Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones

El objetivo general de este procedimiento es expresar genes de forma transitoria en ratones utilizando la entrega hidrodinámica de genes o HGD para hacer esto. Se pesa a los ratones y se les asigna un volumen adecuado de plásmido que contiene solución salina. El ADN se prepara y se carga en una jeringa.

A continuación, se calienta el ratón para dilatar los vasos sanguíneos de la cola y se coloca en un retenedor utilizando la arteria dorsal. Como referencia, se localizan las venas laterales y se inyecta la mezcla salina de ADN en una de las venas coddle. Finalmente, el ratón se retira del sujetador y se coloca sobre una colchoneta tibia para su recuperación.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la expresión de transgenes a través de la monitorización de los niveles de proteínas en sangre mediante Western blot. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos existentes, como la expresión de transfusiones virales, es que la administración hidrodinámica de genes permite el uso de ADN a cuadros desnudos, que es fácil de producir, seguro de usar y tiene menos limitaciones de tamaño. Soy Daniela Kovacic.

Soy un postdoc en el laboratorio de la Dra. Jane Raper, y voy a demostrar este método. Comience este procedimiento usando un rotulador para marcar la espalda de los ratones blancos para indicar que su grupo experimental vuelve a aplicar las marcas con el tiempo según sea necesario. El día del experimento, pesa a cada ratón individualmente en una bandeja o cubo de pesaje de animales colocado en una balanza de laboratorio digital.

Registre el peso de cada ratón siguiendo las instrucciones del documento adjunto. Prepare suficiente mezcla de inyección para cada ratón que se va a inyectar, más uno, ya que la carga adecuada de las jeringas requerirá una mezcla de inyección adicional. Use solución salina estéril sin conservantes ni endotoxinas que haya sido aprobada para uso humano.

Después de permitir que todas las soluciones alcancen la temperatura ambiente, conecte una aguja estéril de calibre 20 a una jeringa de bloqueo inferior de tres mililitros y aspire la mezcla salina de ADN x. Prepare una jeringa para cada inyección. Asegúrese de no generar burbujas de aire.

Evite el uso de jeringas de mayor volumen, ya que el fluoruro de la inyección no se puede controlar muy bien y es difícil manipular jeringas más grandes con una mano. A continuación, cambie a una aguja estéril de calibre 27. Ajuste el volumen de la mezcla salina de ADN según lo calculado.

Expulsar el exceso de solución de nuevo en el tubo cónico para su uso posterior. Esto llenará la aguja. Sin introducir burbujas de aire.

No permita que la aguja destapada toque ninguna superficie no estéril para proteger la aguja antes de las inyecciones. Recapitula con una técnica con una sola mano. Coloque la tapa sobre una superficie plana y, luego, sin sujetarla con la otra mano, inserte la aguja y presione la aguja tapada contra un objeto firme.

Para asegurar la tapa, prepare todas las jeringas necesarias de la misma manera. Ingrese antes de comenzar las inyecciones. Coloque la jaula del ratón con la ropa de cama incluida en una almohadilla térmica durante cinco minutos para que la temperatura de la ropa de cama sea de aproximadamente 38 a 39 grados centígrados.

Esto dilatará los vasos sanguíneos de los ratones. Tenga en cuenta que no se recomienda la anestesia para este procedimiento mientras los ratones se calientan, use cinta de laboratorio para inmovilizar un protector de acceso dorsal sobre una superficie plana. Después de que hayan pasado cinco minutos, destape la jeringa que se usará para la primera inyección en el ratón.

Coloque la jeringa en la tapa para evitar que la aguja destapada toque superficies sucias. Tanto por seguridad como por limpieza. Mantenga una aguja sin tapar a la vez.

A continuación, coja un ratón por la cola. Colóquelo suavemente en el sujetador e inserte el tapón. Use la menor restricción necesaria para mantener la cola inmovilizada.

Asegúrese de que el ratón respire libremente. A continuación, localice las venas laterales mirando directamente hacia abajo en la parte posterior del ratón. La línea roja que corre en el centro de la cola es una arteria.

Mientras que las líneas azules a ambos lados de la cola son las venas laterales de los mimos, coloque el ratón de modo que una de las venas laterales de los midos sea visible. A continuación, limpie bien la cola del ratón con un hisopo con alcohol. Con la mano que no inyecta, sostenga la cola firmemente entre los dedos índice y medio para que la cola pase por debajo del dedo índice, sobre los dedos medio y tercero, y por debajo del dedo meñique.

Permita que el pulgar permanezca libre para moverse. Con la otra mano, use un hisopo con alcohol para limpiar el área de la inyección. Nuevamente, deje que el área se seque.

Ahora, con la mano inyectora, levante la jeringa cargada y sujétela por el cilindro entre el pulgar y los otros cuatro dedos. No sujete el émbolo. Coloque la jeringa paralela a la cola con la aguja apuntando hacia el cuerpo del ratón y el bisel o borde inclinado de la aguja hacia arriba.

Inserte la aguja en la vena de la cola. Si la vena se ha ubicado correctamente, la aguja se deslizará sin resistencia mientras sostiene la aguja firmemente, use el pulgar de la mano que sostiene la cola para cerrar el cubo de la aguja y presione el cubo contra la cola para mantener la aguja en posición. No aplique una presión extrema y no sujete el eje de la aguja, ya que esto impedirá el flujo de líquido hacia la vena.

A continuación, vuelva a colocar la jeringa con la mano que sostiene la jeringa de modo que el dedo índice y el dedo medio se sujeten a la brida y el pulgar esté en el extremo del émbolo. Presione el émbolo con un movimiento continuo e inyecte el volumen completo de líquido en seis a ocho segundos. Retire la aguja de la vena y, con un pañuelo de papel, aplique una presión suave en la cola para detener el sangrado.

Aquí se muestra el proceso de inyección en tiempo real. Tenga en cuenta que no se recomienda la inserción completa de la aguja debido a un mayor riesgo de cizallamiento de la vena. Después de la inyección, retire el ratón del retenedor y colóquelo en una jaula de recuperación colocada encima de una almohadilla térmica. Si la sala de inyección está fría, este paso es fundamental para la supervivencia del ratón.

Sostén la cola del ratón hasta que el sangrado se detenga por completo. Observe el ratón durante una hora siguiendo la hidrodinámica. Entrega de ADN.

Un período inicial de jadeo e inmovilidad es normal, pero asegúrese de que el ratón muestre signos de recuperación. En aproximadamente cinco minutos después de que el ratón se haya recuperado, devuélvalo a la jaula de alojamiento y asegúrese de que tenga un suministro abundante de comida y agua. A continuación, demostraremos la inyección de la cola utilizando una posición alternativa de la mano.

Este método es particularmente útil cuando es necesario inyectar ratones más cerca de la base de la cola. Por ejemplo, al corregir una inyección fallida el mismo día o al inyectar ratones con colas más cortas, prepare el ratón para la inyección y colóquelo en un restricción. Al igual que antes, apoye la mano que no inyecta sobre una superficie plana con cuatro dedos doblados en un ángulo de 90 grados, los dedos deben descansar uno encima del otro.

Para crear una plataforma, sostenga la cola del mouse entre el pulgar y el dedo que señala. Con la otra mano, limpie el área que se va a inyectar con un hisopo con alcohol. Deja que el área se seque.

Agarre la jeringa de inyección con la mano de inyección en I y sujétela por la brida y el extremo del émbolo para prepararla para la inyección. A continuación, coloque la jeringa paralela a la cola con la aguja apuntando hacia el cuerpo del ratón y el bisel de la aguja hacia arriba. Inyecte como antes para evaluar si la adición de una etiqueta de silbido en ubicaciones específicas de la secuencia interfiere con el procesamiento y la secreción correctos del ABO del babuino.

L una proteína: A los ratones se les inyectó un plásmido portador de uno de los tres genes APO de babuino marcados diferencialmente con hist, y otro plásmido portador de babuino HPR. El éxito de las inyecciones se evaluó mediante análisis de sangre occidental de los niveles circulantes de HPR en la sangre de ratón dos días después de la inyección. Como se muestra aquí, la HPR de babuino se expresó altamente en el plasma de todos, excepto en uno de los ratones transfectados, lo que indica que el HGD tuvo éxito.

Las caídas menores en los niveles de expresión, como se observa en uno de los dos ratones en B APO L uno, su grupo de etiqueta uno, generalmente se atribuyen a una reducción muy pequeña de uno a dos segundos en la velocidad de inyección. Aquí, la línea uno de la muestra de plasma muestra una falta total de expresión de proteínas. Esto indica un fracaso de la HGD, muy probablemente debido a una inyección incompleta del volumen total del vehículo de reparto para evaluar el efecto de su marcaje en B, APO L, también se evaluó una expresión de secreción de la etiqueta silbante, como se ve aquí.

Hubo una ausencia total de proteína marcada con hist detectable en los grupos uno y dos. El único grupo de ratones que tenía niveles detectables de la proteína en su plasma fue el grupo tres. Tomados en conjunto, estos datos indican que la falta de su proteína marcada en los grupos uno y dos es el resultado de diferencias en la expresión génica o el procesamiento de proteínas, más que un fallo de las inyecciones.

También destaca la importancia de incluir una proteína trazadora en la mezcla de inyección para controlar el éxito de la HGD. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar los ratones y las jeringas y cómo insertar la aguja en la vena de la cola para la inyección rápida de ADN temido para expresar genes y ratones mediante la entrega hidrodinámica de genes. El aspecto más difícil de este procedimiento es mantener la aguja en su posición durante toda la inyección.

La aguja correctamente insertada puede quedarse fuera de su posición debido a un movimiento accidental de la persona que la inyecta o del ratón no anestesiado para aumentar las posibilidades de éxito. Evitamos inyectar ratones que pesen más de 27 gramos como manipulación de una jeringa que ha sido cargada a tres ml. La capacidad es más difícil.

Encontramos que los ratones que pesan de 23 a 27 gramos son los más convenientes para inyectar. Las venas de los ratones que pesan menos de 20 gramos pueden ser demasiado pequeñas para inyectarlas.