Name: Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprende a medir la deformabilidad celular mediante un ensayo de microfluidos con dispositivos PDMS. Este método de alto rendimiento permite analizar el tiempo de tránsito de células a través de constricciones micrométricas.

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Los autores desean agradecer Lloyd Ung de aportación constructiva en las primeras versiones de esta técnica, el Dr. Jeremy Agresti para tapa de presión consejos de diseño, y el Dr. Dongping Qi por su ayuda en la fabricación de la tapa de presión. Estamos muy agradecidos a los laboratorios de M. Teitell y P. Gunaratne para proporcionar una variedad de muestras de células para la prueba. Estamos muy agradecidos a la Fundación Nacional para la Ciencia (CARRERA Premio DBI-1254185), el Centro Integral del Cáncer Jonsson de la UCLA, y la UCLA Clínica y Translational Science Institute para apoyar este trabajo.

1. Diseño de dispositivos de microfluidos NOTA: El diseño del dispositivo tiene cuatro regiones funcionales básicos: puerto de entrada, filtro de células, matriz de constricción, y el puerto de salida (Figura 1). El diseño general se puede aplicar a una amplia gama de tipos de células, con ajustes menores en las dimensiones. Siempre he aquí algunas recomendaciones básicas de diseño, junto con los parámetros del dispositivo que son eficaces para una selección de ambas células primarias y inmortalizadas. <ol><li> Seleccionar la anchura de los canales de la matriz de constricción (Figura 1B) en aproximadamente 30-50% del diámetro medio de celda; estos resultados de proporción-constricción a célula de tamaño en la deformación celular significativa, pero la obstrucción mínima. Dado un tipo de célula que no ha sido previamente probado, es prudente para diseñar una gama de anchos de constricción de ~ 30-50% del diámetro de la celda para encontrar el ancho óptimo. Al igual que con muchos tipos de dispositivos de microfluidos, más de 120 maestros moldes de dispositivos pueden tomar como modelo en un pecadogle oblea de silicio de 4 pulgadas, lo que permite una gran variedad de diferentes diseños de dispositivos que se fabrica en un único proceso de fabricación. </li><li> Seleccione la altura del canal a ser al menos 50% del diámetro de la célula; Esto asegura que la célula está confinado en 2 dimensiones. Para evitar el colapso durante la unión de canal, asegúrese de que la relación de aspecto del canal no menos de 1:10 es (altura: anchura) en todo el dispositivo. Para los canales que deben superar esta relación de aspecto, añadir puestos de apoyo para evitar el colapso. Postes de soporte espacio a una distancia que es al menos dos veces el diámetro de la celda, para no impedir el flujo celular. </li><li> Incluir un filtro en los puertos de entrada para eliminar los residuos y desagregar grupos de células (Figura 1B). Ajuste el tamaño y el espaciamiento de los postes de filtro de modo que la distancia que separa los mensajes es aproximadamente igual a un diámetro celular. NOTA: El límite inferior del tamaño de la característica está establecida por la resolución con la que la máscara de la litografía se imprime. Asegúrese de que todas las funciones están dentro de los resolution límite especificado por el proveedor máscara. </li></ol> 2. Suministros y Preparación NOTA: Antes de realizar un experimento, los siguientes elementos deben estar preparados. Un diagrama esquemático de la configuración completa se da en la Figura 1. <ol><li> Fabricar el maestro dispositivo usando técnicas estándar para micromecanizado litográfica 14,15. Verificar la altura de las características modeladas utilizando un perfilómetro. NOTA: Mientras que los maestros pueden ser fácilmente fabricados en una instalación de salas blancas, algunos laboratorios han desarrollado métodos de litografía de bajo costo para su uso en un entorno semi-limpia 16,17. </li><li> Preparar la fuente de aire para el flujo accionado por presión, usando un tanque de aire comprimido y la secuencia de los reguladores de aire y accesorios (Figura 1A). <ol><li> Establecer un tanque de suministro de aire y regulador manual. NOTA: Una composición de 5% de CO2 en aire mantiene un ambiente similar a un incubato típica de cultivo de célulasr, pero otras mezclas de gases pueden también ser utilizados. </li><li> Establecer un regulador de presión controlado electrónicamente en línea con el regulador manual. Utilice un convertidor electroneumático para regular y mantener una caída de presión estable a través de los canales, con fluctuaciones de presión de menos de 2 kPa. Utilice el código simple escrito en LabVIEW (Información complementaria) a la entrada de la presión deseada. NOTA: El convertidor electro-neumática utiliza un bucle de retroalimentación interno para ajustar la presión de salida de la válvula para que coincida con la presión especificada a través del dispositivo de microfluidos. </li><li> Configurar una cámara presurizada para conducir el flujo de la suspensión celular. Montar una cámara de suspensión de células de un citómetro de flujo estándar de tubo y una tapa mecanizada que crea un sello hermético a presión en el tubo. NOTA: La tapa de la cámara de presión contiene dos orificios: una entrada que se conecta al tanque de aire comprimido, y una salida a través de la cual las células fluyen desde la cámara de presión en el dispositivo (Figure 2). </li></ol></li><li> Establecer un microscopio invertido equipado con una cámara que tiene una velocidad de adquisición de al menos 100 fotogramas por segundo para capturar imágenes de las células fluyen a través de la matriz de constricción. Interfaz de la cámara con una tarjeta de captura de vídeo y un ordenador. </li><li> Preparar una solución madre de tensioactivo de 10% w / w de Pluronic F-127 en tampón fosfato salino (PBS) como la adición de una pequeña cantidad de F127 a la solución de medio celular ayudará a minimizar la adhesión celular a las paredes de PDMS. Para preparar la solución F127, vórtice y calentar suavemente a 37 ° C para disolver el F127. Antes de usar, pasar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras y almacenar a temperatura ambiente. Preparar la solución de tensioactivo antelación vórtex y filtrado generará burbujas que persistirán durante más de 24 horas. </li></ol> 3. la fabricación del dispositivo de microfluidos <ol><li> Fabrique bloque PDMS con canales de microfluidos. <ol><li> Mezclar bien con un PDMSta relación de 1:10 (w / w) agente de curado a la base. </li><li> Vierta la mezcla sobre el maestro del equipo (paso 2.1). Degas en una campana de vidrio con vacío aplicada hasta que las burbujas atrapadas desaparecen, o durante unos 10-20 min. NOTA: Después de este tiempo, todavía puede haber burbujas en la interfase aire-PDMS, que es normal; éstos normalmente se disiparán durante la cocción. Es más crítico para asegurar que no haya burbujas restantes adyacentes a los canales. </li><li> Hornee el dispositivo de desgasificado a 65 ° C durante 4 horas. Para evitar el colapso de los canales, hornear el dispositivo durante la noche para reticular aún más las PDMS para un dispositivo con un mayor módulo elástico que es más resistente al colapso canal. Sin embargo, nota que se extendía hornear también fragiliza los PDMS y puede conducir a la rotura al perforar agujeros (Paso 3.3). </li></ol></li><li> Retire los dispositivos de microfluidos del molde maestro. Cortar los dispositivos de microfluidos individuales fuera del bloque de PDMS con una hoja de afeitar y retire el dispositivo desde el mástiler. Comience levantando suavemente una esquina del dispositivo; pelado lento y suave, en lugar de levantar el bloque de PDMS hacia arriba, reduce la presión sobre los dos PDMS y el maestro. </li><li> Haga agujeros en el dispositivo de PDMS para crear puertos de conexión para el acceso entre la tubería y microcanales. Crear orificios utilizando un punzón de biopsia, y el punzón desde el lado del canal hasta el lado exterior del dispositivo. NOTA: Un punzón de biopsia con un diámetro interior de 0,75 mm crea agujeros de esa interfaz perfectamente con polieteretercetona (PEEK) tubo (diámetro exterior = 1/32 &quot;o 0,79 mm) o un tubo de polietileno (PE-20, de diámetro exterior = 0,043&quot; o 1,09 mm ). Use un anillo de luz para ayudar a visualizar agujeros en dispositivos con canales poco profundos 18. Asegúrese de que el punzón de biopsia es fuerte; después de un uso repetido la vanguardia embota y el punzón de biopsia debe ser desechado y sustituido. </li><li> Enjuague el dispositivo de PDMS con isopropanol (grado HPLC) para quitar trozos de polvo y presentadas de PDMS. Asegúrese de que elagujeros estén libres de desechos por la dirección de un flujo constante de isopropanol puro a partir de una botella de apretón a través de los agujeros. Secar con aire filtrado. Después de la limpieza, coloque PDMS bloques con canales boca arriba en una placa de Petri limpia para mantener la limpieza del dispositivo. Si es necesario, dispositivos de tiendas en esta forma hasta que la unión. </li><li> Limpie el sustrato de vidrio de lavado con metanol (grado HPLC), secar con aire filtrado y coloque sobre una placa caliente a 200 ° C durante 5-10 minutos para asegurar que el vaso está completamente limpia y seca antes del tratamiento de plasma. NOTA: El sustrato de vidrio se forma la parte inferior de cada canal. Normalmente basta un portaobjetos de vidrio, ya que un objetivo de 10X o 20X es ideal para la formación de imágenes de múltiples canales en paralelo. Para imágenes de mayor resolución, unir el dispositivo a un cubreobjetos (# 1.5 espesor). </li><li> Unir el dispositivo de PDMS al sustrato de vidrio. <ol><li> El plasma de oxígeno tratar el lateral de canal del bloque de PDMS y 1 lateral de un portaobjetos de vidrio. NOTA: WITH una unidad de descarga de mano, utilizar un tiempo de tratamiento de 1 min, pero optimizar el tiempo de tratamiento para cada aparato plasma de oxígeno. </li><li> Coloque el lado del canal de los PDMS en la parte superior del lado tratado del vidrio inmediatamente después del tratamiento. </li><li> Sostenga con una ligera presión para ~ 10 seg para promover la unión. Hornear todo el dispositivo a una temperatura elevada (60-80 ° C) durante al menos 15 min para mejorar la resistencia de la unión. </li></ol></li></ol> 4. Deformación células a través de canales constreñida <ol><li> Inspeccione el dispositivo de microfluidos con un microscopio. Asegúrese de que los canales no se contraen o rotas y que los dos orificios de entrada y salida se conectan directamente en los canales de dispositivos mediante el uso de un objetivo de baja potencia (10 veces). Designe dispositivos defectuosos al anotar la superficie del PDMS con una hoja de afeitar y no usarlos para experimentos. </li><li> Preparar las muestras de cultivo de células a ensayar. Células de cultivo utilizando condiciones estándar. <ol><li> Fo ejemplo, cultivo de células HL-60 en medio RPMI-1640 suplementado con solución de penicilina-estreptomicina al 1% y suero bovino fetal al 10% en 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C. </li><li> Para las células adherentes, los cosechan por tripsinización y se resuspende en medio de crecimiento fresco. Utilice un protocolo tripsinización estándar; por ejemplo, añadir ~ 0,5 ml de tripsina a un matraz con 25 cm2 de área de cultivo, y volver a suspender en ~ 30 ml de medio fresco. Diferenciar células HL-60 en células de tipo neutrófilo por todo-trans retinoico (ATRA) a una concentración final de 5 mM por 1 x 10 5 células / ml como se ha descrito previamente 19,20. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 3 min, aspirar cuidadosamente las células sobrenadante y resuspender a la densidad final apropiado en medio de cultivo fresco con 0,1% v / v F-127. </li></ol></li><li> Contar las células utilizando un contador Coulter, hemocitómetro o citómetro de flujo. Ajustar la suspensión celular a una densidad de 1 × 10 6 5 x 10 <shasta&gt; 6 células / ml. Una vez que la densidad de la suspensión se ajusta, suplemento con aproximadamente 0,1% v / v F-127. NOTA: La densidad celular y la concentración de tensioactivo pueden necesitar ser modificada dependiendo de los sistemas de células particulares, Tabla 1 proporciona un registro de concentraciones utilizadas previamente de células y F-127 para diferentes tipos de células. </li><li> Coloque suspensión de células en un citómetro de flujo del tubo y conectarse a la tapa de presión. Antes de conectar el tubo al dispositivo de microfluidos, ajustar la presión a alrededor de 14-21 kPa y descarga hasta que la suspensión celular emerge desde la punta de la tubería. Esto ayudará a minimizar las burbujas de aire en el tubo y el dispositivo. </li><li> Inserte la punta del tubo que contiene la suspensión de células en la entrada de dispositivo. Si el equipo está unido a un cubreobjetos, coloque el dispositivo sobre una superficie plana y sólida, tal como la platina del microscopio antes de conectar el tubo; el cubreobjetos es frágil y lo contrario podría romperse. </li><li> Inserte un trozo de tubo into el puerto de salida y la ruta en un tubo de vacío para la recogida de residuos tal como un tubo Falcon vacío pegada a la cara de la platina del microscopio. Para mantener la coherencia en la resistencia fluídica global del dispositivo entre los experimentos, asegúrese de que el tubo de entrada y la salida es del mismo diámetro y aproximadamente la misma longitud para cada experimento. </li><li> Rampa suavemente la presión para cerca de 28 kPa o hasta que las células fluyen a través de los canales. Coloque el dispositivo de modo que múltiples canales están en el campo de visión y son perpendiculares a la parte inferior de la pantalla. Si la cámara está limitada por el tamaño de los datos, adquirir múltiples vídeos para generar un número suficiente de puntos de datos independientes. Ajustar la velocidad según sea necesario para la salida de datos deseado marco. Para captar los cambios en la forma celular, utilizar imágenes de alta velocidad a 300 fotogramas por segundo (fps); para medir los tiempos de tránsito de las células, utilizar velocidades de fotogramas de aproximadamente 100 fps. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Abra el archivo de mástiler_script.m (Descargable Archivo Suplementario) y ejecutar el programa. </li><li> Seleccione el primer video para ser analizada desde la ventana del Explorador de Windows que aparece. Especifique la velocidad de fotogramas del vídeo seleccionado y presione intro. NOTA: Una figura aparecerá que pide al usuario que seleccione una ventana de recorte rectangular para el primer video. </li><li> Seleccionar una ventana que abarca todos los canales de izquierda a derecha y cruza los canales justo encima de la primera bombilla de la matriz de canales en la parte superior y la parte inferior (Figura 3). </li><li> Seleccione las regiones de constricción de la imagen recortada. Preste especial atención a mantener una distancia fija de píxeles entre la ventana de límite superior e inferior para cada vídeo seleccionado. NOTA: El borde superior ventana especifica la constricción superior y el borde inferior ventana especifica la constricción más inferior (Figura 4); constricciones intermedios se aproximan de esta entrada del usuario. A continuación, el algoritmo muestra las segmentation de las células en los primeros 50 cuadros de cada video (Figura 5). </li><li> Monitorear la imagen izquierda superior (Figura 5A) de cerca para determinar si el algoritmo está localizando con precisión las células; una imagen binarizada se superpone a la fuente de vídeo para demostrar la localización de las células identificadas. NOTA: Las diferentes ventanas, (Figuras 5B-5D) son para el diagnóstico de código y demuestran los fotogramas de vídeo después de las operaciones específicas de procesamiento de imágenes. </li><li> Seleccione el siguiente vídeo que se procesa a partir de la ventana del Explorador de Windows. NOTA: El algoritmo se repetirá los pasos 5.2-5.5 para cada vídeo seleccionado. </li><li> Seleccione Cancelar una vez todos los vídeos deseados, se han añadido a través de la ventana del Explorador de Windows para instruir a la función que la lista de vídeos se ha completado. NOTA: El algoritmo llevará a cabo las operaciones restantes sin intervención del usuario. Esto tomará aproximadamente 1-2 horas, dependiendo del número de vídeos procesados ​​y pe informáticosrformance. Al finalizar, el algoritmo producirá un histograma de los datos de tiempo de tránsito y guardar los datos en el directorio como un archivo .mat MATLAB y un archivo xls de Microsoft Excel. </li></ol>

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Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Aquí proporcionamos un procedimiento experimental global para el análisis de la deformación de las células que transitan a través de canales de microfluidos obstruida usando flujo de presión impulsada. Una secuencia de comandos de MATLAB permite el procesamiento automático de datos (material complementario); se mantiene una versión actualizada del código ( <a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a> ). En términos más generales, las técnicas presentadas aquí pueden ser a...

Los cambios en la forma celular son fundamentales en numerosos contextos biológicos. Por ejemplo, los eritrocitos y los leucocitos se deforman través de los capilares que son menores que su propio diámetro 1. En la metástasis, las células cancerosas deben deformarse a través de huecos intersticiales estrechas, así como la vasculatura tortuosa y redes linfáticos para sembrar en sitios secundarios 2. Para investigar el comportamiento físico de las células individuales, dispositivos de microfluidos presentan una plataforma ideal que se puede personalizar para estudiar una serie de comportamientos celulares, incluyendo su capacidad de migrar a través de huecos estrecho 3 y deformar pasivamente a través de las constricciones de escala micrométrica 3- 9. Polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivos de microfluidos son ópticamente transparentes, permitiendo deformaciones celulares para ser visualizadas mediante microscopía de luz y analizados utilizando herramientas básicas de procesamiento de imágenes. Además, las matrices de constricciones pueden ser definidos con precisión, que permite el análisis de múltiples células simultáneamente con unarendimiento que supera muchas técnicas existentes 10,11. Aquí se presenta un protocolo experimental detallado para sondear deformabilidad celular utilizando el dispositivo de microfluidos &#39;Cell Deformador&#39; PDMS. El dispositivo está diseñado de manera que las células de paso a través de constricciones secuenciales; esta geometría es común en contextos fisiológicos, tales como el lecho capilar pulmonar 12. Para medir la deformabilidad celular, el tiempo de tránsito proporciona una métrica conveniente que se mide fácilmente como el tiempo requerido para una célula individual a través de un único tránsito 4,6 constricción. Para mantener una caída de presión constante a través de los canales estrechos durante el tránsito de células, usamos flujo accionado por presión. Nuestro protocolo incluye instrucciones detalladas sobre el diseño del dispositivo y la fabricación, el funcionamiento del dispositivo de flujo impulsado por presión, la preparación y obtención de imágenes de células, así como el procesamiento de imágenes para medir el tiempo para que las células se deforman a través de una serie de constricciones. Incluimosambos diseños de dispositivos y el código de procesamiento de datos como archivos de visión suplementarios. Como una muestra representativa de los datos, se muestra el tiempo de tránsito celular a través de una serie de constricciones como una función del número de constricciones pases. Análisis de la escala de tiempo para que las células tránsito a través constricciones estrechos de un dispositivo de microfluidos puede revelar diferencias en la deformabilidad de una variedad de tipos de células 4,5,13. El dispositivo ha demostrado aquí examina únicamente el tránsito celular a través de una serie de constricciones a escala micrométrica; este diseño emula el tortuoso camino que las células experimentan en circulación y también permite sondear las características físicas adicionales de las células, tales como tiempo de relajación.

<table><tbody><tr><td>Tensioactivo de copolímero de bloque Pluronic F-127 &nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>8409400</td><td>Producido por BASF, también disponible a través de</td></tr><tr><td>la base y el reticulante Sigma PDMS</td><td>Essex Brownell</td><td>DC-184-1.1</td><td>Producto comúnmente llamado Sylgard 184 Elastómero</td></tr><tr><td>Unidad de descarga de plasma de oxígeno</td><td>Enercon</td><td>Dyne-A-Mite 3D Treater</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>Casquillo de apriete con los dedos, 1/32"</td> <td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-113</td><td></td></tr><tr><td>Accesorio de apretón con los dedos, 10-32</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-300X</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polieteretercetona (PEEK), diámetro exterior = 1/32" o 0,79 mm</td><td>Tubo de</td> polietileno (PE-20) Valco <td>TPK.515-25M</td><td></td></tr><tr><td>, 0,043" o 1,09 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de presión</td><td>Airgas o tubo de</td> poliuretano Praxair<td></td><td></td></tr><tr><td>, 5/32" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>5648K284</td><td></td></tr><tr><td>Accesorios de conexión a presión</td><td>McMaster Carr</td><td>5111K91</td><td></td></tr><tr><td>Convertidor electroneumático de voltaje a presión (E/P)</td><td>Omega</td><td>IP413-020</td><td></td></tr><tr><td>16 bits, 250 kS/s, 80 entradas analógicas DAQ multifunción</td><td>National Instruments</td><td>NI PCI 6225-779295-01</td><td></td></tr><tr><td>Conector analógico Terminal de tornillo de bloque</td><td>National Instruments</td><td>SCB-68-776844-01</td><td></td></tr><tr><td>LabView Software de diseño de sistemas</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc.</td>El código <td>R2012a de MATLAB</td><td>requiere el cable blindado de Image Processing Toolbox</td></tr><tr><td></td><td>SHC68-68</td><td></td> de <td>National Instruments</td></tr></tbody></table>

una técnica de microfluidos investigará deformabilidad cell

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Aquí nos detalle el diseño, fabricación y uso de un dispositivo de microfluidos para evaluar la deformabilidad de un gran número de células individuales de una manera eficiente. Típicamente, los datos de ~ 10 2 células pueden ser adquiridos dentro de un experimento 1 hr. Un programa de análisis de imagen automatizado permite eficiente análisis post-experimento de datos de imagen, lo que permite el procesamiento de estar completo dentro de unas pocas horas. Nuestra geometría del dispositivo es único en que las células deben deformarse a través de una serie de constricciones a escala micrométrica, permitiendo de ese modo la deformación inicial y la relajación dependiente del tiempo de las células individuales a ensayar. La aplicabilidad de este método a las células de leucemia promielocítica humana (HL-60) se demuestra. Células de conducción para deformar través constricciones micras escala que utilizan flujo de presión impulsada, observamos que (HL-60) células promielocítica humana momentáneamente ocluyen la primera constricción de un tiempo medio de 9,3 ms antes de pases con mayor rapidez a través de la constricción posterioriones con un tiempo de tránsito promedio de 4,0 milisegundos por constricción. Por el contrario, todo-trans tratado con ácido (tipo de neutrófilos) retinoico células HL-60 ocluyen la primera constricción sólo 4,3 mseg antes de pases a través de las constricciones posteriores con un tiempo de tránsito mediana de 3,3 mseg. Este método puede dar una idea de la naturaleza viscoelástica de células, y finalmente revelar los orígenes moleculares de este comportamiento.

Para investigar la deformabilidad de diferentes tipos de células, células de leucemia mieloide humana (HL-60), células de neutrófilos, células diferenciadas de linfocitos de ratón, y líneas celulares de cáncer de ovario humano (OVCAR8, HEYA8) se evalúan utilizando la técnica de microfluidos la &quot;célula Deformador &#39;. Los resultados representativos para el tiempo de tránsito de la HL-60 células HL-60 y de tipo de neutrófilos muestran la escala de tiempo de una sola célula de tránsito a través de una serie de const...

Se demuestra un ensayo basado en microfluídica para medir la escala de tiempo de tránsito para las células a través de una secuencia de constricciones a escala micrométrica.

Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

El objetivo general del siguiente experimento es investigar la deformabilidad de diferentes tipos celulares utilizando un ensayo sencillo basado en microfluídica. Esto se logra fabricando un dispositivo microfluídico de poli(dimetilsiloxano) o PDMS para analizar la escala temporal del tránsito celular a través de una secuencia de constricciones a escala micrométrica. Luego, se utiliza un flujo impulsado por presión para hacer pasar las células a través de los canales microfluídicos, lo que permite evaluar la deformación y la relajación dependiente del tiempo de células individuales. A continuación, se ejecuta un programa de análisis automatizado de imágenes para procesar los videos y obtener un histograma de los datos de tiempo de tránsito.Los resultados muestran que diferentes tipos celulares presentan diferencias en la deformabilidad celular según su tiempo de tránsito a través de una serie de constricciones. La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes, como la microscopía de fuerza atómica o la aspiración con micropipeta, es que los dispositivos microfluídicos pueden operar con éxito con capacidades de alto rendimiento. Aunque otros dispositivos microfluídicos también pueden utilizarse para evaluar la deformabilidad celular.Diseñamos nuestro dispositivo de manera que las células pasen a través de constricciones secuenciales, una geometría común en contextos fisiológicos como la red capilar pulmonar. Para comenzar, diseñe el dispositivo microfluídico seleccionando un ancho de los canales de la matriz de constricción de aproximadamente entre el 30 y el 50 % del diámetro celular promedio y una altura del canal de al menos el 50 % del diámetro celular. Incluya un filtro en las entradas para eliminar restos y desagregar los cúmulos celulares.Antes de comenzar el experimento, fabrique la plantilla del dispositivo utilizando técnicas estándar de micro-mecanizado litográfico. Verifique la altura de las características del patrón utilizando un perfilómetro. A continuación, conecte la fuente de aire para flujo impulsado por presión usando un tanque de aire comprimido y una serie de reguladores y accesorios para aire.Primero configure un tanque de suministro de aire y un regulador manual. Luego, instale un regulador de presión controlado electrónicamente en línea con el regulador manual. Utilice el código sencillo escrito en LabVIEW para ingresar la presión deseada.El convertidor electro-neumático utiliza un bucle interno de retroalimentación para ajustar la presión de salida de la válvula y que coincida con la presión especificada a través del dispositivo microfluídico. Configure una cámara presurizada para impulsar el flujo de la suspensión celular ensamblando una cámara de suspensión celular a partir de un tubo estándar de citometría de flujo y una tapa mecanizada que crea un sello hermético sobre el tubo. La tapa de la cámara de presión contiene dos orificios: una entrada que se conecta al tanque de aire comprimido y una salida a través de la cual las células fluyen desde la cámara presurizada hacia el dispositivo.A continuación, prepare un microscopio invertido equipado con una cámara que tenga una velocidad de adquisición de al menos 100 fotogramas por segundo. Para capturar imágenes de las células que fluyen a través de la matriz de constricciones, prepare una solución stock de surfactante en solución salina tamponada con fosfato o PBS, ya que agregar una pequeña cantidad de surfactante a la solución de medio celular ayudará a minimizar la adhesión celular a las paredes de PDMS. Para fabricar el bloque de PDMS con canales microfluídicos, agregue un gramo de agente de curado a 10 gramos de base de PDMS y mezcle bien.Vertir la mezcla sobre el dispositivo. Desgasificar el molde en una campana de vacío con vacío aplicado hasta que desaparezcan las burbujas atrapadas, o durante aproximadamente 10 a 20 minutos. Después de este tiempo, aún pueden quedar burbujas en la interfase AIRE-PDMS, lo cual es normal.Estos generalmente se disiparán durante el horneado. Luego, hornee el dispositivo de desgasificación a 65 grados Celsius durante cuatro horas después de que el dispositivo haya enfriado. Retire los dispositivos microfluídicos del molde maestro.Comience levantando suavemente una esquina del dispositivo. Pelar lentamente y con cuidado, en lugar de levantar el bloque de PDMS directamente hacia arriba, reduce el estrés tanto en el PDMS como en el molde maestro. Corte dispositivos microfluídicos individuales del bloque de PDMS con una cuchilla de afeitar y retire el dispositivo del molde maestro. Haga orificios en el dispositivo de PDMS para crear puertos de conexión que permitan el acceso entre los tubos y los microcanales. Cree orificios desde el lado del canal hasta el lado exterior del dispositivo utilizando un punzón de biopsia.Lave el dispositivo de PDMS con isopropanol para eliminar el polvo y trozos sueltos de PDMS. Asegúrese de que los orificios perforados estén libres de residuos dirigiendo un flujo constante de isopropanol puro desde una botella de presión a través de los orificios. Sopla seco con aire filtrado.Limpie el sustrato de vidrio enjuagándolo con metanol. Luego séquelo con aire filtrado y colóquelo en una placa caliente de 200 grados Celsius durante cinco a 10 minutos para asegurar que el vidrio esté completamente limpio y seco antes del tratamiento con plasma. Como se describe en el protocolo escrito, inspeccione el dispositivo microfluídico bajo un microscopio.Asegúrese de que los canales no estén colapsados ni dañados, y de que ambos orificios de entrada y salida se conecten directamente a los canales del dispositivo utilizando un objetivo de baja potencia. Coloque la suspensión celular en un tubo para citómetro de flujo y conéctelo al tapón de presión antes de conectar el tubo al dispositivo microfluídico; ajuste la presión a aproximadamente entre 14 y 21 kilopascales y realice una purga hasta que la suspensión celular emerja desde la punta del tubo. A continuación, coloque el dispositivo sobre una superficie plana para insertar el tubo en la entrada del dispositivo.Dado que la cubreobjetos de vidrio unida a la parte inferior del dispositivo de PDMS es frágil, inserte la punta del tubo que contiene la suspensión celular en la entrada del dispositivo. Luego, inserte un trozo de tubo en el puerto de salida y diríjalo hacia un tubo vacío para la recolección de desechos, como un tubo Falcon vacío sujeto con cinta al costado del platino del microscopio.Aumente suavemente la presión hasta aproximadamente 28 kilopascales o hasta que las células fluyan a través de los canales. Coloque el dispositivo de manera que múltiples canales estén dentro del campo de visión y sean perpendiculares al fondo de la pantalla. Para comenzar el análisis de datos, abra el archivo maestro de script m y ejecute el programa.Seleccione el primer video que se analizará en la ventana del Explorador de Windows que aparece. Especifique la velocidad de fotogramas para el video seleccionado y presione enter. Aparecerá una figura que solicitará al usuario que seleccione una ventana rectangular de recorte.Para el primer video, seleccione una ventana que abarque todos los canales de izquierda a derecha e intersecte los canales justo por encima del primer bulbo del arreglo de canales. En la parte superior e inferior, seleccione las regiones de constricción a partir de la imagen recortada. El algoritmo muestra la segmentación de las células para los primeros 50 fotogramas de cada video.Observe atentamente la imagen en la parte superior izquierda para determinar si el algoritmo está localizando con precisión las células. Una imagen superpuesta se superimpone al video original. Para demostrar la ubicación de las células identificadas, seleccione el siguiente video que se procesará desde la ventana del Explorador de Windows.El algoritmo se repetirá. Para cada video seleccionado, seleccione cancelar. Una vez que todos los videos deseados se hayan agregado mediante la ventana del Explorador de Windows para indicar que la lista de videos está completa, los resultados representativos para el tiempo de tránsito de células HL 60 y de tipo neutrófilo HL 60 muestran la escala de tiempo que una sola célula tarda en atravesar una serie de constricciones.Se mide el tiempo para una población de células individuales en cada constricción de siete micrómetros en una serie de siete constricciones. Con una presión impulsora de 28 kilopascales, las células HL 60 obstruyen temporalmente la primera constricción durante un tiempo mediano de 9,3 milisegundos antes de atravesar las constricciones subsiguientes. En contraste, las células HL 60 de tipo neutrófilo obstruyen la primera constricción durante solo 4,3 milisegundos antes de atravesarlas.Una vez que atraviesan la primera constricción, las células pasan más rápidamente por las constricciones restantes, de la dos a la siete, con un tiempo mediano de tránsito de 4,0 milisegundos para las células HL 60 y de 3,3 milisegundos para las células tipo neutrófilo. Al comparar el tiempo de tránsito entre poblaciones celulares, pueden revelarse diferencias en la deformabilidad celular. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo medir la deformabilidad de diferentes tipos celulares utilizando el sencillo ensayo microfluídico.Aquí, se utiliza un flujo impulsado por presión para hacer pasar células a través de canales microfluídicos, lo que permite ensayar la deformación y relajación de células individuales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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