Utilice la configuración preexistente para todos los parámetros. Active el botón OTF específico del canal utilizado y ajústelo al conjunto de filtros estándar. Active el botón de ángulos KO específicos del canal utilizado y ajústelo al conjunto de filtros estándar.

Arrastre y suelte el archivo sin procesar en el espacio de archivos de entrada. Haz clic en hacerlo. Examine la distribución de FTSZ alrededor del anillo Z para crear gráficos de intensidad en 3D.

A continuación, abra un archivo de imagen 3D. Para ver los segmentos z individuales. Utilice la herramienta de visualización de volumen ubicada en la pestaña del menú de visualización.

Para recortar una región de interés, introduzca el número de ventana de esta imagen 3D en la ventana de entrada e introduzca un número de ventana nuevo y no utilizado en la ventana de salida. El botón de selección de región estará disponible para recortar un anillo Z individual de interés del campo de visión original de 40 por 40 micras. Ajuste el eje deseado y el grado de rotación en la pestaña de rotación.

Haga clic en el botón Hacerlo. Desplácese por el volumen para obtener la perspectiva deseada, el anillo Z. Utilice la herramienta inspector de datos para ajustar las dimensiones de la fila de columna y crear una nueva región de interés alrededor de un anillo Z individual.

Haga clic en el centro de la imagen para colocar esta nueva región de interés. Los datos de la imagen de texto son una tabla generada automáticamente que muestra la intensidad de fluorescencia de cada píxel dentro de la región de interés. Haga clic en el botón Gráfico 3D para ver inicialmente el gráfico de intensidad.

Alternativamente, los datos de la imagen de texto se pueden exportar haciendo clic en el botón Guardar datos de la tabla. En el menú de archivo, copie los datos de imagen del archivo de texto guardado en una nueva hoja de cálculo. Selecciona todas las celdas dentro de la hoja de cálculo y crea un nuevo gráfico de superficie 3D.

Formatee el gráfico de trazado de intensidad 3D para su publicación para datos de lapso de tiempo. Repita estos pasos en cada uno de los diferentes puntos de tiempo del archivo de imagen 3D. Cuando se visualiza mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional, el anillo Z aparece como una sola banda transversal de fluorescencia en bacilos sutiles.

La intensidad de fluorescencia en toda esta banda es uniforme. El patrón de localización ofrece poca información sobre la organización estructural y la distribución de los polímeros FTS dentro del anillo, aquí se examinan las mismas células. Usando el método FAST 3D sim.

La rotación de la imagen SIM 3D alrededor del eje Z permite la visualización del anillo Z como una estructura de anillo genuina en el espacio tridimensional. La mejora en la resolución permite la visualización de la distribución heterogénea de FTSZ dentro del anillo. Ejemplos adicionales de anillos Z de Bacillus visualizados por esta técnica ilustran cómo la intensidad de fluorescencia alrededor del anillo Z nunca es la misma.

Además, se observan regiones de muy baja intensidad de fluorescencia o brechas. Para cuantificar estas observaciones, se crearon gráficos de intensidad en 3D del anillo Z. Los gráficos de intensidad muestran que la cantidad de fluorescencia puede variar hasta cuatro veces en diferentes regiones del anillo Z más sutil del bacilo.

Los gráficos de intensidad 3D muestran que los espacios casi leen los niveles de referencia de fluorescencia de fondo para analizar los cambios dinámicos que ocurren dentro del anillo Z. Con el tiempo, se realiza un lapso de tiempo de simulación en 3D. Esta película muestra cómo la FTSZ dentro del bacilo sutil del anillo Z está en constante cambio y se mide con un gráfico de intensidad que se genera para cada imagen.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar y preparar células bacterianas, cómo obtener imágenes con 3D Sim, cómo analizarlas para obtener datos cuantitativos y, finalmente, cómo proporcionar imágenes de calidad de presentación. Es muy importante durante la adquisición de imágenes monitorear la salud de sus células y también monitorear el nivel de expresión de la proteína fluorescente durante la adquisición después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que otras personas en el campo de la biología celular bacteriana utilizaran otros métodos de microscopía de súper resolución y localizaran otras proteínas bacterianas en diferentes organismos.

Siguiendo este procedimiento, se podrían realizar otras formas de microscopía de súper resolución, como la microscopía de localización fotoactivada para observar los cambios dinámicos en dicha proteína FDS a lo largo del tiempo.