La transección de la médula espinal en el pez cebra larval
21 de mayo de 2014
Después de la transección de la médula, el pez cebra adulto tenga la recuperación funcional a las seis semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas de la transparencia de las larvas y una recuperación más rápida, se presenta un método para seccionar la médula espinal de las larvas. Después de transección, se observa la recuperación sensorial a partir de los 2 días después de la lesión, y el movimiento C-doble por 3 días después de la lesión.
El objetivo general de este procedimiento es garantizar una sección completa de la médula espinal en el pez cebra larvario mediante un método relativamente de alto rendimiento y reproducible, al tiempo que se maximiza la supervivencia. Esto se logra primero apareando adultos del genotipo adecuado y realizando el cribado según sea necesario. El segundo paso consiste en criar los embriones hasta los cinco días posteriores a la fertilización.
A continuación, realice la transección con una pipeta de microinyección biselada. Finalmente, se permite que los peces lesionados se recuperen en medio tratado con antibióticos hasta el final del experimento. En última instancia, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia para mostrar la respuesta de los progenitores neuronales a la lesión.
Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como los desarrollados por los laboratorios Becker y Fetcher, incluyen un mayor número de animales para estudiar, un tiempo de recuperación más corto y el uso de herramientas genéticas que de otro modo no estarían disponibles en el pez cebra adulto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración, como la respuesta de los progenitores neuronales a la lesión. Comience los preparativos elaborando placas quirúrgicas utilizando placas de Petri de 60 milímetros y el kit de elastómero de silicona Cell Guard 180 4.
Según las instrucciones del fabricante, llene los recipientes hasta no más de la mitad y déjelos polimerizar. Luego, guarde los recipientes tapados a temperatura ambiente.
A continuación, fabrique micropipetas calentando y estirando tubos capilares delgados de borosilicato en un estirador de micropipetas, utilizando los mismos parámetros empleados para fabricar agujas de microinyección bajo un microscopio estereoscópico. Utilice pinzas para romper la punta de la micropipeta hasta alcanzar un diámetro aproximado de 200 micrones. Luego, biselar el borde roto con una microamoladora, inicialmente a 35 grados, seguido de un segundo biselado a 25 grados cuando cese el ruido de molienda.
Revise bajo un microscopio estereoscópico para asegurarse de que la punta sea afilada y lisa. Usar una punta demasiado ancha tiende a provocar una mayor cantidad de muertes debido al mayor riesgo de dañar la aorta dorsal. Mientras que una punta demasiado estrecha tiende a deslizarse sobre la piel en lugar de cortar el tejido, guarde las micropipetas correctamente biseladas en una placa de Petri sobre una pequeña cantidad de arcilla siete días antes de la cirugía.
Prepare tanques de apareamiento con peces macho y hembra spr. Los peces recolectan los embriones fertilizados a la mañana siguiente, tres horas después de que se enciendan las luces. Para asegurar el rendimiento máximo.
Si se utiliza una línea transgénica de reportero con genotipos mixtos, coloque 100 embriones por placa e incube las placas a 28,5 grados Celsius. Si se utiliza una línea de reportero, examine los embriones en busca de expresión fluorescente a las 48 horas posteriores a la fertilización.
Deje que los embriones fluorescentes maduren a 28,5 grados Celsius hasta las larvas o cinco días posteriores a la fertilización. Prepare la placa quirúrgica cubriendo la celda protectora con E dos y 10 miligramos por litro de sulfato de gentamicina y trica. Además, prepare un recipiente de recuperación añadiendo 25 mililitros de E dos y sulfato de gentamicina a una placa de Petri de 100 milímetros.
El siguiente paso consiste en preparar un mango de bisturí pegando tres torundas. Esto forma una herramienta triangular con tres surcos. A continuación, sujete la micropipeta preparada sobre las torundas fijándola con cinta en uno de los surcos para completar el bisturí; coloque la micropipeta aparte hasta que sea necesaria.
Comience la cirugía anestesiando una placa de 25 larvas a la vez. Con trica, los peces están suficientemente anestesiados cuando ya no exhiben respuesta al tacto. Transfiera las larvas a una placa quirúrgica y coloque la placa bajo un microscopio estereoscópico.
Bajo el máximo aumento, gire una larva de modo que quede de lado, con su espalda más cercana a la mano que sostiene el escalpelo. Coloque la pinza de modo que descanse sobre el protector celular. Inclinada sobre el ancho de la larva, apoye el escalpelo de vidrio contra uno de los brazos de la pinza.
Corte en la cara lateral dorsal de las larvas a nivel del poro anal. Asegúrese de no cortar más allá del borde ventral de la médula espinal. Luego gire el bisturí para seccionar la médula espinal.
El giro requerido suele ser mucho menor a 90 grados. Repita la transección de la médula espinal con las larvas restantes. Una vez que la cirugía en el grupo de larvas esté completa, utilice una pipeta posterior y una bomba de pipeteo para transferir los animales lesionados a la placa de recuperación.
Para eliminar la anestesia, asegúrese de recoger primero la cabeza o la cola de la larva durante la transferencia. No estrese el sitio de la lesión doblando las larvas después de que la anestesia haya desaparecido. Transfiera las larvas lesionadas desde la placa de recuperación a placas de 100 milímetros llenas con 25 mililitros de E dos y sulfato de gentamicina a una densidad de 25 larvas por placa.
Luego, colóquelos en un incubador a 28,5 grados Celsius mientras la herida cicatriza. Revise las placas diariamente. Retire cualquier animal enfermo o muerto.
No cambie el medio hasta que los alojamientos de protozoos de agua dulce sean visibles en el medio. Al cambiar el medio, no transfiera el pez a una nueva placa. En su lugar, retire la mayor cantidad posible de medio e inunde la misma placa con medio nuevo.
Repita el cambio de medio según sea necesario para reducir la población de coops. Alimente a las larvas diariamente con una pequeña cantidad de alimento en polvo para alevines. Aquí se muestra un pez cebra con la médula espinal completamente seccionada a un día.
Después de la lesión, la GFP se expresa en todas las neuronas, y la flecha amarilla identifica el sitio de la lesión. Aquí se muestra un pez cebra con la médula espinal completamente seccionada a los tres días posteriores a la lesión. Este pez cebra etiquetado con UCD fijado muestra una médula espinal completamente seccionada.
La flecha amarilla vuelve a identificar el sitio de la lesión. En contraste, la región contigua de marcado de neuronas a lo largo del borde ventral de la médula espinal. En este pez cebra fijado a los tres días posteriores a la lesión, se indica una transección incompleta.
Una vez dominada, esta técnica permite procesar 300 larvas por hora.
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Descripción general
Este estudio presenta un método para la transección de la médula espinal en pececillos de cebra larvales, aprovechando su transparencia y recuperación rápida. Tras la transección, se observa la recuperación sensorial tan pronto como 2 días después de la lesión, con movimientos en C evidentes a los 3 días posteriores a la lesión.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Regenerativa
- Modelos de pez cebra
Antecedentes
- Las lesiones de la médula espinal presentan desafíos significativos en la recuperación.
- El pez cebra es un modelo valioso para estudiar la regeneración de la médula espinal.
- Las larvas de pez cebra ofrecen ventajas debido a su transparencia y curación rápida.
- Comprender los mecanismos de recuperación puede orientar estrategias terapéuticas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método reproducible para la transección de la médula espinal en pececillos cebra larvales.
- Evaluar la cronología y los mecanismos de recuperación tras la lesión.
- Utilizar microscopía de inmunofluorescencia para evaluar las respuestas neuronales.
Métodos Utilizados
- Apareamiento de peces cebra adultos del genotipo adecuado.
- Tamizado y crianza de embriones hasta cinco días después de la fertilización.
- Sección realizada utilizando una pipeta de microinyección biselada.
- Recuperación de los peces lesionados en medio tratado con antibióticos.
Resultados principales
- Recuperación funcional observada a las seis semanas posteriores a la lesión.
- La recuperación sensorial comienza a los 2 días posteriores a la lesión.
- El movimiento de flexión en C se observa a los 3 días posteriores a la lesión.
- La microscopía de inmunofluorescencia revela la respuesta de los progenitores neuronales.
Conclusiones
- El método permite la sección efectiva de la médula espinal en pez cebra larval.
- La recuperación rápida proporciona información sobre la regeneración de la médula espinal.
- Los hallazgos podrían contribuir a comprender los mecanismos de reparación neural.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los peces cebra larvales permiten una evaluación rápida y de alto rendimiento de la regeneración de la médula espinal, ofreciendo un modelo complementario a los sistemas adultos para la reducción de riesgos mecanicistas en etapas tempranas. El método apoya la validación de objetivos al proporcionar lecturas cuantificables de recuperación funcional y sensorial en cuestión de días, acelerando la evaluación preclínica de candidatos neurorestauradores. Este enfoque mejora la confianza predictiva en la interacción con el objetivo y la modulación de vías antes de la optimización del fármaco líder.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas relacionadas con el rebrote axonal y la iniciación de la neurogénesis.
- Valor operativo: Proporciona métricas reproducibles de sección y recuperación para una evaluación consistente del acoplamiento al objetivo.
- Valor predictivo: Las lecturas tempranas de función sensorial y motora apoyan la validación funcional del objetivo y la reducción de riesgos en la vía.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Preparación para ensayos: Genera modelos estandarizados de lesión adecuados para el cribado de compuestos y el análisis de respuesta a la dosis.
- Resultados cuantitativos: Permite la medición del inicio de la recuperación sensorial (2 dpi), el movimiento de doblez en C (3 dpi) y la reanudación de la natación (5 dpi) como puntos finales funcionales.
- Escalabilidad: Permite procesar hasta 300 larvas por hora, facilitando campañas de cribado de mediano rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela mecanismos conservados de regeneración relevantes para la fisiopatología de la lesión medular humana.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos de descubrimiento con validación preclínica mediante lecturas compartidas de respuesta de progenitores neurales.
- Avance ajustado al riesgo: Permite tomar decisiones tempranas de continuar o descartar basadas en la cinética de recuperación funcional, reduciendo el riesgo de fracaso en etapas avanzadas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar un modelo de vertebrado para la validación del blanco y el cribado mecanicista antes de la identificación del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre dianas neuroregenerativas mediante cronogramas observables de recuperación sensorial y motora.
- Tamizaje: Proporciona fenotipos estandarizados y cuantificables para evaluar los efectos de compuestos sobre la regeneración.
- Analítica: La microscopía de inmunofluorescencia permite la cuantificación objetiva de la proliferación y migración de progenitores neuronales como biomarcadores mecanicistas.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos en larvas con modelos de pez cebra adulto y mamíferos mediante vías conservadas de regeneración.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la validación iterativa de dianas en múltiples programas neuroregenerativos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos mediante la observación directa de la dinámica de regeneración.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad y la estandarización mediante protocolos definidos de transección y recuperación.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la evaluación funcional temprana de objetivos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos neuroregenerativos basada en la cinética de recuperación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de pez cebra, microcirugía y microscopía de fluorescencia.
- Depende de la preparación de pipetas de microinyección y de la infraestructura para la observación del comportamiento.
- Necesita protocolos estandarizados de anestesia y recuperación entre los equipos.
- Las consideraciones de adaptación incluyen el fondo genético y la compatibilidad con los reporteros transgénicos.
- Las limitaciones prácticas incluyen las restricciones por el tamaño de las larvas y la necesidad de una técnica precisa de transección dorsal-lateral.
