In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

El objetivo general de este procedimiento es realizar con éxito la estimulación optogenética in vivo del sistema nervioso central de roedores en un animal despierto que se mueve libremente. Esto se logra primero instalando y configurando el sistema láser adecuado para realizar la estimulación optogenética. A continuación, la fibra óptica compatible con las pruebas de comportamiento está configurada para entregar luz láser a una fibra óptica implantada y a la región cerebral de interés que expresa la opsina.

Luego, el animal se ata al sistema láser para la estimulación optogenética y se coloca en un aparato de prueba de comportamiento. Finalmente, los parámetros definidos por el experimentador de la estimulación lumínica para encender o apagar las neuronas se administran mientras el animal realiza una tarea conductual. En última instancia, in vivo, la estimulación optogenética se utiliza para permitir el control en tiempo real de poblaciones definidas de neuronas o circuitos neuronales en animales despiertos que se comportan para determinar su papel funcional en un comportamiento determinado de interés.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que permite el control en tiempo real de poblaciones de neuronas definidas genética y espacialmente en animales despiertos y con la resolución temporal necesaria para relacionar los patrones de actividad neuronal con estados de comportamiento complejos. Este protocolo implica el uso de láseres de clase tres B y requiere que se sigan las pautas adecuadas de capacitación y seguridad. Se deben usar gafas de seguridad en todo momento cuando se operen láseres con procedimientos de alineación que presenten un riesgo especialmente alto después de la configuración del aparato láser de acuerdo con el protocolo de texto, realice el acoplamiento láser de estilo sin contacto del láser azul interno configurando primero los interruptores en la parte posterior del láser para cur para corriente y TTL para transistor modo lógico de transistor para una iluminación constante en la parte delantera del controlador, Asegúrese de que la perilla de encendido esté a cero.

A continuación, encienda el láser encendiendo primero el controlador, seguido de la llave láser. Para garantizar la seguridad ocular, ajuste lentamente la perilla de encendido para que se emita aproximadamente un milivatio de luz láser. Luego espere de 10 a 15 minutos para que el láser se caliente.

A continuación, conecte el probador de cable de fibra óptica directamente al extremo libre del cable de conexión del acoplador y encienda el probador de cables. A continuación, ajuste el ángulo del acoplador para que el haz rojo viaje directamente hacia el centro del espejo dicroico. La trayectoria del haz de luz roja emitida por el comprobador de cable es la trayectoria exacta que deberá seguir la luz láser entrante para acoplarse al láser.

Para realizar una alineación de rumbo, utilice las perillas laterales y horizontales de los espejos cinemáticos para dirigir el haz de luz láser hacia el acoplador. No se preocupe si no se emite ninguna luz azul desde el cable de conexión conectado al acoplador en este momento. Ahora coloque una sola pieza de papel semitranslúcido directamente frente al espejo dicroico entre el dicroico y el acoplador.

Habrá un punto azul y otro rojo en el mismo lado de este papel del láser y del probador de cables, respectivamente. Realice ajustes finos en el primer espejo de dirección ajustando cuidadosamente las perillas laterales y horizontales para alinear el centro del punto rojo con el punto azul. Mueva el papel hacia el acoplador para que quede directamente frente a él y ajuste las perillas del segundo espejo dicroico para alinear el rayo láser con el rayo rojo.

Continúe haciendo ajustes finos en los dos espejos hasta que el centro de los haces azul y rojo estén exactamente alineados. Coline, retire el probador de cables del cable del acoplador. Ahora se debe admitir la luz láser desde el extremo del cable de conexión del acoplador.

Para determinar la eficiencia del acoplamiento, use un medidor de potencia de luz para comparar la potencia de luz que ingresa al acoplador con la potencia de luz emitida desde el extremo de la fibra. Una eficiencia de acoplamiento superior al 80% se considera muy buena mientras se mantiene la posición del espejo dicroico. Utilice los dos espejos de dirección para el láser amarillo exterior y siga el procedimiento de alineación que se acaba de demostrar para acoplar el láser amarillo para configurar una fibra óptica para estimular un solo ratón.

Comience usando el adaptador de soporte F-C-F-C-L conéctelo directamente a la placa de pruebas para conectar el cable de conexión del acoplador a un cable de conexión con camisa gruesa. Conecte una junta giratoria del conmutador a los extremos libres del cable de conexión con camisa gruesa. A continuación, conecte el cable de conexión para animales al conmutador.

Coloque un manguito dividido de conexión en el extremo salvaje de metal libre del cordón de conexión para animales sin forzar el manguito hasta el fondo. Los asilvestrados dejan unos 0,5 centímetros de manga expuesta, ya que es la que se conecta a la fibra óptica fijada al animal con un cable BNC. Conecte el controlador láser azul al generador de pulsos y encienda el generador de pulsos.

Ahora póngase las gafas de seguridad adecuadas. Luego, después de asegurarse de que la perilla de encendido en la parte delantera del controlador esté configurada a cero, encienda el láser encendiendo primero el controlador y luego la llave láser con el láser configurado en modo positivo TT L. Ajuste lentamente la perilla en la parte frontal del láser y use un medidor de potencia de luz para establecer una emisión de potencia de luz de cinco a 10 milivatios desde la punta del cable de conexión para animales.

Consulte el protocolo de texto para obtener detalles adicionales sobre esta configuración. Cambie el láser azul al modo analógico para la estimulación in vivo y espere de 10 a 15 minutos para que el láser se caliente. A continuación, sujete suavemente el ratón y conecte la funda dividida del cordón de conexión del animal a la fibra implantable crónica.

Asegúrese de que los extremos de ambas fibras hagan contacto físico entre sí utilizando la división en el manguito de conexión como una ventana para visualizar el contacto directo entre las dos. Permita que el mouse se recupere durante unos minutos antes del inicio de las pruebas de comportamiento. Luego coloque al animal en el aparato de prueba de comportamiento, asegurándose de que el cable conector esté libre de enganches.

Utilice el generador de pulsos para pulsar un láser azul a una frecuencia predeterminada que activará la opción de elección. Después de completar el experimento, confirme histológicamente la colocación viral y de fibras como se describe en el protocolo de texto adjunto para una interpretación precisa de los resultados conductuales. Bajo un microscopio, verifique el sitio de expresión de opsina y el implante de fibra y confirme visualmente la ubicación adecuada de la inyección del virus y el implante en función de las coordenadas elegidas.

En este ejemplo de resultados conductuales obtenidos a través de estimulación optogenética in vivo, se transducieron neuronas dopaminérgicas en el área ventral o VTA de ratones crema de tirosina hidroxilasa con una función escalonada estable OPSINA o EYFP como virus controlado y se implantó crónicamente un implante de fibra. Se estimularon grupos de ratones simultáneamente y se registró el comportamiento locomotor durante una hora, como se demuestra aquí. La estimulación repetida del ratón ops y transducido a la izquierda dio como resultado un fenotipo hiperactivo que persistió durante toda la estimulación.

Si bien no se observó ningún cambio en el comportamiento locomotor en el ratón de control de la derecha después de las pruebas de comportamiento, se realizó inmunohistoquímica para verificar la orientación viral precisa a las neuronas dopaminérgicas VTA y la colocación de las fibras se confirmó visualmente como se muestra en esta figura una vez dominado. Esta técnica se puede utilizar para manipular la actividad neuronal en cualquier región del cerebro de interés en combinación con una variedad de pruebas de comportamiento como una lectura funcional de la modulación del circuito neuronal.