Name: Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Aprende a visualizar la dinámica de la proteína FtsZ durante la división celular bacteriana utilizando microscopía de iluminación estructurada 3D rápida (f3D-SIM). Esta técnica de superresolución revela la estructura tridimensional del anillo Z en Bacillus subtilis.

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Los autores agradecen a P. Levin, S. Moriya, S. Foster y M. Pinho por el regalo de cepas y anticuerpos. También agradecen a L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper y B. Dougherty por su asistencia técnica experta. CBW cuenta con el apoyo de una beca de investigación (571905) del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia. LT contó con el apoyo de una beca postdoctoral de UTS Chancellors. MPS y ATFL contaron con el apoyo de los Premios Australianos de Posgrado. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Proyecto de Descubrimiento del Consejo de Investigación Australiano (DP120102010) a EJH.

1. Preparación de muestras <ol><li> Preparación de B. Las células subtilis for Imaging <ol><li> Inocular 10 ml de Caldo Penassay (PAB, también conocido como Medio Antibiótico 3) con una sola colonia de B. subtilis SU570 cepa (168 trpC2 FtsZ :: FtsZ-GFP-spec) 16. Crecer durante la noche en una velocidad baja (100 rpm) agitador a 30 ° C. </li><li> Diluir el cultivo durante la noche a 0,05 A 600 (absorbancia medida a 600 nm) en PAB fresca a 30 ° C con alta velocidad (215 rpm) agitando y crecer hasta la fase exponencial media (A 600 ~ 0,4). </li><li> Añadir 2 g de agarosa de electroforesis grado en 100 ml 1x medio de crecimiento (PAB) en una botella de vidrio con tapón de rosca. Disolver la agarosa mediante tratamiento en autoclave. Esto se puede almacenar a 4 ° C durante unos pocos meses, y calentados para fundir la agarosa cuando sea necesario. Deje reposar a temperatura ambiente. </li><li> Fije un marco de adhesivo (65 l de capacidad, véase la Tabla de Materiales) a un gla estándarss portaobjetos de microscopio. Para ello, retire la hoja delgada de poliéster (cada marco de adhesivo se coloca entre dos láminas de poliéster, uno fino y uno grueso, y tiene el centro eliminado cuadrado) y aplicar la superficie adhesiva expuesta de la trama a la superficie del portaobjetos de microscopio. Esto crea efectivamente un pozo cuadrado en la parte superior de la corredera. Dejar la lámina de poliéster de espesor unida al bastidor ya que esto evitará que el cubreobjetos se pegue a la misma en pasos posteriores. </li><li> Derretir la solución de agarosa en el microondas hasta que hierva y pipeta de 67 l en el marco de adhesivo. Inmediatamente colocar un cubreobjetos en la parte superior para crear una superficie plana y dejar a temperatura ambiente durante 5-10 min. Retire el cubreobjetos durante 1-2 minutos mientras que la muestra se cosecha. </li><li> Cosecha de una alícuota de 1 ml de la muestra y se centrifuga a 5900 xg durante 30 seg. Decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200 l fresco PAB. </li><li> Tomar 2,5 l de la muestra concentrada y una pipeta en un pre-prepacojín de agarosa rojo. Extender la muestra uniformemente a lo largo de la superficie plana de la almohadilla de agarosa. Retire el marco de adhesivo del portaobjetos usando pinzas sin tocar la almohadilla de agarosa. </li><li> Transferir el pad de agarosa del portaobjetos de microscopio a una placa de 35 mm de diámetro Petri con fondo cubreobjetos de vidrio. Invertir la almohadilla de agarosa de manera que la suspensión de células y el cubreobjetos de la placa de Petri están en contacto directo uno con otro. La parte inferior de la placa de Petri tiene un índice de refracción de 1,525 para imágenes de alta resolución. </li></ol></li><li> Preparación de S. vivo Las células aureus for Imaging <ol><li> Inocular 10 ml de caldo L con una sola colonia de S. aureus cepa SA94 (SH1000 contiene arado-FtsZ-GFP y pGL485; Ehh r, r Cm) 25. Crecer durante la noche en una velocidad baja (100 rpm) agitador rotatorio a 37 ° C. </li><li> Diluir el cultivo durante la noche a 0,05 A 600 (absorbancia medida a 600 nm) en caldo L fresco con 0,05 mM de IPTG (isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido) para inducir la producción de la proteína de fusión. </li><li> Se incuba a 37 ° C con alta velocidad (215 rpm) a temblar y crecer hasta mediados exponencial fase (A 600 ~ 0,4). </li><li> Siga los pasos 1.1.3 - 1.1.8 se ha descrito para B. preparación de células vivas subtilis. Nota: Añadir la concentración apropiada de inductor a la solución de agarosa en el paso 1.1.3 para las cepas que expresan una proteína de fusión fluorescente bajo control inducible. </li></ol></li></ol> 2 Preparación del Microscopio Este método utiliza un sistema de imágenes 3D-SIM DeltaVision OMX (microscopio óptico, eXperimental) equipado con un módulo de Blaze. Para los experimentos descritos, se utilizan sólo un láser y una cámara. La iluminación y la trayectoria de la luz se describen en la Figura 1. Este método asume que el microscopio tiene una calibración adecuada, la función de transferencia óptica (OTF)archivos y la luz de mantenimiento colimación realizan. <ol><li> Para los experimentos de imágenes de células vivas, asegúrese de que la etapa de calentamiento se fija a la fase cerámica y el collar objetivo de calentar se une al objetivo (60X 1,42 objetivo aceite NA). </li><li> Encienda los objetivos y etapas calentadores por lo menos 4 horas antes de la proyección de imagen y poco a poco la temperatura de la rampa hasta el nivel deseado a una velocidad máxima de 5 ° C / hr. Se recomienda iniciar este proceso la noche antes de la proyección de imagen y la rampa a 3 ° C / 4 hr. Para los experimentos de células vivas con B. subtilis, la mayoría de los experimentos se llevan a cabo a 30 ° C. Para S. aureus, todos los experimentos se llevan a cabo a 37 ° C. </li><li> En el día del experimento, encienda el sistema por lo menos 1 hora antes de la formación de imágenes para permitir que el sistema y láseres para estabilizar plenamente. Cargue el pequeño inserto etapa plato al escenario calienta a precalentar. <ol><li> Encienda la estación de trabajo del controlador maestro. </li><li> Encienda el workstat procesamiento de imágenesde iones. </li><li> Encienda el enfriador de cámara situada en el suelo fuera del recinto microscopio. </li><li> A su vez en todas las cámaras sCMOS (a pesar de que no van a ser usados). </li><li> Dentro del recinto del láser y la electrónica, pone en marcha: <ol><li> Chasis del controlador del instrumento. </li><li> Chasis Nanomotion. </li><li> Controlador de Jena para Z piezo. </li><li> Todos los controladores de motor 4 galvo. </li><li> Módulo de control de láser primaria. </li><li> Módulo de control de láser secundaria. </li><li> Todas las estaciones de trabajo de la cámara. </li><li> Estación de trabajo OMXIC. </li></ol></li><li> En la estación de trabajo del controlador maestro, abra el software OMX haciendo clic en el icono. Establezca la ruta de archivo para guardar los datos en una carpeta de datos apropiada. </li><li> Para inicializar el hardware, vaya al menú Herramientas, seleccione Hardware y haga clic en el botón Reiniciar Hardware. Cerrar ventana. </li><li> Iniciar el SoftWorx software.Turn en los láseres requeridos para los experimentos (488 nm). </li><li> Encienda el interruptor de la llave para el bloqueo de seguridad láser. </li><li> Asegúrese de insertar el cajón del filtro dicroico correcta por debajo del objetivo. Para GFP, que es el estándar (o fijo) cajón. </li><li> En OMX SF, vaya al menú Archivo, seleccione Configuración y seleccione el cajón fijo en el menú desplegable de cajón. Cerrar ventana. </li><li> Haga lo siguiente en la pantalla principal del software, en la sección Parámetros de luz: <ol><li> Active la cámara adecuada para el láser de excitación y un filtro de emisión (FITC) de la cámara de la selección de canal. </li><li> Compruebe el modo de imagen está configurado en secuencial. </li><li> Compruebe la ruta de luz se ajusta SI. </li><li> Compruebe el modo se ajusta a 95 MHz. </li><li> Compruebe se selecciona el láser 488 en excitación. </li><li> Establezca el <strong&gt; Tamaño de 512 x 512 para el tamaño de la ventana y la Agrupación de 1 x 1. </li></ol></li><li> En la pestaña Experiment, asegúrese de Tipo se establece en SI en el menú desplegable. </li><li> Asegúrese de seccionamiento se activa y que la sección de separación óptica se establece en 0.125. </li><li> Asegúrese de Punto de enfoque cuando comenzar el análisis es medio. </li></ol></li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Aplicar una gota de aceite a la parte superior del objetivo. Por 37 ° C, el aceite inicial recomendada tiene un índice de refracción de 1,518 a adaptarse mejor a la del índice de refracción de la almohadilla de gel utilizado para montar las células bacterianas a 37 ° C (consulte el paso 1.1.3). </li><li> Coloque la placa de Petri muestra que contiene las células preparadas en el recuadro escenario y cubrir con la tapa de calefacción circular. Baje la etapa hasta que el aceite toque el fondo della placa de Petri muestra. </li><li> Dejar que la cápsula para calentar-equilibre durante 15 min en la etapa. El uso de un bajo valor Exposición de 5 ms o menos (que se encuentra en la sección Parámetros de luz), se centran en la muestra utilizando los controles de la etapa de posicionamiento nano (DZ, ubicado en la sección Nano posicionamiento). Enfoque hacia arriba y abajo a través de la muestra para determinar si la luz se distribuye uniformemente por encima y por debajo del plano focal de la muestra. Si la función de dispersión de punto es ni siquiera (aberración esférica), limpiar el fondo del plato de la muestra y el objetivo con cloroformo. Cambiar el aceite y repetir este paso hasta que se encuentra una coincidencia adecuada entre el índice de refracción del aceite y de la muestra para minimizar la aberración esférica. </li><li> El uso de 0,5 micras tamaños de paso dZ, marcar la parte superior e inferior de la pila de imágenes. Volver a la mitad de la muestra. Haga clic en el botón Grosor Entra en la pestaña Experimente para establecer el grosor de obtención de muestras. Keep la altura de la chimenea a un mínimo mientras que teniendo cuidado de no cortar la parte superior e inferior de los Z-anillos. Los espesores típicos para B. muestras subtilis son 2-3 micras. </li><li> Determinar el valor de intensidad máxima (Max) de la imagen de la muestra con los ajustes de exposición y% T actuales. Este valor se encuentra por debajo de la ventana de la imagen. Para time-lapse, ajustar la exposición y el% T para obtener una intensidad máxima de 1.100-1.400 fondo por encima de la imagen. Se necesita un mínimo de intensidad de fondo 1000 anteriormente para obtener reconstrucción de la imagen. Para una imagen de una sola vez, aumentar la intensidad máxima a 4.000-5.000. </li><li> Active la sección Time-lapse en la pestaña Experimento. Ajuste la velocidad de fotogramas requerido y el tiempo total. En los datos de archivo, escriba un nombre de archivo adecuado. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar la adquisición de la imagen. Nota: La adquisición de imágenes se completa cuando el gbar reen Progreso está terminado y un archivo de registro aparece en el conjunto de datos en la carpeta de datos apropiado. </li></ol> 4. Comprobación de la calidad de datos <ol><li> Al comienzo de la adquisición de la imagen, tenga en cuenta el valor máximo de intensidad de la imagen en el comienzo de la adquisición de la imagen para el primer fotograma de la serie temporal. Al final de la adquisición de la primera trama, compruebe que no ha sido más que una disminución del 10% en la intensidad de la señal a través de la pila Z para este primer marco. Si ha habido más de este nivel de photobleaching en el primer punto de tiempo, los datos a través de la serie de tiempo serán de calidad insuficiente para el análisis y la adquisición de series de tiempo se pueden detener. </li><li> Al final de la adquisición de las series de tiempo, abra el archivo de imagen en bruto resultante con .dv sufijo y determinar la disminución de la intensidad de señal máxima desde el inicio de la serie de tiempo a la imagen final. Deseche todos los puntos de tiempo donde no tiene abejan más de 30% fotoblanqueo. </li></ol> 5. imágenes Reconstructora 3D-SIM <ol><li> En el menú Proceso, activar la ventana SI Reconstrucción. Utilice la configuración de pre-existentes para todos los parámetros. </li><li> Active el botón OTF Uso específico de canal, y seleccione el conjunto de filtros estándar. Activar el uso específico de canal botón KO ángulos y establecida en el conjunto de filtro estándar. </li><li> Arrastre y suelte el (.dv) archivo RAW en el espacio de archivos de entrada. Haga clic en Adelante. El archivo de salida tendrá el mismo nombre que el archivo de entrada con _SI añade al final. Nota: Este proceso de reconstrucción se puede ejecutar como una tarea utilizando la función Generador de tareas desde el menú Proceso, si hay varios archivos a procesar. </li></ol> 6. Exportar datos y análisis <ol><li> Utilice Imaris para visualizar imágenes en 3D en el modo y ex superardatos de imagen del puerto como tiff (300 dpi) o archivos avi (sin compresión). Mediciones de tamaño en Imaris se pueden realizar utilizando la herramienta de mediciones en el modo de superar. </li><li> La generación de parcelas de intensidad en 3D del anillo Z de los datos de imágenes en 3D-SIM: <ol><li> Examinar la distribución de FtsZ alrededor del anillo y Z para crear parcelas de intensidad 3D <ol><li> Abra un archivo de imagen en 3D para ver las z cortes individuales. Utilice la herramienta de visor de volumen situado en la pestaña Vista menú para recortar una región de interés. </li><li> Introduzca el número de la ventana de esta imagen 3D en la ventana de entrada e introduzca un nuevo y sin número de la ventana en la ventana de salida. El botón de selección de región estará disponible para recortar un anillo Z individual de interés desde el 40 × 40 m campo de vista original. </li><li> Ajustar el eje deseado y el grado de rotación en la pestaña de rotación. Haga clic en el botón Iniciar. Desplácese por el volumen para obtener la perspectiva deseada del anillo Z. </li><li> Utilice la herramienta de inspector de datos y ajuste tque las dimensiones de columna / fila para crear una nueva región de interés en torno a un anillo Z individual. Haga clic en el centro de la imagen para colocar esta nueva región de interés. Los datos de imagen de texto es una tabla generada automáticamente que muestra la intensidad de fluorescencia de cada píxel dentro de la región de interés. </li><li> Haga clic en el botón gráfico 3D para ver inicialmente la trama intensidad. </li><li> Alternativamente, los datos de la imagen de texto se pueden exportar haciendo clic en el botón de guardar datos de la tabla en el menú archivo. </li><li> Copie los datos de la imagen desde el archivo de texto guardado en una nueva hoja de cálculo. Seleccione todas las celdas dentro de la hoja de cálculo y cree un nuevo gráfico en 3D de superficie. Dar formato al gráfico de la intensidad solar en 3D para su publicación. </li></ol></li><li> Para la repetición de datos time-lapse pasos 6.2.1.1 - 6.2.1.7 en cada uno de los diferentes puntos de tiempo desde el archivo de imagen en 3D. </li></ol></li><li> Seguimiento de Intensidad Media fluorescencia con el tiempo <ol><li> Utilice los datos de la imagen de texto para realizar un seguimiento de los fluorescence intensidad con el tiempo en una región de interés. </li><li> Seleccione las celdas que corresponden a la región de interés. </li><li> Calcular la intensidad media de fluorescencia en cada punto de tiempo para esta región de interés. </li><li> Usar los valores medios de intensidad de fluorescencia para generar un gráfico de línea separado. </li></ol></li></ol>

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Esta publicación está patrocinada por GE Healthcare.

Imágenes de células vivas fluorescente es una poderosa herramienta que permite la observación de los cambios dinámicos dentro de las células a través del tiempo. Formación de imágenes en vivo de la biología de la célula bacteriana ha sido difícil debido al tamaño de células pequeñas y la capacidad de las células bacterianas para resistir la exposición repetida a la luz de excitación reducida. F3D-SIM ha ampliado las herramientas disponibles para interrogar a toda la biología celular, pero es necesario realizar cuidadosamente esta técnica como artefactos se pueden introducir si se aplican mal. Hay un número de consideraciones importantes para el uso exitoso de esta técnica. Como se trata de un método de imagen de fluorescencia de campo amplio que se basa en el uso de la función de dispersión de la luz de la emitida, desajuste del índice de refracción y la aberración esférica de la luz emitida deberá evitarse para permitir la reconstrucción precisa de la imagen. El uso de cubreobjetos de 0,17 mm de espesor de una alta calidad para evitar la variación de la intensidad de la señal debido a la variabilidad en el espesor de vidrio de las cubiertasSe recomienda encarecidamente el labio. Es sumamente importante evaluar cuidadosamente la aberración esférica de la luz emitida durante las etapas iniciales de todos los experimentos y ajustar el índice de refracción del aceite de inmersión, según sea necesario. Esto puede variar de día a día, ya que depende tanto de la temperatura y el montaje de los medios de comunicación / sustrato de la muestra. El uso del aceite incorrecto resultará en la reconstrucción inferior de las imágenes con artefactos tales como halos y señales de eco. Al final del proceso de reconstrucción de la imagen, para cada fase de una medida de la calidad de la reconstrucción se puede conseguir por la &quot;mejor ajuste para el ángulo de KO&quot; para cada fase / ángulo de la iluminación. Si este valor está por debajo de 1 para cada ángulo, entonces la calidad de la reconstruida será probablemente alta. Si este valor está por encima de 6, lo más probable es que la imagen reconstruida contendrá artefactos. Artefactos comunes incluyen i) la aparición de rayas en la imagen que correspondea uno de los ángulos de la cuadrícula. Esto puede resultar de la señal más baja de ese ángulo de la parrilla; ii) formación de halos alrededor de las estructuras. Esto puede ser el resultado de niveles muy desiguales de señal desde estructuras brillantes en comparación con las estructuras circundantes, un desajuste del índice de refracción del aceite y la muestra o puede ser debido a las estructuras en la imagen que se está demasiado amorfo y que no contiene suficiente &quot;estructura&quot; para ser reconocido por el algoritmo; iii) &quot;panal de abeja&quot;, que resulta de una baja relación señal ruido en la imagen, por lo general debido a la alta señal de fondo; iv) las estructuras que se estiran / alargadas en xy que pueden ser debidas a falta de coincidencia de índice de refracción del aceite y de la muestra. Este artefacto es difícil discernir por un usuario inexperto. Se recomienda que los nuevos usuarios consulten a un investigador experimentado SIM para el asesoramiento en la interpretación y análisis de imágenes cuando se empieza a utilizar esta técnica. Al igual que con todos los experimentos de imagen en vivo de células fluorescentes, es de importaciónANT para equilibrar cuidadosamente la entrada de energía de excitación con el fin de minimizar el grado de photobleaching y fototoxicidad de las células con suficiente señal de emisión necesaria para reconstruir imágenes con artefacto mínimo. Photobleaching excesiva (mayor de 30% a través de una sola adquisición z-stack) dará lugar a un patrón de creación de bandas en la imagen reconstruida. Con el uso de cámaras sCMOS, imágenes super-resolución puede ser reconstruido con éxito a partir de imágenes en bruto con la señal de emisión tan bajo como 1.000 conteos por encima del fondo. Esto puede permitir que para tiempos de exposición muy cortos reduciendo de este modo photobleaching y que permite la captura rápida para cada trama. También aumenta la cantidad de tiempo entre tramas para que las células se recuperan de la entrada de energía de excitación. Además, como el tiempo de captura para cada marco individual puede ser muy corto, el grado de artefacto introducido por &quot;desenfoque de movimiento &#39;durante una captura individuo se reduce con el uso de este método. Esta Variación de 3D-SIM ofrece una serie de ventajas sobre otras tecnologías disponibles supermercados y de imagen de alta resolución de imágenes en vivo de los biólogos celulares bacterianas. El aumento de 2 veces en la resolución en las 3 dimensiones y la capacidad de imagen de hasta 30 micras en una muestra permite obtener imágenes de las células bacterianas (y de mamíferos) enteros durante un experimento. Técnicas como la de una sola molécula de localización que se realizan habitualmente en la onda evanescente no pueden alcanzar la profundidad de penetración en una muestra y no ofrecen información sobre las células enteras. Los últimos avances que permiten mayores profundidades de muestreo para esta técnica puede resultar en una mejor resolución axial de células enteras. Además, las técnicas de localización de una sola molécula que requieren miles de imágenes en bruto para ser adquiridos también están limitados en la velocidad de fotogramas que se pueden capturar y puede requerir compromiso entre velocidad de fotogramas de captura y la última resolución espacial alcanzada, como la resolución espacial depende de la número de vísperants grabadas dentro de un espacio definido. Disminuir el número de fotogramas capturados se traducirá en una resolución espacial inferior, pero puede ser suficiente para lograr la resolución temporal requerida para el proceso biológico de interés. La cantidad de tiempo de recuperación entre los marcos también puede ser necesario un aumento de minimizar fototoxicidad en células vivas, limitando así la duración y la frecuencia con la que se puede obtener de series de tiempo. Técnicas de alta resolución como la microscopía electrónica (EM) o electrones cryotomography (ECT) ofrecen gran resolución en 3D-SIM (y otras técnicas de microscopía óptica super-resolución), pero se deben realizar en muestras fijadas. La fijación y el procesamiento pueden introducir artefactos y la falta de etiquetado pueden dificultar la interpretación. -Label libre de ECT tiene un contraste pobre y pueden alcanzar profundidades de penetración de la muestra de alrededor de 500-200 nm 24, por lo que incluso si la proteína de interés puede ser identificado, la estructura de la proteína en una célula bacteriano entero no puede ser observada.Incluso cuando el etiquetado puede ser utilizado en EM, tal como con inmunomarcaje, la imagen sólo se realiza en 2D. 3D es sólo alcanzable con seccionamiento fino y reconstrucción computacional de las secciones. El seccionamiento delgada requiere un técnico con experiencia, pero puede ser problemático y provocar artefacto. Con células vivas o fijas, 3D-SIM no necesita ser incrustado en una manera específica y las células se pueden preparar rápidamente para formación de imágenes en un estado nativo cercano. Este método es relativamente fácil de implementar por los investigadores con un mínimo de experiencia en microscopía de fluorescencia. Los experimentos se pueden realizar en los medios de comunicación que apoyan la función saludable de las células, siempre que no se muestra fluorescente o generar la señal de fondo excesiva. Para las células bacterianas, esto puede permitir el uso de muchos tipos de complejos y medios mínimos o el uso de medios sólidos o semi-sólidos para controlar la motilidad celular bacteriana. Muchos biólogos que ya han ingeniería proteína fluorescente (FP) fusiones y probado la funcionalidad deestas fusiones pueden ocupar esta tecnología rápidamente sin más ingeniería y validación con nuevas fusiones FP fotoactivables. Nos encontramos, como observación general, que S. aureus fue más susceptible a fotoblanqueo cuando se toman imágenes con fusiones de PF que B. subtilis. Utilizando nuestros métodos 3D-SIM original, en el que el patrón de cuadrícula se generó por una rejilla física, no fue posible realizar imágenes de células vivas con un número de S. fusiones aureus FP. Sin embargo, con este método F3D-SIM avanzado, hemos sido capaces de imagen estas fusiones FP y realizada de series de tiempo corto para capturar la dinámica de estas proteínas etiquetadas. Esto es más probablemente debido a los tiempos de exposición necesarios para la reducción de formación de imágenes y el aumento de tiempo entre tramas para la recuperación celular. OMX Blaze 3D-SIM es una tecnología disponible en el mercado que puede ser relativamente fácil de implementar en un solo laboratorio o un centro de formación de imágenes del núcleo. Se debe tener cuidado para realizar la técnica para evitar artihechos debido a la mala preparación de la muestra o pobre de captura de imagen. Una vez que la técnica se domina, estudios de la estructura y la dinámica de la proteína en pequeños organismos tales como bacterias se pueden realizar en la fluorescencia simple o multi-color.

Un número de diferentes tecnologías de imagen se han utilizado durante años para estudiar bacterias incluyendo varios electrónica y técnicas de microscopía óptica. Mientras microscopía electrónica ofrece una resolución extremadamente alta, hasta el nanómetro, la necesidad de un vacío y el uso de agentes de contraste ha limitado esta técnica para las muestras fijadas y embebidas. Los artefactos también pueden ser introducidos por una larga preparación de la muestra y se necesita un experto en la técnica para preparar las muestras, y para analizar e interpretar las imágenes resultantes. Microscopía óptica ofrece los beneficios de la simple preparación de la muestra y la aplicación de múltiples etiquetas con relativa facilidad en comparación con la microscopía electrónica. El uso de proteínas fluorescentes y conjugados de tinte, la posibilidad de estudiar las células vivas con un microscopio de fluorescencia también es posible. Con las mejoras en la estabilidad fluoróforo y proteína fluorescente tamaño / estructura que reduzca la toxicidad celular, así como los avances en la cámara de detección de tecnlogía, la microscopía de fluorescencia utilizando sistemas de imagen confocal de gran campo y se ha ampliado significativamente nuestra comprensión de la dinámica espacial de las células. Utilizando estas técnicas, nuestro conocimiento de la célula bacteriana en los últimos 20 años ha progresado en gran medida a una visión mucho más detallada que revela un alto nivel de organización estructural y de la proteína dentro de la célula bacteriana 1. Sin embargo, los métodos convencionales de microscopía óptica son de difracción limitada, lo que significa que la resolución inherente es aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz de excitación utilizado. Por consiguiente, incluso con el sistema de microscopía óptica convencional más óptima, la mejor resolución lateral es de aproximadamente 220-250 nm y la resolución axial es de aproximadamente 500 nm (para una revisión ver Schermelleh et al. 2). Para los biólogos de células bacterianas en particular, esto todavía limita seriamente nuestra comprensión de la organización espacial de estas células diminutas; siendo sólo 1-2 micras de diámetroeter y 1-10 micras de longitud. También existe la necesidad de técnicas de mayor resolución que se pueden realizar en las células vivas donde el comportamiento espacial dinámica de una proteína puede ser analizada para complementar los datos in vitro. Durante la última década, se han desarrollado varias técnicas de imagen de fluorescencia super-resolución. Super-resolución microscopía describe técnicas de imagen que por lo menos el doble de la resolución lateral se puede obtener con microscopía de luz convencional, superando así la barrera de difracción. Estas técnicas de manipular la iluminación y / o el análisis de la luz emitida para crear aumentos reales en la resolución aparente. Actualmente hay tres tipos principales de técnicas de super-resolución - i) estimuló la microscopía agotamiento de emisión 3 (STED); ii) la microscopía de una sola molécula de localización, incluyendo técnicas como la microscopía de localización fotoactivación 4,5 (PALMA), microscopía óptica reconstrucción estocástico <sarriba&gt; 6 (STORM), STORM directa 7 (dSTORM), y el agotamiento del suelo estatal con molécula individual de retorno 8 (GDSIM); y iii) microscopía de iluminación estructurada 9-12 (SIM). Técnicas de localización de una sola molécula ofrecen los mayores incrementos en la resolución lateral, frente a entre 10 a 40 nm en muestras biológicas. En muchas implementaciones de microscopía de localización de moléculas individuales, la profundidad de muestreo se limita a la onda evanescente y las implementaciones iniciales de STED también estaban limitados en la profundidad de muestreo. Mejoras Sin embargo, los avances recientes, como el uso de óptica adaptativa, la explotación del astigmatismo en la función de dispersión en diferentes puntos focales, detección multi-plano y el uso de dos objetivos para inferir la posición axial de la luz emitida se han visto tanto en el axial resolución y muestreo profundidades en tanto molécula STED y única localización 13,14. Tasas de adquisición de datos para STED y técnicas de localización de una sola moléculaTambién son relativamente lento debido a la gran cantidad de imágenes que necesitan ser adquiridos para la resolución máxima (hasta 50.000 para las técnicas de localización). Esta adquisición de datos es lenta no se presta a la obtención de imágenes de muestras vivas sin modificaciones personalizadas que son a menudo bastante caros. Estas dos técnicas son actualmente óptimamente adecuados para muestras fijas (para revisión ver 2,15), sin embargo, mucho se está trabajando para hacer frente a esta limitación. Tres dimensiones de la microscopía de iluminación estructurada (3D-SIM) es una técnica de campo amplio que mejora tanto la resolución lateral y axial resultante en las resoluciones de aproximadamente 110 y 280 nm, respectivamente. Profundidad de muestreo es de hasta 30 m desde el cubreobjetos, lo que permite formación de imágenes de células enteras. La variación de 3D-SIM desarrollado por Sedat, Agard, y en el Gustaffsson (OMX) Microscopio óptico plataforma eXperimental implican la iluminación de la muestra con un patrón de rejilla conocido que se mueve en 15 diferentesposiciones en cada plano z 11.9. Las franjas en los patrones de moiré resultantes que se crean en el espacio de frecuencia fuera de la región observable se miden. La información del espacio de frecuencia es computacionalmente reconstruido para generar una imagen visible de super-resolución 10,11. La velocidad relativa a la que las imágenes en bruto pueden ser adquiridos mediante esta técnica permite obtener imágenes de células vivas. Sin embargo, es importante señalar que para los procesos biológicos que se producen en una escala de tiempo de segundos, la tasa de adquisición de las imágenes en bruto es todavía demasiado lenta para capturar cambios dinámicos. Para series de tiempo con una velocidad de captura de segundos, la adquisición repetida sin suficiente tiempo de recuperación puede conducir a la fototoxicidad y fotoblanqueo, especialmente cuando se toman imágenes en directo de pequeñas células bacterianas. Para superar estos problemas, se han desarrollado los recientes avances para una rápida 3D-SIM (SIM-F3D). Aquí describimos una conocida como OMX Blaze 16 que era introduced a finales de 2011 Esta tecnología crea la iluminación modelado sin el uso de una rejilla física como se utiliza en los sistemas anteriores. El uso de haces de luz de interferencia y la nueva tecnología de obturación permite la creación de la luz modelada sobre la muestra de una manera muy rápida. La velocidad de adquisición de la imagen se mejora aún más con la introducción de científica semiconductor de óxido metálico complementario (sCMOS) cámaras, especialmente en comparación con las cámaras EMCCD existentes. Estos cambios dieron lugar a una posible tasa de adquisición de la imagen de un fotograma por segundo para una profundidad de muestreo de 1 m (512 x 512 píxeles, 9 z rebanadas), lo que permite el seguimiento de los cambios dinámicos dentro de las células que se producen dentro de 16 segundos. La disminución en la exposición (excitación) veces aparentes para vivir células utilizando este método permite que cualquiera de la serie de tiempo prolongado para ser capturado o un aumento en la tasa de captura. Aquí se describe la aplicación de la microscopía F3D-SIM para examine la estructura y el movimiento dinámico del anillo cytokinetic Z en las células de dos especies bacterianas: los organismo modelo de Bacillus subtilis en forma de varilla y el patógeno humano cocoides Staphylococcus aureus. FtsZ es una proteína del citoesqueleto-tubulina como que juega un papel clave en la división celular en bacterias 17,18. Se localiza en el sitio de división para reclutar al menos otras 20 proteínas de división, que forman el aparato de división de 17,18, y se cree que para proporcionar la fuerza de constricción de células 19-23. Este método revela que FtsZ se distribuye heterogéneamente alrededor del anillo Z en ambos organismos en una disposición de cordón; la solución del problema de larga data de si el anillo Z es un cinturón continuo y uniforme alrededor de la célula, como se visualizó por microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional, o una estructura discontinua según lo sugerido por crio-tomografía de electrones (TEC) 24. Mostramos cómo la capacidad de 3D-SIM puede mejorar enormemente el examen espacial de pequeña (1diámetro m) células redondas como S. aureus que dividen en tres planos perpendiculares consecutivos (x, y, z). Estudios con lapso de tiempo utilizando estas técnicas muestran que la estructura del anillo Z es dinámica, con cambios brutos organización dentro del anillo, en lugar de moléculas de FtsZ en movimiento dentro y fuera de un andamio fijo 24.

<table><tbody><tr><td>Agarosa I (grado de biotecnología)</td><td>AMRESCO</td><td>0710-500G</td><td>Se utiliza para la construcción de almohadillas de agarosa al 2%. Use el microondas para disolver la agarosa en el medio de crecimiento.</td></tr><tr><td>N-(3-trietilaminopropil)-4-(6-(4-(dietilamino) fenil) hexatrienil) dibromuro de piridinio (FM 4-64)</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>Colorante lipofílico utilizado para teñir membranas celulares.</td></tr><tr><td>Microtubo de 1,5 ml, graduado de Natural</td><td>Scientific Specialties Inc.</td><td>1210-00</td><td>Hecho de polipropileno homopolímero, utilizado para recolectar células bacterianas antes de ser colocadas en almohadillas de agarosa para su visualización.</td></tr><tr><td>Base de caldo Luria, Miller</td><td>BD</td><td>241420</td><td>Preparado según las instrucciones del fabricante. Agregue un 2% de agarosa después de esterilizar en autoclave.</td></tr><tr><td>BBL Caldo de ensayo antibiótico, medio antibiótico 3</td><td>BD</td><td>210932</td><td>Preparado según las instrucciones del fabricante.</td></tr><tr><td>Marco adhesivo</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ABGAB-0577</td><td>Conocido como Gene Frame con esta empresa. Se utiliza para preparar almohadillas de agarosa al 2% (Dimensiones: 15 x 16 mm).</td></tr><tr><td>Cubreobjetos para microscopio</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>111512-9</td><td>22 x 22 Nº 1 Espesor</td></tr><tr><td>35 mm de diámetro Placa de Petri con cubierta de vidrioFondo deslizante</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td>Conocido como FluoroDish con esta empresa. Plato: &Oslash; 35 mm, Vidrio: &Oslash; 23 mm, Espesor del vidrio: 0,17 mm,</td></tr><tr><td>cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G</td> no pirogénico <td>Hacer un caldo de 10 mg/ml en etanol al 95%.</td></tr><tr><td>Clorhidrato de lincomicina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L6004-5MU</td><td>Hacer un caldo de 25 mg/ml en etanol al 50%.</td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Boehringer Mannheim GmbH</td><td>12390120-14</td><td>Haga un caldo de 10 mg/ml en etanol al 95%.</td></tr><tr><td>Baño de agua de agitación orbital/lineal</td><td>combinado Grant scientific Instruments</td><td>OLS-200 Velocidad de</td><td>agitación utilizada para cultivos: 215 rpm</td></tr> El <tr><td>espectrofotómetro visible UV</td><td>Shimadzu</td><td>UV-1601</td> se <td>utilizó una longitud de onda de 600 nm para medir la densidad óptica de cultivos bacterianos.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>Los pellets de cultivo bacteriano se obtuvieron girando cultivos de crecimiento exponencial medio a 8.000 rpm durante 30 segundos.</td></tr><tr><td>Isopropilo &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td>Prepare 1 M de caldo y filtre la esterilización antes de usar.</td></tr><tr><td>software softWoRx</td><td>Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td><td>versión 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de datos Imaris</td><td>Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td><td>versión 7.0.0</td><td>Matlab XTensions incluido</td></tr><tr><td>Sistema de imagen DeltaVision OMX 3D-SIM equipado con un módulo Blaze.</td>Módulo Blaze de <td>GE Healthcare Company</td><td></td> instalado en el microscopio de fluorescencia <td>vertical OMX V3</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss Axioplan 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

super-resolución de imagen del anillo z cytokinetic en bacterias vivas utilizando 3d-estructurado fast iluminación microscopía (f3d-sim)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Obtención de imágenes de muestras biológicas utilizando microscopía de fluorescencia ha avanzado sustancialmente con las nuevas tecnologías para superar la barrera de resolución de la difracción de la luz permitiendo de super-resolución de muestras vivas. Actualmente hay tres tipos principales de técnicas de super-resolución - agotamiento emisión estimulada (STED), microscopía de localización de una sola molécula (incluyendo técnicas como la palma, TORMENTA, y GDSIM), y microscopía iluminación estructurada (SIM). Si bien las técnicas de localización STED y única molécula muestran los mayores incrementos en la resolución, que han sido más lentos para ofrecer mayores velocidades de adquisición de imágenes. SIM tridimensional (3D-SIM) es una técnica de microscopía de fluorescencia de campo amplio que ofrece una serie de ventajas con respecto a la localización tanto de una sola molécula y STED. Resolución se mejora, con las resoluciones típicas laterales y axiales de 110 y 280 nm, respectivamente y la profundidad de muestreo de hasta 30 m desde el cubreobjetos, lo que permiteobtención de imágenes de células enteras. Los avances recientes (rápida 3D-SIM) en la tecnología de aumento de la tasa de captura de imágenes en bruto permite la captura rápida de los procesos biológicos que ocurren en cuestión de segundos, al tiempo que reduce significativamente la foto-toxicidad y fotoblanqueo. Aquí se describe el uso de uno de tales métodos a la imagen las células bacterianas que albergan la proteína marcada con fluorescencia cytokinetic-FtsZ para mostrar cómo se analizan las células y el tipo de información única que esta técnica puede proporcionar.

En este estudio se visualizó la proteína de división celular bacteriana FtsZ, expresado en células vivas como una fusión-FtsZ GFP, para ilustrar las poderosas ventajas de F3D-SIM en microscopía de fluorescencia convencional para el estudio de la localización de proteínas bacteriana y la dinámica. FtsZ es una proteína del citoesqueleto-tubulina como que polimeriza en una estructura de anillo dinámico alrededor de la circunferencia de la célula. El anillo Z tiene una función importante en la división celular: su montaje marca la futura sede de la división, que recluta a todas las proteínas de la división celular a este sitio, y la constricción de anillo Z parece proporcionar la fuerza para permitir el movimiento hacia dentro de la envoltura celular durante la citocinesis 17 , 18. Cuando se visualizó por microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional, el anillo Z aparece como una sola banda transversal de la fluorescencia en las bacterias en forma de barra, incluyendo los organismos más bien estudiadas, tales como B. subtilis (Figura 2A), &lt;em&gt; E. coli y C. Crescentus. Es importante destacar que la intensidad de fluorescencia a lo largo de esta banda parece ser más o menos uniforme, y el patrón de localización ofrece muy poca información sobre la organización estructural y la distribución de polímeros de FtsZ dentro del anillo Z. Cuando las mismas células se examinan mediante el método F3D-SIM se describe aquí (Figura 2B), sin embargo, las ventajas de esta técnica son inmediatamente evidentes. En primer lugar, la rotación de la imagen en 3D-SIM alrededor del eje z permite la visualización del anillo Z como una estructura de anillo genuina en un espacio tridimensional (Figuras 2C y 3A). Junto con el aumento en la resolución, esto revela que la distribución de FtsZ en el anillo Z es de hecho altamente heterogénea (Figura 3). La mejora en la resolución también nos permite ver los anillos Z que han iniciado el proceso de constricción para formar un tabique de división (indicado por la invaginación de la membrana celular en &lt;strong&gt; Figura 2C y 2D). Los ejemplos adicionales de B. anillos de Z subtilis visualizados mediante esta técnica se muestran en la Figura 3Bi - 3Biv e ilustran cómo la intensidad de fluorescencia alrededor del anillo Z nunca es el mismo. Por otra parte, las regiones de muy baja intensidad de fluorescencia se observan a menudo. Nos referimos a estas regiones como las lagunas (puntas de flecha blancas). Observamos estas brechas en el 15% de todos los anillos de Z examinadas (n = 84) y predominantemente en los anillos de Z con un diámetro de 800 a 900 nm (93%). Para cuantificar estas observaciones, las parcelas de intensidad 3D fueron creados del anillo Z y se muestran en la Figura 3Ci y 3CII usando los anillos Z mostradas en las Figuras 3Biii y 3Biv. Las parcelas de intensidad muestran que normalmente la cantidad de fluorescencia en el anillo Z puede variar hasta 3 - 4 veces en diferentes regiones del B. anillo Z subtilis. Además las parcelas intensidad 3D muestran que la gaps de la fluorescencia en el interior del anillo Z casi leer los niveles basales de fluorescencia de fondo (flecha negro en la figura 3Ci). Estos ejemplos anteriores muestran buenos reconstrucciones del anillo Z y dependen de suficiente luz que se emite desde la muestra sin photobleaching significativo. Esto se logra mediante el brillo de la fluoróforo GFP fusionada a FtsZ y su abundancia en la célula bajo estas condiciones (alta relación señal a ruido). En otras células, donde la relación señal a ruido es bajo la reconstrucción de la imagen es pobre. Para simular esta ocurrencia con FtsZ-GFP, la cantidad de señal de emisión obtenida de la B. subtilis células se redujo mediante la reducción de la energía de excitación. Como se muestra en la Figura 3D una reducción de 100 veces de los resultados de la energía de excitación en una imagen del anillo Z que tiene artefactos significativos. Esto se produce como consecuencia de la insuficiente contraste local entre la señal de FtsZ-GFP y el fondo que lleva a cacar reconstrucción de la imagen. Curiosamente, B. anillos de Z subtilis mostraron brechas más pronunciadas y la heterogeneidad en las regiones superior e inferior del anillo, pero no en los lados del anillo (Figura 3B). Esto ocurre debido a la diferencia en la resolución alcanzada por esta variación de 3D-SIM en el plano lateral con respecto al plano axial. Esto se traduce en las regiones superior e inferior del anillo Z (plano lateral) se va a examinar con la resolución óptima. Las lagunas en el anillo Z son demasiado pequeños para ser detectados en los lados del anillo Z como se visualiza en el plano axial, que tiene aproximadamente la mitad de la resolución del plano lateral. Las bacterias que tienen una morfología cocoides, tales como S. aureus, tiene anillos Z que se colocan en todos los planos. Así imagen del anillo Z cuando se encuentra en el plano lateral (o cerca de ella) proporciona la capacidad de la imagen de todas las regiones del anillo con la resolución óptima. Aprovechando esto, se analizó la estructura deel anillo Z en S. vivo células aureus, utilizando una cepa que contiene un plásmido de soporte de una fusión GFP-FtsZ. La producción de esta fusión está bajo el control de un promotor inducible P spac (ver paso 1.2.1). Cuando fotografiado con en el plano axial, S. anillos de Z aureus parecía idéntica a B. Z subtilis anillos que están presentes en el mismo plano (Figura 4ai). Sin embargo, los anillos de imágenes Z en el plano lateral confirmaron que todo el anillo Z apareció tanto como bead-y heterogénea. Alrededor del 26% de estos anillos también mostró al menos una &quot;brecha&quot; visible de fluorescencia (Figura 4Aii, 4B). Similar a B. subtilis FtsZ, parcelas de intensidad de fluorescencia muestran que la intensidad de fluorescencia en el anillo Z varía tanto como 4 - 6 veces en diferentes áreas de la S. aureus Z anillo (Figura 4C). La longitud y anchura de las perlas se pueden medir (consulte esquemática en la Figura 4D). Esto demostró que el 80% de los anillos de Z (n = 43) que se examinaron tenía una longitud de cordón de 200 nm, alcanzando una longitud máxima de 400 nm. La anchura de los granos, por otra parte, mide hasta 200 nm. Hubo un promedio de 12 ± 2 (SEM) cuentas FtsZ por anillo Z. Se observó datos de localización similares cuando FtsZ nativa se visualizó con estos métodos utilizando microscopía de inmunofluorescencia (IFM) que muestran que este patrón de localización heterogénea y de cordón era genuino y no un artefacto causado por la expresión de FtsZ-gfp además de FtsZ nativa (datos no se muestra). Este avance de 3D-SIM es capaz de demostrar que el anillo Z aparece como una estructura heterogénea y es posiblemente discontinua en la naturaleza. Para abordar la cuestión de cómo esta estructura de anillo Z heterogénea sufre constricción y facilita la división celular, un time-lapse análisis de la dinámica del anillo Z se puede realizar. Uno de los principales retos conestudios de time-lapse microscopía de fluorescencia es en la minimización de fotoblanqueo muestra y fototoxicidad durante la exploración. 3D-SIM requiere un gran número de imágenes en bruto que se obtiene lo que significa que photobleaching de una muestra con el tiempo resultará en una mala relación señal-ruido de la señal que conduce a insuficiente para permitir reconstrucciones imagen correspondiente. La aplicación de la nueva tecnología minimiza la cantidad de energía de excitación utilizada en cada exposición y por lo tanto una disminución en la energía que entra en las células vivas. Esto se hace mediante una combinación de interferometría haz de luz para crear el patrón estructurado sobre la muestra y el uso de cámaras CMOS científicos que aumentan la sensibilidad y la eficiencia cuántica. Esta combinación resulta en la adquisición z-pila de 1 m por segundo (512 × 512 pixels x 8 z rodajas) en comparación con 1 m por 5-8 seg (512 x 512 pixels x 8 rebanadas z) obtenido con nuestra iteración anterior de 3D-SIM (descrito en Riglar et al. 26).Disminuir el tiempo de adquisición de imágenes y ajustes de exposición también puede ayudar a minimizar la fototoxicidad de células vivas que es particularmente relevante en los estudios de time-lapse. La nueva tecnología se presenta aquí también aborda otro problema en imágenes de células vivas que nos referimos como &quot;motion blur&quot;, que en este contexto se refiere a la localización de las proteínas que cambian durante la adquisición de imágenes. Al disminuir el tiempo de adquisición de la imagen de la cantidad de &quot;motion blur&quot; se minimiza creando así una reconstrucción de la imagen más precisa. Estudios anteriores que han abordado cómo FtsZ se organiza en el anillo Z no han sido capaces de mostrar cómo la estructura de anillo Z cambia con el tiempo. Para investigar este aspecto se realizó un lapso de tiempo utilizando F3D-SIM. Esta adquisición permitido de una imagen 3D-SIM del anillo Z en B. subtilis cada 5-10 segundos durante un período de 50 segundos, que anteriormente no era posible en esta escala de tiempo. Se muestra en la figura 5A es una example de los rápidos cambios en la distribución de FtsZ en el anillo Z con el tiempo (diámetro de 890 nm). Otros anillos Z que eran visiblemente en el proceso de constricción también mostraron tener una dinámica similar que afectaron a la distribución de FtsZ alrededor del anillo Z (no mostrados). Parcelas de intensidad 3D también se pueden generar para cada uno de los puntos de tiempo para cuantificar y valorar los cambios de intensidad de fluorescencia continua y de este modo la abundancia relativa de FtsZ en diferentes regiones del anillo Z en una escala de tiempo de segundos (Figura 5B). Las regiones de interés pueden ser identificados a partir de estas parcelas de intensidad para realizar un seguimiento de las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia (Figura 5C). El seguimiento de estos cambios en la estructura de anillo Z en estas condiciones sería prácticamente imposible sin la tecnología F3D-SIM avanzada. Además, este trabajo reveló que en S. aureus el movimiento dinámico de FtsZ es similar a la observada en B. subtilis. S. células aureus RN4220 producing FtsZ-GFP fueron imágenes de 50 segundos a 10 segundos intervalos de tiempo. Cambios a la heterogeneidad del anillo Z en S. aureus con F3D-SIM también fueron similares a B. subtilis (ver puntas de flecha y flechas en la Figura 6). Estos estudios de lapso de tiempo apoyan un modelo de constricción del anillo Z (el modelo de pellizco iterativo) que se predijo a través del examen de C. fijo células crescentus, pero no se pudo demostrar, debido a la necesidad de examinar la dinámica del anillo Z en células vivas 27. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. esquemática de la configuración óptica de la F3D-SIM utilizada en este estudio. La luz del láser de la tabla de láser se dirige a través de una fibra de SIM a un lente de colimación y se fija rejilla, a continuación, en el módulo de control de fase que crea tanto la longitud de onda específica espaciamiento óptimo of las vigas ± 1 ° de orden de la viga central de orden cero y los saltos de fase para la recogida SIM. Los haces entonces entran en el módulo de control de ángulo donde los haces se reflejan a los 3 grupos diferentes para crear los 3 ángulos de iluminación. Las vigas entran entonces en el microscopio y trayectoria de la luz, como se muestra (Modificado con permiso de Paul Goodwin, API). <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2: Comparación de la fluorescencia de campo amplio convencional y las imágenes 3D-SIM de B. subtilis células que expresan FtsZ-GFP. (A) en todo el ámbito convencional de imágenes de fluorescencia de B. subtilis células que expresan FtsZ-gfp (SU570; verde) en una sola copia también se tiñeron con el colorante de la membrana FM4-64 (rojo). Barra de escala = 5 m. La imagen se adquirió usando un microscopio de fluorescencia en posición vertical.(B) de imágenes 3D-SIM de la misma B. cepa subtilis expresar FtsZ-GFP, se tiñeron con FM4-64. Las regiones de interés de la imagen se pueden seleccionar (cuadro de líneas discontinuas) para acercar la imagen. La imagen también se puede girar alrededor del eje z para ver anillos 3D FtsZ en el plano axial. (C, D) La eliminación de Fuera de la enfocar la luz y una mejor resolución de imagen proporcionado por 3D-SIM permite una visualización clara de los anillos de Z (incluidos los que se constriñe) y la membrana interna de la célula durante la división (indicado por flechas blancas). Tenga en cuenta que el texto protocolo describe la visualización de un solo fluoróforo. Sin embargo, el procedimiento puede ser adaptado para la adquisición de hasta cuatro longitudes de onda diferentes al mismo tiempo. Esta cifra se ha reproducido de Strauss et al 16. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Imágenes representativas del anillo Z en células bacterianas en forma de barra en vivo (B. subtilis) expresando FtsZ-GFP usando 3D-SIM. (Ai) El anillo Z se observa como una banda de fluorescencia perpendicular al eje longitudinal de la célula que está en el plano xy. (Aii) La imagen se ha girado alrededor del eje x z usando software de visualización 3D Imaris (consulte protocolo paso 6.1) de modo que uno está mirando a través de la estructura de anillo para ver claramente cómo FtsZ se distribuye dentro del anillo Z. Esta imagen, ahora en el plano zx muestra que el anillo tiene una distribución heterogénea de FtsZ con las regiones de ninguna o muy poca fluorescencia (puntas de flecha blancas). La imagen debe ser girado para observar estas regiones &quot;brecha&quot; de la fluorescencia. Bi-Biv muestran otros ejemplos de anillos Z rotados que ahora se encuentran en el plano ZX. Anillos de Z en (Bi-iii) tiene un diámetro de ~ 0,9 m. (Biv) muestra un anillo de Z con un diámetro de ONLy 0,65 m de someterse a las diferencias en FtsZ-GFP alrededor del anillo Z tiene un diámetro de 0,85 m (consulte los pasos 6.1 a 6.3 protocolo) constricción. (Ci) Este perfil de intensidad típica 3D ilustra la intensidad de fluorescencia (es decir, concentración). El nivel de fluorescencia en estas lagunas es baja y se acerca niveles de fluorescencia de fondo (flecha negro). (CII) un perfil de intensidad 3D similar de un anillo Z en el proceso de la constricción. Concentración FtsZ-GFP es también no uniforme; de diámetro, 0,65 m. Los paneles A, B, CI y CII se han reproducido de Strauss et al 16. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. imágenes Representante 3D-SIM de S. células aureus productores de FtsZ-GFP. Puesto que estas células son redondas (cocos), el anillo Z se have diversas orientaciones. Las células que muestran una banda de fluorescencia en la orientación de la visión normal (es decir, en el plano xy) como se muestra en (Ai), son muy similares a los de las células con forma de bastón cuando se hace girar alrededor del eje Z como para la Figura 1Ai. En (Aii) el anillo Z ya está en el plano xy; la orientación y la resolución lateral es máxima en todo el anillo que da ahora una estructura de cordón (B). (C) Una parcela intensidad 3D de la abundancia relativa de FtsZ-GFP en el anillo Z. (D) Representación esquemática de la S . anillo Z aureus. Las flechas rojas indican la longitud del talón y dimensiones de anchura (consulte paso protocolo 6.1). Esta cifra ha sido modificado de Strauss et al 16. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig5highres.jpg" width="500" /> &lt;strong&gt; Figura 5. F3D-SIM permite el análisis rápido de FtsZ localización en el tiempo en 3D-SIM. (A) Los cambios en la distribución de FtsZ-GFP dentro del anillo Z en forma de varilla B. subtilis células se pueden visualizar para indicar la dinámica del anillo. Tiempo (seg) se indica en la esquina superior izquierda de cada imagen. (B) parcelas de intensidad de fluorescencia 3D muestran la no uniforme y la distribución dinámica de FtsZ en el anillo Z. (C) de dinámica de FtsZ (FtsZ-GFP cambios de fluorescencia en el anillo) también puede ser examinada con más detalle mediante la cuantificación de la intensidad de fluorescencia con el tiempo en dos regiones de interés. Esta cifra se ha reproducido de Strauss et al 16. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. F3D-SIM imágenes time-lapse muestran cambios en FtsZ localización dentro del anillo con el tiempo en S. unureus. Una punta de flecha blanca indica una brecha cuando se detectó inicialmente en el anillo Z. La aparición y desaparición de las brechas en la misma posición (como marcado por la punta de flecha blanca) con el tiempo FtsZ ilustra cómo se redistribuye alrededor del anillo Z. Las flechas blancas indican la formación de lagunas en el anillo Z en momentos posteriores. Tiempo (s) se muestra en la parte superior izquierda de las imágenes. Esta cifra ha sido modificado de Strauss et al 16.

La información espacio-temporal sobre las proteínas dinámicas dentro de las células vivas es crucial para entender la biología. Un tipo de microscopía de superresolución llamada microscopía rápida de iluminación estructurada en 3D (f3D-SIM) revela información única sobre el anillo Z citocinético en las bacterias: tanto su apariencia en forma de perla como la rápida dinámica de FtsZ dentro del anillo.

Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

El objetivo general de este procedimiento es observar los cambios dinámicos en la proteína FTSZ durante la división celular en bacterias. Esto se logra aplicando células de bacillus subtiles que expresan la fusión de FTSZ con GFP sobre la superficie de un pequeño pad de agarosa. Luego, el pad se invierte y se transfiere a una placa de Petri con fondo de cubreobjetos de vidrio.El segundo paso consiste en obtener imágenes de lapso de tiempo de las bacterias durante la división celular utilizando un microscopio de iluminación estructurada 3D o un sistema de imágenes 3D SIM. A continuación, se evalúa la calidad de los datos brutos y se descartan las imágenes con una disminución mayor al 30 % en intensidad debido al fotoblanqueo. El paso final es analizar cuantitativamente los cambios en la localización de la proteína durante la división celular mediante la medición de la distribución de la intensidad de fluorescencia de la proteína F-T-S-Z-G-F-P a lo largo del tiempo.Finalmente, el SIM 3D ultrarrápido se utiliza para mostrar lo dinámicas que son las proteínas diona durante la división celular en bacterias. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía confocal es que obtenemos información tridimensional sobre los cambios que ocurren durante la división celular en células vivas. Aunque este método proporciona información sobre la citocinesis bacteriana, también podría aplicarse a otros sistemas en los que deseemos observar cambios proteicos dinámicos, como en células mamíferas M.Tuvimos por primera vez la idea de esto cuando vimos imágenes tradicionales de simulación 3D de células bacterianas fijadas que mostraban que la proteína FDZ no se distribuía de manera homogénea alrededor del anillo Zed. Queríamos examinar más a fondo si esta distribución estaba relacionada con los cambios que ocurren durante la constricción del anillo Zed. En general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades debido a la incapacidad de igualar el índice de refracción de su aceite con el de su muestra, lo cual dará lugar a imágenes de baja calidad.Para preparar células de bacillus subtillis para la obtención de imágenes, cultive las células hasta la fase exponencial media según se detalla en el protocolo escrito. A continuación, sujete un marco adhesivo a un portaobjetos de vidrio estándar retirando primero la lámina delgada de poliéster. Luego, aplique la superficie adhesiva expuesta del marco sobre la superficie del portaobjetos para crear eficazmente un pozo cuadrado encima del portaobjetos; deje la lámina gruesa de poliéster adherida al marco para evitar que la cubierta se pegue en los pasos posteriores.A continuación, derrita una solución de aro en el microondas hasta que hierva. Pipetee 67 microlitros de los aros derretidos dentro del marco adhesivo. Coloque inmediatamente un cubreobjetos encima de los aros para crear una superficie plana y deje a temperatura ambiente durante cinco a diez minutos. Retire el cubreobjetos durante uno o dos minutos mientras se cosecha la muestra.Recolecte una alícuota de un mililitro de la muestra tras la centrifugación a 8.000 RPM durante segundos, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 200 microlitros de medio fresco. Tome 2,5 microlitros de la muestra concentrada y pipetée sobre el pad de aros previamente preparado. Extienda la muestra uniformemente a lo largo de la superficie plana del pad de aros.Luego retire el marco adhesivo del portaobjetos con pinzas sin tocar la almohadilla de aros. Transfiera la almohadilla de aros del portaobjetos a una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro con fondo de cubreobjetos de vidrio.Para obtener imágenes de alta resolución. Invierta el disco aros de modo que la suspensión celular esté en contacto con la cubeta de la placa de Petri. El día del experimento, encienda el sistema de imagen 3D SIM OMX al menos una hora antes de realizar la imagen para permitir que el sistema y los láseres se estabilicen completamente.Luego encienda los diferentes componentes según se indica en el protocolo escrito en la estación de trabajo del controlador maestro. Abra el software OMX haciendo clic en el icono. Establezca la ruta del archivo para guardar los datos en una carpeta de datos adecuada.A continuación, inicie el software de trabajo suave. Encienda los láseres necesarios para los experimentos en la pantalla principal, en la sección de parámetros de luz. Active la cámara FITC desde la selección de canales y proceda a verificar los parámetros según se indican en el protocolo escrito.Aplique una gota de aceite en la parte superior del objetivo. Coloque la placa de Petri con las células preparadas en el inserto del portaobjetos y cúbrala con la tapa calefactora circular. Baje el portaobjetos hasta que el aceite toque la parte inferior de la placa de Petri de la muestra.Deje que el recipiente alcance el equilibrio térmico durante 15 minutos. En el portaobjetos, utilizando una configuración de exposición baja, enfoque la muestra mediante los controles del sistema de posicionamiento nano. Enfoque hacia arriba y hacia abajo a través de la muestra para determinar si la luz se distribuye uniformemente por encima y por debajo del plano focal de la muestra. Luego, utilice pasos de 0,5 micrones y marque la parte superior e inferior de la pila de imágenes antes de regresar al centro de la muestra; en la pestaña del experimento, haga clic en el botón obtener grosor para establecer el grosor de adquisición de la muestra.Determine el valor de intensidad máxima de la imagen de la muestra con la exposición actual y la configuración del porcentaje de luz transmitida. Este valor se encuentra debajo de la ventana de la imagen. Para la obtención de imágenes de lapso de tiempo, ajuste la exposición y el porcentaje de luz transmitida para obtener una intensidad máxima entre 1100 y 1400.Por encima del fondo. Para la imagen, active la sección de lapso de tiempo en la pestaña de experimento. Establezca la frecuencia de cuadros requerida y el tiempo total en el archivo de datos.Introduzca un nombre de archivo adecuado. Haga clic en el botón de ejecución para iniciar la adquisición de imágenes al comienzo de la adquisición de imágenes. Observe el valor de intensidad máxima de la imagen al inicio de la adquisición de imágenes para el primer cuadro de la serie temporal.Al finalizar la adquisición del primer cuadro, verifique que no haya habido una disminución superior al 10 % en la intensidad de la señal a través del Zack para este primer cuadro. Al finalizar la adquisición de la serie temporal, abra el archivo de imagen cruda resultante con sufijo DV y determine la disminución en la intensidad máxima de la señal desde el comienzo de la serie temporal hasta la imagen final. Descarte cualquier punto temporal en el que se haya producido un fotoblanqueamiento superior al 30 % desde el menú de procesos y active la ventana de reconstrucción de SI.Utilice la configuración preexistente para todos los parámetros. Active el botón OTF específico para el canal utilizado y ajústelo al conjunto estándar de filtros. Active el botón de ángulos KO específicos para el canal utilizado y ajústelo al conjunto estándar de filtros.Arrastre y suelte el archivo sin procesar en el espacio del archivo de entrada. Haga clic en hacerlo. Examine la distribución de FTSZ alrededor del anillo Z para crear gráficos de intensidad 3D.Luego abra un archivo de imagen 3D. Para ver las secciones individuales en z, utilice la herramienta de visualización de volúmenes ubicada bajo la pestaña del menú Ver.Para recortar una región de interés, ingrese el número de ventana para esta imagen 3D en la ventana de entrada e ingrese un número de ventana nuevo y no utilizado en la ventana de salida. El botón seleccionar región estará disponible para recortar un anillo Z individual de interés desde el campo original de visión de 40 por 40 micrones. Ajuste el eje deseado y el grado de rotación en la pestaña de rotación.Haga clic en el botón hazlo. Desplácese por el volumen para obtener la perspectiva deseada, el anillo Z. Utilice la herramienta de inspección de datos para ajustar las dimensiones de la columna y la fila y crear una nueva región de interés alrededor de un anillo Z individual.Haga clic en el centro de la imagen para posicionar esta nueva región de interés. Los datos de imagen de texto son una tabla generada automáticamente que muestra la intensidad de fluorescencia de cada píxel dentro de la región de interés. Haga clic en el botón de gráfico 3D para ver inicialmente el gráfico de intensidad.Alternativamente, se pueden exportar los datos de la imagen de texto haciendo clic en el botón de guardar datos de la tabla. En el menú de archivo, copie los datos de la imagen desde el archivo de texto guardado a una nueva hoja de cálculo. Seleccione todas las celdas dentro de la hoja de cálculo y cree un nuevo gráfico de superficie 3D.Formatee el gráfico de intensidad 3D para su publicación con datos de lapso de tiempo. Repita estos pasos en cada uno de los diferentes puntos temporales del archivo de imagen 3D. Cuando se visualiza mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional, el anillo Z aparece como una sola banda transversal de fluorescencia en Bacillus subtilis.La intensidad de fluorescencia a lo largo de esta banda es uniforme. El patrón de localización ofrece poca información sobre la organización estructural y la distribución de los polímeros de FTS dentro del anillo; aquí se examinan las mismas células. Utilizando el método FAST 3D sim.La rotación de la imagen simulada 3D alrededor del eje Z permite visualizar el anillo Z como una estructura anular genuina en el espacio tridimensional. La mejora en la resolución permite observar la distribución heterogénea de FTSZ dentro del anillo. Ejemplos adicionales de anillos Z de Bacillus visualizados mediante esta técnica ilustran cómo la intensidad de fluorescencia alrededor del anillo Z nunca es la misma.Además, se observan regiones de muy baja intensidad de fluorescencia o espacios vacíos. Para cuantificar estas observaciones, se generaron gráficos tridimensionales de intensidad del anillo Z. Los gráficos de intensidad muestran que la cantidad de fluorescencia puede variar hasta cuatro veces en diferentes regiones del anillo Z de *Bacillus subtilis*.Los gráficos de intensidad 3D muestran que los espacios casi alcanzan niveles de línea base de fluorescencia de fondo para analizar los cambios dinámicos que ocurren dentro del anillo Z. Con el tiempo, se realiza un lapso de tiempo 3D sim. Esta película muestra cómo FTSZ dentro del sutil anillo Z del bacilo está en constante cambio y se mide mediante un gráfico de intensidad que se genera para cada imagen.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar y preparar células bacterianas, cómo observarlas mediante SIM 3D, cómo analizarlas para obtener datos cuantitativos y, finalmente, cómo obtener imágenes de calidad para presentaciones. Es muy importante durante la adquisición de imágenes monitorear la salud de sus células y también el nivel de expresión de la proteína fluorescente durante la adquisición tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que otras personas en el campo de la biología celular bacteriana utilicen otros métodos de microscopía de superresolución y localicen otras proteínas bacterianas en diferentes organismos.Tras seguir este procedimiento, se podrían realizar otras formas de microscopía de superresolución, como la microscopía de localización por activación fotónica, para observar los cambios dinámicos en la proteína FDS a lo largo del tiempo.

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Investigación

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Biology

Biología

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Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM)

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