Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes precisas de los endosomas en un espacio tridimensional a lo largo del tiempo o en cuatro dimensiones. Esto se logra diseccionando primero los músculos de la serpiente y colocando el tejido en la placa de imágenes. El segundo paso es teñir el tejido con tintes vitales para estimular la formación de endosomas.

A continuación, se obtienen imágenes de la preparación en cuatro dimensiones para una o más uniones neuromusculares. El paso final es un análisis cuidadoso de los datos para caracterizar el comportamiento de los macroendosomas. En última instancia, la presencia y el movimiento de los endosomas a lo largo del tiempo dentro del espacio presináptico se pueden demostrar mediante imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones.

La principal ventaja de esta técnica es que el músculo abdominal de la serpiente tiene un solo grosor de fibra, lo que permite generar imágenes de alta calidad utilizando microscopía de epifluorescencia estándar. El tejido reptiliano debe mantenerse a bajas temperaturas, para que permanezca fisiológico durante más tiempo y con menos contaminación bacteriana. Para la tinción de tinte vital lisosomal, el tinte se disuelve de uno a 5, 000 en una solución fría de ringers reptilianos.

Para obtener una concentración final de 0,2 micromolares, agregue el tinte al tejido e incube a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Después de 15 minutos, lave el pañuelo varias veces con timbres fríos para todas las tinciones de FM 1 43. Premonte la muestra en una placa de imágenes con clavijas magnéticas antes de la tinción.

A los efectos de este vídeo, solo se demostrará la tinción con FM 1 43 mediante la estimulación con cloruro de potasio. El colorante diluido de uno a 500 en anillos de cloruro de potasio con alto contenido de potasio para obtener una concentración final de siete micromolares se agrega al tejido, y luego el tejido se incuba a cuatro grados centígrados durante un máximo de 30 a 60 segundos. Posteriormente, lavar rápidamente tres veces con timbres fríos durante aproximadamente un minuto por enjuague.

Todos los tejidos deben ser fotografiados tan pronto como sea posible después de ser teñidos y lavados con una solución fría de ringer. Si se utiliza un microscopio invertido, utilice una cámara de imágenes cuya parte inferior contenga un cubreobjetos redondo y delgado. Por lo general, la cámara de imágenes debe tener un fondo delgado de acero inoxidable con un diámetro de 25 milímetros.

Cubierta de vidrio de espesor número uno en el centro para configurar la preparación para la imagen. Oriéntelo con alfileres magnéticos de modo que el músculo quede lo mejor posible centrado dentro de la placa de imagen y lo más plano posible. Cubrir la preparación con un pequeño volumen de solución de timbre.

Monta el plato, colocándolo lo más cerca posible del centro del escenario. Elija un objetivo adecuado para obtener la resolución 3D más alta posible. Se utilizará un objetivo de agua de 63 x para todos los experimentos de esta demostración.

Para comenzar este procedimiento, abra la ventana de imágenes en el libro de diapositivas 5.0. Aquí hay varios menús en pestañas. Elija el objetivo de agua 63 x usando la segunda pestaña Z.Establezca el intervalo de pila Z.

En este ejemplo, se utiliza un paso Z de 1,5 micras para la obtención de imágenes en directo. Seleccione la velocidad de fotogramas de lapso de tiempo. Una velocidad óptima es aquella que es adecuada para resolver sin problemas los cambios con el tiempo, como las interacciones de movimiento o los eventos de fusión.

Por ejemplo, 10 puntos de tiempo a intervalos 32 para un intervalo de tiempo total de cinco minutos. A continuación, seleccione la profundidad de campo total mientras muestra el terminal en vivo enfocado manualmente a la parte superior del foco de interés, y luego vaya un poco por encima de él. Seleccione el decodificador.

Enfoque lentamente a través de la muestra hasta que todo esté fuera de foco. De nuevo, el número de planos y los valores totales de recorrido mostrados indicarán la profundidad de campo seleccionada en la ventana de captura. Seleccione el botón de opción de las posiciones superior e inferior utilizado para transferir los parámetros que acaba de seleccionar Para la captura de imágenes, inicie la adquisición de imágenes.

Complete todas las imágenes en vivo para una preparación en particular. Conserve todos los archivos de datos sin procesar, mientras que el almacenamiento digital no suele ser un problema. El tiempo de procesamiento es significativo incluso con computadoras personales o estaciones de trabajo rápidas.

Por este motivo, recortar imágenes en una región de interés garantiza que toda la región de interés esté en la ventana recortada durante todo el tiempo. El curso D puede implicar pilas de imágenes utilizando el software adecuado y la función de dispersión de puntos correcta, confirmar que la resolución ha mejorado y que el algoritmo de deconvolución no ha generado ningún artefacto. Utilice un algoritmo de interpolación para expandir el eje Z.

Resolución aparente, se sugiere una expansión de seis veces desde una separación real del plano de la imagen de 1,5 micras a una separación aparente de 0,25 micras. Realice el brillo del contraste, el filtrado de ruido, el blanqueo de fotos y otros ajustes típicos del procesamiento de imágenes. Si lo desea.

Los estándares de manipulación de imágenes dictan que para la mayoría de los trabajos científicos, es apropiado que se apliquen las mismas correcciones a todas las imágenes, tanto dentro de una pila como en diferentes puntos de tiempo. La consecuencia de un ajuste particular debe evaluarse entre todas las imágenes. Experimenta con varias técnicas de filtrado y mejora de imágenes.

Por ejemplo, los lelos y el filtrado son útiles para aumentar el contraste de pequeñas estructuras sobre el fondo. El brillo de los píxeles en el centro de una ventana en ejecución se mejora, mientras que el brillo de las áreas circundantes se reduce. Tenga en cuenta que algunos métodos de filtrado no funcionan bien en combinación.

Aplique la corrección de deriva si hay un movimiento sustancial de la preparación con el tiempo. Este tipo de movimiento es común en el músculo vivo, incluso con fármacos añadidos para suprimir los potenciales de acción y los potenciales sinápticos. Un algoritmo de registro de píxeles alinea las imágenes de lapso de tiempo y puede reducir, pero generalmente no eliminar por completo dicho movimiento.

En este estudio, se utilizaron cuatro imágenes D en vivo de terminales neuromusculares de serpientes para determinar si los macroendosomas o yo se mueven hacia la membrana plasmática y desaparecen rápidamente, lo que sugiere que su número disminuye porque algunos de ellos acceden al cito. Los datos se muestran como vistas de volumen 3D en seis puntos temporales con un intervalo de fotogramas de 60 segundos. Para ilustrar la profundidad Z de un solo butón, se puede observar un me alejándose del eje Y indicado por la línea discontinua roja durante varios fotogramas antes de desaparecer entre los puntos de tiempo cinco y seis, que el tiempo requerido para la desaparición fue menor que el intervalo de fotogramas es consistente con la exocitosis justo antes de la desaparición.

El ME parece estar localizado en la membrana plasmática de los testigos. El mismo conjunto de datos sin procesar se muestra a continuación como una película con un aumento más bajo. La secuencia se detiene brevemente al comienzo de cada 24 pasos de rotación 3D alrededor del eje Y para llamar la atención sobre el yo que pronto va a desaparecer, indicado por la flecha roja.

Tenga en cuenta que el ME es visible, se aproxima al borde del buton desaparece y no regresa en todas las perspectivas de visualización. Debido a la menor resolución del eje Z en comparación con la resolución XY, la forma del ME parece alargarse y acortarse en función de la perspectiva de visualización. Los estudios de microscopía electrónica han demostrado que los endosomas en los terminales motores son de tamaño pequeño cerca del límite de difracción de la luz.

Por lo tanto, la fusión de estos endosomas no se puede distinguir absolutamente de la asociación espacial cercana a nivel de luz. En este estudio, los Mees se marcaron con FM 1 43 indicado en verde y los endosomas ácidos o AE se marcaron con un lisosomal. El tinte vital indicado en rojo, los datos de un punto de tiempo de una película en cuatro D se muestran como vistas de volumen 3D en tres orientaciones.

Los paneles superiores del uno al tres muestran la vista convencional desde arriba del plano XY. Los paneles centrales del cuatro al seis muestran una vista perpendicular al plano XY y en la dirección de la flecha roja grande. Los paneles inferiores del siete al nueve muestran una vista mutuamente perpendicular a las dos vistas de arriba en la dirección de la gran flecha azul.

Un yo está marcado con una flecha verde y dos AE están marcados con flechas rojas. Las estructuras que emiten fluorescencia en ambos colores, apareciendo amarillo, se observaron ocasionalmente en cuatro registros de imágenes D. En este ejemplo, un endosoma que contiene ambos tintes está marcado con una flecha amarilla en los paneles tres, seis y nueve.

La superposición de rojo y verde es igualmente completa en las tres proyecciones ortogonales, lo que indica una supuesta fusión de em me ae. Esta película muestra el mismo conjunto de datos configurado para rotar en el eje Y a un fotograma por segundo. El supuesto MEAE fusionado permanece amarillo desde todas las perspectivas.

La deconvolución digital es una herramienta útil para mejorar la resolución de imágenes 3D y cuatro D. Aquí se muestra una comparación entre los datos brutos y los datos transferidos. Para un terminal nervioso de serpiente típico manchado durante la estimulación con FM 1 43 Una vez dominado, esta técnica se puede realizar en 30 a 60 minutos si se realiza correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica, para responder a preguntas adicionales, como la colocalización de macroendosomas con marcadores presinápticos.