Name: Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprende a medir la inhibición presináptica en la médula espinal de ratones mediante el registro in vivo de potenciales de raíz dorsal. Este método electrofisiológico permite evaluar la integración de señales sensoriales y motoras en el sistema nervioso central.

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Damos las gracias a Manfred Heckmann útil para los debates durante el establecimiento del método. Además, agradecemos a Claudia Sommer para la asistencia técnica y Frank Schubert para la producción del vídeo de la ayuda. El trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF), Alemania, FKZ: 01EO1002 y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) del Hospital de la Universidad de Jena.

Todos los procedimientos experimentales se mencionan en el siguiente protocolo fue aprobado por las autoridades del estado de Turingia (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12). 1. Los preparativos para el Experimento <ol><li> La fabricación de electrodos de succión <ol><li> Tire una micropipeta utilizando un capilar de vidrio de borosilicato de serie con un extractor de micropipeta, por ejemplo, un electrodo de conexión estándar. </li><li> Freno el electrodo a la punta diámetro de 0,5-1 mm (un poco más grande que el diámetro de las raíces dorsales) utilizando un archivo de diamante. </li><li> Esmalte de calor de la punta para que no se dañe la raíz dorsal cuando es aspirado pulg Una antorcha de laboratorio estándar será adecuada. </li><li> Monte el filamento de vidrio en un titular de electrodo conectado a una jeringa a través del cual puede aplicarse presión negativa. </li></ol></li><li> Preparación de las soluciones <ol><li> Inyección de anestesia para los ratones: Mezclar 0,75 ml de ketamina 10%, 0,24 ml de xilazina 2%º 5 ml de solución salina al 0,9%. 10 l / g de peso corporal (BW) de la solución se inyecta por vía intraperitoneal (IP). </li><li> Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa): Diluir en agua doblemente destilada las siguientes sales (en mM): NaCl 134; KCl 3; KH 2 PO 4 1,25; MgSO 4 • H 2 O 2, NaHCO3 25; CaCl2 2, D- glucosa 10. Añadir H 2 O 2 a una concentración final de 0,003%. Use la solución siempre recién preparado. </li></ol></li><li> Preparación de la configuración de la grabación (Figura 2) <ol><li> Conecte el amplificador a una interfaz de PC para la digitalización de datos. </li><li> Utilice un programa basado en PC o un temporizador analógico para desencadenar un estimulador pulso cuadrado y adquisición de datos en el disco duro del PC. </li><li> Utilice silverwires clorada conectados a las pinzas de soldadura de vidrio estándar como para estimulación y registro. </li><li> Ensamblar tres manipuladores para la estimulación, la grabación y el electrodo de referencia, respectivamente en torno a un estéreomarco otactic para los ratones, de manera que todos los electrodos tienen acceso a la médula espinal preparado más adelante. </li><li> Conecte los tubos y jeringas para los portaelectrodos ser manzana de aplicar presión negativa. </li></ol></li></ol> 2. Comentarios generales de la experimentación animal y Preparación de los animales para el Procedimiento de grabación <ol><li> Lleve a cabo todos los experimentos con ratones de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso respectivo. Lleve a cabo todas las cirugías y las grabaciones bajo anestesia profunda asegurando que el sufrimiento de los animales se reduce al mínimo. </li><li> Anestesiar al animal mediante inyección ip de ketamina / xilazina (125 mg y 8 mg por g de peso corporal de ketamina y xilazina, respectivamente; 10 l / g de peso corporal de la solución preparada tal como se describe más arriba). Si es necesario durante las grabaciones a largo plazo, las inyecciones adicionales se pueden hacer ip o im Nota: repetitivas inyecciones im de 0,05-0,1 ml de solución de ketamina / xilazina en los muslos superiores han demostrado ser adecuadopara mantener al animal en la anestesia profunda hasta por 3 horas. </li><li> Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. </li><li> Fijar la cabeza del animal en un marco estereotáctico y use una almohadilla eléctrica con sonda rectal y bucle reflejo de controlar la temperatura corporal de los animales durante el experimento. Fijación de la médula espinal en un marco estereotáxico no es necesario. </li><li> Antes de empezar la preparación, comprobar la profundidad de la narcosis por reflejo de parpadeo y espasmos entre los dedos de los ratones. Los reflejos deben ser abolidas. </li><li> Abra la piel a lo largo de la línea media por encima de la médula espinal desde el nivel superior torácica para reducir las zonas lumbar para obtener un campo operacional clara con un bisturí. No utilice tijeras para hacer incisiones en la piel. Perder con cuidado la piel del tejido subyacente. Durante las etapas posteriores mantienen la herida humedecida en un 0,9% de solución salina. </li><li> Corte los tendones y el tejido conectivo en ambos lados de las vértebras de la zona lumbar a los niveles torácicos usando escalpelo y tijeras. </li&gt; <li> Retire las apófisis espinosas y resto de tejido conectivo que rodea las vértebras usando una pequeña pinza. </li><li> Romper con cuidado vértebras con la pinza a partir de los niveles lumbares (L4/L5) bajo un microscopio de disección. Empuja la punta de la pinza en el espacio entre las vértebras y la médula espinal y levantar piezas de hueso aparte. No hagáis daño a la dura y evitar la presión en la médula espinal. Ambos son críticos para el éxito. Mantener la médula espinal humedecido durante todo el procedimiento. Proceder a niveles de mediados de torácicos. </li></ol> 3. La separación de las raíces dorsales y DRP de grabación (Figura 2) <ol><li> Abra la duramadre con cuidado usando una aguja fina (30 G) con una punta doblada. Utilice LCRa para humedecer de ahora en adelante. </li><li> Separar las raíces dorsales medida de lo posible utilizando el medidor y cortar dos raíces adyacentes como distal como sea posible. Vigorosa tirando de las raíces durante la separación afecta el éxito del experimento. </li><li> Baje el electrodo de succión hasta el doRSAL raíces. Añadir como mucho LCRa a la médula espinal como sea posible porque el líquido ayuda a succionar en las raíces dorsales. </li><li> Suck el extremo cortado de uno de la raíz dorsal en uno pipetas de vidrio mediante la aplicación de presión negativa a través de una jeringa. Si es necesario, mover la raíz dorsal en frente de la abertura de electrodo usando una aguja fina. </li><li> Si la raíz dorsal se encuentra seca en el electrodo de succión, añadir un poco de LCRa a su punta mientras chupa con cuidado hasta que la pipeta está suficientemente llena de LCRa. </li><li> Después de la raíz dorsal es aspirado, levante la punta del electrodo de la médula espinal. Tenga cuidado de que no &quot;puente de agua&quot; entre la punta de la pipeta y el cable de cortocircuito de la médula del electrodo de registro / estimulación. </li><li> Repita los pasos 3.3 a 3.6 para una raíz adyacente ipsilateral. </li><li> Coloque el electrodo de referencia lo más cerca posible a las raíces dorsales y mantenerlo humedecido mediante la aplicación de LCRa. </li><li> Al establecer la configuración de la grabación, uno de raíz ya está elegido para la estimulación, laotro para la grabación. El incremento progresivo de tensión durante la grabación de la segunda raíz dorsal se realiza en el modo de pinza de corriente. Uno puede notar una desviación hacia abajo corto que es seguido por una larga duración de desviación lenta, hacia arriba que representa el DRP. </li><li> Ajuste la tensión de estímulo para supramáxima niveles y grabar varios barridos (por lo menos 20 a 30 barridos / raíz dorsal a 0,1 Hz, filtro de entre 0,3 Hz-3 kHz). </li><li> Registre trenes cortos de tres estímulos (100 Hz) para obtener información acerca de la suma que depende del tiempo de la DRP. </li><li> Conmutador de grabación y el sitio de estimulación para las grabaciones contralaterales adicionales. </li><li> Animales no están destinados a sobrevivir el procedimiento. Sacrificio de animales después de la última grabación mediante decapitación mientras estaba todavía bajo anestesia profunda (ketamina / xilazina, ver más arriba, paso 2.2). </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Transferencia de datos con el programa de análisis (por ejemplo, Sigma Plot, Igor Pro o MATLAB). </li><li> Calcula el promedio huellas from 20-30 barridos. </li><li> Tome la amplitud máxima de la desviación de tensión (a partir de la línea de base; DRP pico de amplitud) para su posterior análisis (Figura 3). </li><li> Calcular la relación de la amplitud de pico de DRP después de tres pulsos y solo pulso para obtener una medida de la suma dependiente del tiempo de los potenciales posteriores. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Extra-e intracelulares registros electrofisiológicos de la actividad neuronal y sináptica potenciales in vivo son el estado de las técnicas más avanzadas en la investigación de las funciones neuronales del sistema nervioso central y la fisiopatología. Integración espinal es fundamental para la función del motor, por ejemplo, el movimiento de las extremidades y de la percepción sensorial multimodal. Inhibición presináptica es un mecanismo fundamental en este proceso computacional asegurar respuestas ade...

La inhibición presináptica es uno de los más poderosos mecanismos inhibitorios en la médula espinal. Inhibe los potenciales postsinápticos excitatorios (EPSPS) en motoneuronas monosinápticamente excitados sin cambiar el potencial de la membrana postsináptica y la excitabilidad de las motoneuronas 1-3. Despolarización aferente primaria (EAP) inducida por la sinapsis GABAérgicas axo-axonal presináptica sobre las fibras sensoriales es el mecanismo subyacente 4-7 (véase también Figure1a). Estas sinapsis contienen GABA A y GABA-B (receptores GABA A y GABA B R R). La actividad de GABA A R conduce a un aumento en la conductancia de cloruro que provoca PAD debido a la distribución de iones local. Esta despolarización bloques de la propagación de potenciales de acción en los terminales de los axones y reduce su fuerza que conduce a una disminución de Ca 2 +-afluencia y la reducción de la liberación del transmisor. La activación de los receptores GABA B no hacet contribuyen a PAD, pero conduce a una reducción de la Ca 2 +-afluencia mejorando así la inhibición presináptica. Mientras que la activación de GABA A R parece estar implicado en la inhibición a corto plazo, el GABA B R están implicados en la modulación de largo plazo 8-10. Además de GABA, que representa la mayor parte de la PAD y la inhibición presináptica, otros sistemas transmisores también podrían modular y contribuir a este mecanismo de 11,12. Los cambios patológicos en la inhibición presináptica parecen ser cruciales en varios estados de enfermedad, por ejemplo, la inflamación y el dolor neuropático periférico 13,14, así como el procesamiento anormal de dolor central 15, lesión de la médula espinal 16, y enfermedad del SNC con hiperexcitabilidad del motor mediada por la transmisión GABAérgica defectuoso 17, 18. Por lo tanto, la estimación de la inhibición presináptica la pena investigar las condiciones patológicas experimentales a nivel de la médula espinal en vivo </em&gt;. PAD da lugar a potenciales de volumen llevado a cabo proporcionando una medida directa de la inhibición presináptica en la médula espinal. Esas posibilidades se denominan potenciales de la raíz dorsal (DRP) y pueden ser medidos de las raíces dorsales de la médula espinal después de la estimulación de las raíces dorsales adyacentes 7. Las primeras mediciones de DRP se han reportado en los gatos y ranas 19 y fueron intensamente estudiado en gatos por Eccles, Schmidt, y otros en la década de 1970 3,4,20,21. Mientras grabaciones in vivo de DRP en los gatos 22 y 23 ratas han sido ampliamente utilizados, las mediciones en los ratones se han realizado casi exclusivamente en preparaciones aisladas ex vivo de la médula espinal 15,24. Aquí, se describe un método para grabar DRP en ratones anestesiados in vivo que permite una medida directa de la inhibición presináptica en el organismo intacto.

<table><tbody><tr><td>Tubos de vidrio (diámetro interior 1,16 mm)</td><td>Science Products (Hofheim, Alemania)</td><td>GB200F-10</td><td>Otros tubos de vidrio también podrían ser adecuados</td></tr><tr><td>Solución de superfusión (estéril, NaCl al 0,9%)</td><td>Braun Melsungen AG</td><td>3570350</td><td></td></tr><tr><td>Rompun 2% (xilacina)</td><td>Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Alemania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td><td>Medistar GmbH (Ascheberg, Alemania)</td><td>KETAMIN 10%</td><td></td></tr><tr><td>30 g Microaguja/ Estéril</td><td>Braun Melsungen AG</td><td>4656300</td><td></td></tr><tr><td>Sales para aCSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>S88 Dual Output Square</td><td>Pulse Grass Technologies (Warwick, EE. UU.)</td><td>S88X</td><td></td></tr><tr><td>SIU5 RF Unidad de aislamiento de transformador</td><td>Grass Technologies (Warwick, EE. UU.)</td><td>SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>InstruTECH LIH 8 + 8</td><td>HEKA ( Lambrecht, Alemania)</td><td>LIH 8+8 + Patchmaster software</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador universal</td><td>NPI (Tamm, Alemania)</td><td>ELC-03X</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments (Novato, EE. UU.)</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus (Tokio, Japón)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instruments (Novato, EE. UU.)</td><td>MPC-200/MPC-325</td><td>También es posible micromanipuladores mecánicos</td></tr><tr><td>Sistema de manta homeotérmica</td><td>Stoelting (Wood Dale, EE. UU.)</td><td>50300V</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de electrodo de registro intracelular/extracelular</td><td>Harvard Apparatus (Holliston, EE. UU.)</td><td>641227</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación potencial<em&gt; en vivo</em

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

La inhibición presináptica es uno de los más poderosos mecanismos inhibitorios en la médula espinal. El mecanismo fisiológico subyacente es una despolarización de las fibras aferentes primarias mediada por sinapsis GABAérgicas axo-axonales (despolarización aferente primaria). La fuerza de la despolarización aferente primaria se puede medir mediante el registro de los potenciales de volumen-llevado a cabo en la raíz dorsal (potenciales de la raíz dorsal, DRP). Los cambios patológicos de la inhibición presináptica son cruciales en la central de procesamiento anormal de ciertas condiciones de dolor y, en algunos trastornos de la hiperexcitabilidad del motor. Aquí se describe un método de DRP grabación en vivo en ratones. Se explica la preparación de las raíces dorsales de la médula espinal en el animal anestesiado y el procedimiento de registro con electrodos de succión. Este método permite medir GABAérgica DRP y por lo tanto la estimación de la inhibición presináptica de la médula en el ratón vivo. En combinación con modelos de ratones transgénicos, la grabación puede DRP sírve como una herramienta poderosa para investigar la enfermedad asociada a la columna vertebral fisiopatología. In vivo la grabación tiene varias ventajas en comparación con las preparaciones in vivo de médula espinal aisladas ex, por ejemplo, la posibilidad de grabar o la manipulación de las redes supraespinales y la inducción de DRP por la estimulación de los nervios periféricos simultánea.

Trazas de DRP típicos se muestran en la Figura 3. El artefacto de estimulación prominente es generalmente seguido por una breve desviación hacia abajo. A partir de entonces una larga duración deflexión ascendente lento, en representación de la DRP se distingue claramente. En un subgrupo de las grabaciones, los reflejos de la raíz dorsal son visibles como pequeños picos en la parte superior de la DRP. En los ratones normales de tipo salvaje, los reflejos de la raíz dorsal aparecen más a menudo cuando el ...

Inhibición presináptica GABAérgicas es un poderoso mecanismo inhibitorio en la médula espinal importante para el motor y la integración de la señal sensorial en las redes de la médula espinal. Subyacente despolarización aferente primaria se puede medir mediante el registro de los potenciales de la raíz dorsal (DRP). Aquí se demuestra un método de grabación en vivo de DRP en ratones.

Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial<em&gt; En Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

La inhibición presináptica es uno de los mecanismos inhibitorios más potentes en la médula espinal. Los cambios patológicos en la inhibición presináptica están implicados en varios mecanismos de enfermedad. Por ejemplo, el dolor neuropático e inflamatorio, así como el procesamiento anormal del dolor central.Es importante en la lesión de la médula espinal y en los trastornos del sistema nervioso central con hiperexcitabilidad motora. Por lo tanto, cuando se investigan modelos animales de estos trastornos, conocer la intensidad de la inhibición presináptica proporcionaría información significativa. Aquí presentamos un método para evaluar la inhibición presináptica en un modelo de ratón.La inhibición presináptica in vivo está mediada por la despolarización de las terminaciones primarias aferentes, inducida por sinapsis axo-axónicas GABAérgicas sobre las fibras presinápticas sensoriales. La activación de los receptores GABAA provoca un aumento en la conductancia al cloruro, lo que a su vez genera una despolarización primaria aferente debido a la distribución iónica local. Esta despolarización bloquea la propagación de los potenciales de acción hacia los terminales axónicos y reduce su

measuring-spinal-presynaptic-inhibition-mice-dorsal-root-potential

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Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

Una técnica de imagen para el monitoreo de los cambios de potencial de membrana con una resolución temporal sub-micrométrico espacial y sub-milisegundos es descrito. La técnica, basado en una excitación láser de colorantes sensibles a voltaje, permite realizar mediciones de señales en los axones y colaterales axónicas, ramas terminales individuales dendríticas, y las espinas dendríticas.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Fuente: Shannonhouse, J., et al. Imágenes de calcio in vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios de raíz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). El video muestra una técnica de imagen de calcio in vivo para monitorear la actividad neuronal en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de un ratón transgénico. Las neuronas DRG expresan un indicador de calcio que aumenta la intensidad de la fluorescencia al unirse al calcio. Los estímulos...

Imágenes de calcio in vivo de conjuntos neuronales en los ganglios de la raíz dorsal intacta de un ratón

Fuente: Lai, J., et al. Registro electrofisiológico simultáneo y microinyecciones de agentes inhibidores en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra una técnica basada en microinyección para el registro e inhibición neuronal simultáneos en el colículo superior de rata. El procedimiento implica la focalización estereotáxica, la perforación del cráneo y la inserción de un inyectrode, que administra un neurotransmisor inhibidor mientras registra la actividad neuronal. La...

Inhibición de la actividad neuronal y su detección mediante electrofisiología en una rata

Las mediciones de las propiedades de conducción nerviosa in vivo ejemplo de una poderosa herramienta para caracterizar diversos modelos animales de enfermedades neuromusculares. A continuación, presentamos un protocolo sencillo y fiable por lo cual el análisis electrofisiológico en los nervios ciáticos de ratones anestesiados se puede realizar.

En Vivo electrofisiológicos mediciones sobre los nervios ciáticos de ratones

Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

La medición de la conducción nerviosa es una herramienta útil para evaluar modelos de neurodegeneración ratón pero es con frecuencia sólo se aplica para estimular el nervio ciático en miembros posteriores. Aquí, describimos una técnica para medir compuestos musculares potencial de acción (CMAP) en vivo en el ratón miembro anterior músculos inervados por el plexo braquial.

En Vivo Medición electrofisiológica de potencial de acción compuesto del músculo de las extremidades anteriores en modelos de ratón de la degeneración de la motoneurona

La grabación de una sola fibra es una técnica electrofisiológica eficaz que es aplicable a los sistemas nerviosos central y periférico. Junto con la preparación de DRG intacto con el nervio ciático adjunto, se examina el mecanismo de falla de conducción. Ambos protocolos mejoran la comprensión de la relación del sistema nervioso periférico con el dolor.

Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Este protocolo describe el registro intracelular in vivo de motoneurones lumbares de rata con estimulación simultánea de corriente directa trans-espinal. El método nos permite medir las propiedades de la membrana y registrar la cocción rítmica de motoneurones antes, durante y después de la polarización anodal o catódal de la médula espinal.

En Vivo Registro Intracelular de Motoneurones Espinales de Rata Tipo Identificados Durante estimulación de corriente directa trans-espinal

El presente protocolo describe imágenes de calcio in vivo para medir las respuestas de conjuntos de neuronas lumbar-6 DRG a estímulos somáticos y viscerales. Se pueden hacer comparaciones exhaustivas entre las neuronas que responden a diferentes estímulos. Este protocolo es valioso para investigar los mecanismos del dolor visceral y la estimulación somática, como la acupuntura.

in vivo Imágenes de calcio de la respuesta de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal a estímulos somáticos y viscerales

Este estudio presenta una manipulación quirúrgica para exponer el T-DRG en ratones anestesiados para la obtención de imágenes de calcio in vivo , junto con registros sincrónicos de ECG. Este método representa una herramienta de vanguardia para estudiar la estimulación de los nervios eléctricos periféricos y las entradas de los órganos viscerales torácicos, así como sus interacciones a nivel sensorial primario.

Imágenes de calcio y registro de ECG de los ganglios de la raíz dorsal torácica (DRG) in vivo para el estudio de la estimulación de los nervios periféricos

Aprende a medir la inhibición presináptica en la médula espinal de ratones mediante el registro in vivo de potenciales de raíz dorsal. Este método electrofisiológico permite evaluar la integración de señales sensoriales y motoras en el sistema nervioso central.

Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial

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