Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial

La inhibición presináptica es uno de los mecanismos inhibitorios más potentes en la médula espinal. Los cambios patológicos en la inhibición presináptica están implicados en varios mecanismos de enfermedad. Por ejemplo, el dolor neuropático e inflamatorio, así como el procesamiento anormal del dolor central.

Es importante en la lesión de la médula espinal y en los trastornos del sistema nervioso central con hiperexcitabilidad motora. Por lo tanto, cuando se investigan modelos animales de estos trastornos, conocer la intensidad de la inhibición presináptica proporcionaría información significativa. Aquí presentamos un método para evaluar la inhibición presináptica en un modelo de ratón.

La inhibición presináptica in vivo está mediada por la despolarización de las terminaciones primarias aferentes, inducida por sinapsis axo-axónicas GABAérgicas sobre las fibras presinápticas sensoriales. La activación de los receptores GABAA provoca un aumento en la conductancia al cloruro, lo que a su vez genera una despolarización primaria aferente debido a la distribución iónica local. Esta despolarización bloquea la propagación de los potenciales de acción hacia los terminales axónicos y reduce su amplitud, lo que conduce a una disminución del ingreso de calcio y a la reducción de la liberación del neurotransmisor.

Por lo tanto, los potenciales postsinápticos excitatorios en neuronas monosinápticas pueden ser inhibidos sin cambiar el potencial de membrana postsináptico ni la excitabilidad del potencial por conducción volumétrica de las neuronas modernas; la despolarización primaria de este ENT proporciona una medida directa de la inhibición presináptica en la médula espinal, y estos potenciales pueden registrarse en las raíces dorsales de la médula espinal tras la estimulación, y se denominan potenciales de raíz dorsal. La medición de los potenciales de raíz dorsal está bien establecida y se ha utilizado ampliamente en gatos, ratas y ranas, pero en ratones, los registros se han realizado casi exclusivamente en preparaciones de médula espinal aislada y ex vivo. Aquí describimos un método para registrar esos potenciales de raíz en ratones anestesiados in vivo, lo que permite una medida directa de la inhibición presináptica en un organismo intacto.

Para la grabación de DRP en ratones in vivo, se necesita el siguiente equipo. Instrumentos estándar de cirugía, un microscopio estéreo y tres micromanipuladores para posicionar respectivamente el electrodo de estimulación, el electrodo de grabación y el electrodo de referencia. Además, un marco para ratón y un sistema de calentamiento para controlar la temperatura corporal del animal durante la estimulación y la grabación, ya sea de forma aislada o junto con un estimulador.

Se necesita un amplificador estándar y una colección de datos para mejorar la relación señal-ruido. Durante la grabación del DRP, se necesitan electrodos de sección hechos a medida para su fabricación. Tire de tubos de vidrio convencionales con un tirador de pipetas estándar.

Rompa la punta del electrodo utilizando una lima de diamante para ensanchar la abertura de la punta. Pule la punta con un mechero estándar de laboratorio para alisarla. Antes de comenzar la preparación, anestesie al animal mediante una inyección IP de keils y fije la cabeza del ratón dentro del marco estereotáctico.

Luego, compruebe la profundidad de la anestesia pellizcando el PO trasero del ratón. Comience la preparación solo cuando no sea visible la retirada del PO; la profundidad de la anestesia debe comprobarse repetidamente durante el procedimiento. Inyecciones repetidas de ketamina en el músculo cuádriceps posterior.

Prolongue la anestesia y controle la temperatura corporal del animal con la sonda rectal. Para la preparación de la columna dorsal, abra la piel a lo largo de la línea media dorsal.

Suelte la piel del tejido subyacente para separar la vértebra del tejido conectivo circundante. Realice dos cortes en ambos lados de la columna vertebral y amplíe los cortes separando el tejido con el bisturí. Luego, retire los procesos espinosos S utilizando una pequeña pinza para hueso.

Comenzando en los niveles lumbares. Continúe hacia los niveles torácicos medios para evitar el secado de esta herida operatoria. Coloque pequeños trozos de gasa alrededor de la herida y humedézcalos con cloruro de sodio al 0,9 %.

Luego, comience a preparar la médula espinal a partir de la región lumbar. Inserte cuidadosamente la punta del sacabocados óseo en el espacio entre dos vértebras adyacentes. Tenga especial cuidado en reducir al máximo posible la presión aplicada sobre la médula espinal.

Proceda a los niveles torácicos humedecidos en la médula espinal con líquido cefalorraquídeo artificial. Haga esto repetidamente durante todos los pasos posteriores. Abra el durómetro cuidadosamente usando una aguja de calibre 30.

Luego, afloje y separe dos raíces adyacentes ipsilaterales de la columna vertebral. A continuación, corte las raíces lo más distal posible. Durante el procedimiento.

Evite tirar excesivamente de las raíces, ya que esto dificultará finalmente una grabación exitosa del PDR. Después de colocar el electrodo de referencia cerca de la médula espinal, mueva la punta de un electrodo de sección a una proximidad cercana al extremo proximal de una raíz dorsal. Luego, coloque la raíz dorsal sobre la abertura de la punta del electrodo de succión.

Posteriormente, aspire la raíz dorsal hacia el electrodo aplicando una breve presión negativa mediante una jeringa conectada al electrodo. Luego, llene el electrodo con A CSF mientras aplica una presión negativa continua baja hasta que la solución rodee tanto la raíz dorsal como el alambre de cloruro de plata dentro del electrodo. A continuación, eleve la punta del electrodo de la médula espinal para que ningún puente líquido produzca un cortocircuito en el electrodo.

Repita los pasos para la segunda raíz adyacente ipsilateral. Una vez que ambos electrodos estén posicionados, comience la grabación de los potenciales de la raíz dorsal estimulando una vía mientras graba desde la otra; aumente el voltaje del estímulo hasta niveles supramáximos. Las grabaciones típicas de los potenciales de la raíz dorsal tienen un aspecto similar al que se muestra en el panel izquierdo.

Un breve artefacto de estimulación va seguido por una desviación positiva breve y una desviación negativa prolongada. La última desviación es el potencial real de la raíz dorsal. Su amplitud puede calcularse con respecto a la línea base registrada directamente antes del registro del estímulo.

Varias trazas de un par de raíces pueden actuar como artefactos derivados de movimientos respiratorios y/o artefactos del EKG que podrían interferir con el PDR grabado. Tras una grabación exitosa, es posible intercambiar el sitio de estimulación y el de grabación y realizar una segunda grabación. El método presentado de grabación.

Las potenciales radiculares en mi modelo in vivo permiten la evaluación del entreno primario, la anti polarización y del animal intacto, especialmente en combinación con ratones genéticamente modificados. Puede ser una herramienta poderosa para investigar los mecanismos subyacentes a la inhibición espinal. La integración espinal es fundamental para la función motora y la percepción sensorial multimodal.

Este método es útil en investigaciones relacionadas con el dolor, lesión de la médula espinal, lesión de nervios periféricos y la inflamación. La grabación del DRP in vivo permite analizar las interacciones entre la actividad suprarraquídea y el pad. Esto no es posible en preparaciones de médula espinal aislada, comúnmente utilizadas para medir el DRP en ratones.

En principio, es posible la aplicación del fármaco a la médula espinal durante la grabación. La aplicación local mediante pipetas adicionales podría mejorar y acelerar el control de una concentración local del fármaco.