Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell

El objetivo general del siguiente experimento es investigar la capacidad de deformación de diferentes tipos de células utilizando un ensayo simple basado en microfluídica. Esto se logra mediante la fabricación de un dispositivo microfluídico de polidimetil suboxano o PDMS para sondear la escala de tiempo del tránsito celular a través de una secuencia de constricciones a escala de micras. El flujo impulsado por la presión se utiliza para impulsar las células a través de sus canales microfluídicos, lo que permite analizar la deformación y la relajación dependiente del tiempo de las células individuales. A continuación, se ejecuta el programa automatizado de análisis de imágenes para procesar los vídeos y obtener un histograma de los datos de tiempo de tránsito.

Los resultados muestran que los diferentes tipos de células exhiben diferencias en la capacidad de deformación celular en función de su tiempo de tránsito a través de una serie de constricciones. La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como la microscopía de fuerza atómica o la aspiración con micropipetas, es que los dispositivos microfluídicos pueden funcionar con éxito con altas capacidades de rendimiento. Mientras que otros dispositivos microfluídicos también se pueden utilizar para analizar la deformabilidad de las células.

Diseñamos nuestro dispositivo para que las células pasen a través de constricciones secuenciales, una geometría común en contextos fisiológicos como el lecho capilar pulmonar. Para comenzar, diseñe el dispositivo microfluídico seleccionando el ancho de los canales de la matriz de constricción para que sea aproximadamente del 30 al 50% del diámetro promedio de la celda y la altura del canal para que sea al menos el 50% del diámetro de la celda. Incluya un filtro en los puertos de entrada para eliminar los residuos y desagregar los clústeres de celdas.

Antes de comenzar el experimento, fabrique el maestro del dispositivo utilizando técnicas estándar para el micromecanizado litográfico. Verifique la altura de las entidades del patrón utilizando un perfilómetro. A continuación, repare la fuente de aire para el flujo impulsado por presión utilizando un tanque de aire comprimido y una secuencia de reguladores y accesorios de aire.

Primero configure un tanque de suministro de aire y un regulador manual. A continuación, configure un regulador de presión controlado electrónicamente en línea con el regulador manual. Utilice el código simple escrito en LabVIEW para ingresar la presión deseada.

El convertidor electroneumático utiliza un bucle de retroalimentación interno para ajustar la presión de salida de la válvula para que coincida con la presión especificada en todo el dispositivo microfluídico. Configure una cámara presurizada para impulsar el flujo de la suspensión de la celda ensamblando una cámara de suspensión de celda a partir de un tubo de citómetro de flujo estándar y una tapa mecanizada que crea un sello hermético a la presión en el tubo. La tapa de la cámara de presión contiene dos orificios, una entrada que se conecta al tanque de aire comprimido y una salida a través de la cual las celdas fluyen desde la cámara presurizada hacia el dispositivo.

A continuación, configure un microscopio invertido equipado con una cámara que tenga una velocidad de adquisición de al menos 100 fotogramas por segundo. Para capturar imágenes de las células que fluyen a través de la matriz de constricción, prepare una solución de surfactante en solución salina tamponada con fosfato o PBS, ya que agregar una pequeña cantidad de surfactante a la solución de medios celulares ayudará a minimizar la adhesión de las células a las paredes del PDMS. Para fabricar el bloque de PDMS con canales microfluídicos, agregue un gramo de agente de curado a 10 gramos de base de PDMS y mezcle bien.

Vierta la mezcla sobre el dispositivo. Maestro Degas en una campana de cristal con vacío aplicado hasta que las burbujas atrapadas desaparezcan, o durante unos 10 a 20 minutos. Después de este tiempo, es posible que todavía haya burbujas en la interfaz de AIR PDMS, lo cual es normal.

Por lo general, estos se disiparán durante el horneado. A continuación, hornee el dispositivo Degas a 65 grados centígrados durante cuatro horas después de que el dispositivo se haya enfriado. Retire los dispositivos microfluídicos del molde maestro.

Comience levantando suavemente una esquina del dispositivo. Pelado lento y suave en lugar de levantar El bloque PD DMS directamente reduce la tensión tanto en el PDMS como en el maestro Corte los dispositivos microfluídicos individuales del bloque PDMS con una cuchilla de afeitar y retire el dispositivo del maestro Perfore los orificios en el dispositivo PDMS para crear puertos de conexión para el acceso entre los tubos y los microcanales. Cree orificios desde el lado del canal hasta el lado exterior del dispositivo con un punzón de biopsia.

Enjuague el dispositivo PDMS con isopropanol para eliminar el polvo y los trozos de PDMS. Asegúrese de que los orificios perforados estén libres de residuos dirigiendo un flujo constante de isopropanol puro de una botella exprimible a través de los orificios. Secar con aire filtrado.

Limpie el sustrato de vidrio enjuagando con metanol. A continuación, séquelo con aire filtrado y colóquelo en una placa calefactora a 200 grados centígrados durante cinco a 10 minutos para asegurarse de que el vidrio esté completamente limpio y seco antes del tratamiento con plasma. Como se detalla en el protocolo de texto, inspeccione el dispositivo microfluídico bajo un microscopio.

Asegúrese de que los canales no estén colapsados o rotos, y que los orificios de entrada y salida se conecten directamente a los canales del dispositivo mediante el uso de un objetivo de baja potencia. Coloque la suspensión celular en un tubo de citómetro de flujo y conéctelo a la tapa de presión antes de conectar el tubo al dispositivo microfluídico, ajuste la presión a aproximadamente 14 a 21 kilopascales y enjuague hasta que la suspensión celular emerja de la punta del tubo. A continuación, coloque el dispositivo sobre una superficie plana para insertar el tubo en la entrada del dispositivo.

Como la cubierta de vidrio, la cubierta de vidrio se adhiere a la parte inferior del dispositivo PDMS es frágil. Inserte la punta del tubo que contiene la suspensión de la celda en la entrada del dispositivo. A continuación, inserte un trozo de tubo en el puerto de salida y diríjalo a un tubo vacío para la recogida de residuos, como un tubo Falcon vacío pegado con cinta adhesiva al lateral de la platina del microscopio.

Aumente suavemente la presión a unos 28 kilopascales o hasta que las células fluyan a través de los canales. Coloque el dispositivo de modo que haya varios canales en el campo de visión y sean perpendiculares a la parte inferior de la pantalla. Para comenzar el análisis de datos, abra el archivo m del script maestro y ejecute el programa.

Seleccione el primer vídeo que se va a analizar en la ventana del Explorador de Windows que aparece. Especifique la velocidad de fotogramas del vídeo seleccionado y pulse Intro. Aparecerá una figura que solicita al usuario que seleccione una ventana de recorte rectangular.

Para el primer vídeo, seleccione una ventana que abarque todos los canales de izquierda a derecha y que intersecte los canales justo encima de la primera bombilla de la matriz de canales. En la parte superior e inferior, seleccione las regiones de constricción de la imagen recortada. El algoritmo muestra la segmentación de las celdas de los primeros 50 fotogramas de cada vídeo.

Supervise de cerca la imagen superior izquierda para determinar si el algoritmo está ubicando células con precisión. Una imagen izada se superpone al vídeo de origen. Para demostrar la ubicación de las celdas identificadas, seleccione el siguiente vídeo que se procesará en la ventana del Explorador de Windows.

El algoritmo se repetirá. Para cada vídeo seleccionado, seleccione Cancelar. Una vez que se han agregado todos los videos deseados a través de la ventana del Explorador de Windows para indicar a la función que la lista de videos está completa, los resultados representativos para el tiempo de tránsito de las celdas HL 60 y de tipo de neutrófilos HL 60 muestran la escala de tiempo para que una sola celda transite a través de una serie de tránsito.

El tiempo se mide para una población de células individuales en cada constricción de siete micrómetros en una serie de siete constricciones. A una presión de conducción de 28 kilopascales, las células HL 60 ocluyen temporalmente la primera constricción durante un tiempo medio de 9,3 milisegundos antes de empaquetarse a través de las constricciones subsiguientes. Por el contrario, las células de neutrófilos tipo HL 60 ocluyen la primera constricción durante solo 4,3 milisegundos antes del empaquetamiento.

Una vez atravesada la primera constricción, las células transitan más rápidamente a través de las constricciones restantes de dos a siete, con un tiempo de tránsito medio de 4,0 milisegundos para las células HL 60 y de 3,3 milisegundos para las células de tipo neutrófilos. Al comparar el tiempo de tránsito entre las poblaciones de células, se pueden revelar diferencias en la informabilidad de las células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la capacidad de deformación de diferentes tipos de células utilizando el ensayo microfluídico simple.

Aquí, el flujo impulsado por presión se utiliza para impulsar las células a través de canales microfluídicos, lo que permite analizar la deformación y relajación de las células individuales.