Name: Hot Catálisis Biológica: Calorimetría de titulación isotérmica para caracterizar las reacciones enzimáticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Aprende a usar la calorimetría de titulación isotérmica para caracterizar reacciones enzimáticas mediante la medición del flujo de calor. Este método sin etiquetas determina parámetros cinéticos como kcat y km con muestras mínimas.

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1. Muestras Preparación <ol><li> Preparar 2 ml de solución de enzima y 0,5 ml de solución de sustrato para cada prueba experimental. Diluir las soluciones madre concentradas de enzima y sustrato en soluciones tampón que tiene composición idéntica a minimizar el calor de dilución y mezcla durante la adición de sustrato. <ol><li> Elija las condiciones de tampón que sean adecuados para evitar el cambio de pH durante el experimento. Por ejemplo, 20 mM de HEPES pH 7 es adecuado para mediciones a pH neutro. NOTA: Si el intercambio de protones está involucrado, entalpías de protonación de los tampones utilizados deben ser considerados, ya que afectan el delta H medido de la reacción. Posibles efectos específicos de la memoria intermedia o aditivos moléculas en el sistema bajo análisis deben tenerse en cuenta. Si disolventes orgánicos (por ejemplo, DMSO) se incluyen en la solución de enzima, añadirlos a exactamente la misma concentración en la solución de sustrato. </li><li> Para el experimento de M1, comiencecon concentración de la enzima en el rango de nM (por ejemplo, 1 nM) y con una concentración de sustrato al menos tres órdenes de magnitud más alta que la concentración de la enzima y por encima de la K M. </li><li> Para el experimento M2, comience con la concentración de la enzima en la producción de PM-nM (por ejemplo, 15 horas). La concentración de sustrato en la jeringa está en el intervalo mM (por ejemplo 400 mM). NOTA: En la inyección única M1 experimento, las concentraciones deben ser adecuados para lograr la conversión total del sustrato en el producto durante el tiempo de experimentación. Por lo tanto, la concentración de la enzima depende de la velocidad de la enzima: si enzimas con baja kcat están bajo estudio, las concentraciones de enzimas elevadas (hasta 10 m) deben ser utilizados. Por otro lado, las concentraciones de enzima usada en el experimento M2 debe asegurar que el sustrato inyectado es sólo marginalmente (menos de 5%) consumido y que la reacción de la enzima procede en el estado estacionario. Por esta razón, cuanto mayor sea ella eficiencia de la enzima, menor será la concentración de la enzima requerida. Al final del experimento, la concentración de sustrato en la celda de muestra debe ser mayor que K M. </li></ol></li><li> Compruebe cuidadosamente enzima y concentraciones de sustrato con un procedimiento analítico adecuado (por ejemplo, la absorbancia a 280 nm, colorimétricos, ensayos de BCA 11. Esto es necesario para obtener un cálculo preciso y fiable de los parámetros termodinámicos y cinéticos. </li><li> Medir el pH de las soluciones y verificar que el desajuste pH tanto de la enzima y las soluciones de sustrato es mínima en las condiciones experimentales (± 0,05 unidades de pH). </li></ol> 2. Realización del experimento NOTA: El mismo procedimiento debe ser aplicado tanto para el M1 y el experimento M2, que se realizan una después de la otra. <ol><li> Verificar que la celda de muestra y la jeringa de inyección se limpian según el fabricante deinstrucciones. Llene la jeringa de carga proporcionado con el instrumento con agua destilada, insertar suavemente la aguja en la celda de muestra, llenar la célula y eliminar el líquido usando la misma jeringa. Usando este método, se lava la celda de la muestra dos veces con agua destilada y dos veces con el tampón. </li><li> Cargue la cubeta de muestras con 2 ml de solución enzimática utilizando la jeringa de carga, evitando cuidadosamente la formación de burbujas de aire. Inyecte lentamente la solución en la célula hasta que se derrama fuera de la parte superior del tallo celular. Producir un chorro de CA. 0,25 ml de solución en la célula. Repita dos veces. Este paso elimina las burbujas de aire atrapadas en la celda de muestra. </li><li> Coloque la aguja de la jeringa de carga en la repisa entre el vástago de la celda y el puerto celular y retirar cualquier exceso de solución. </li><li> Inicie el programa VP-Viewer y, desde la interfaz de la computadora, equilibrar el instrumento ITC a una temperatura de 3 ° C por debajo de la temperatura deseada experimental. Esto es necesario para evitar el tiempo de equilibrioperíodos antes del experimento, debido a que el dispositivo de refrigeración pasiva instrumentales. </li><li> Llenar la celda de referencia con agua destilada con el mismo procedimiento anterior. Cuando tampones con fuerza iónica alta o alta osmolalidad son en la solución de muestra, el mismo tampón se debe utilizar como una solución de referencia. </li><li> Link a la jeringa de plástico para el puerto de llenado de la jeringa de inyección, usando un tubo de silicio delgada. Llene la jeringa de inyección de colocar la punta de la aguja en agua y elaboración, hasta que el agua salga del puerto de llenado superior, lo que indica que la jeringa se llene. A continuación, mueva la punta de la jeringa de agua y elaborar aire, para vaciar la jeringa de inyección. Con este procedimiento, se lava la jeringa de inyección con tampón, y extraer el aire a través del sistema. Posteriormente, colocar la aguja de inyección en un tubo estrecho que contiene 0,5 ml de solución de sustrato, extraer cuidadosamente y llenar completamente la jeringa de inyección, dejando una pequeña cantidad de solución en la parte inferior del tubo. </li><li> Desdeinterfaz de la computadora, pulse &quot;Cerrar el orificio de llenado&quot;. Retire el tubo de carga de silicio. Pulse el botón &quot;Purgar y volver a llenar&quot; para permitir que la jeringa de inyección para desalojar las burbujas de aire y para expulsarlos de nuevo en la solución a granel. Repita dos veces. </li><li> Mover la jeringa de inyección, limpie en los lados para eliminar cualquier gota y colocar la aguja de la jeringa de inyección en la celda de muestra. </li><li> En el equipo, establezca los parámetros de funcionamiento adecuados. La enzima experimental y concentraciones de sustrato se pueden indicar. <ol><li> En el experimento M1, establecer al menos dos adiciones (5-30 mu l) de sustrato para verificar la reproducibilidad. Ajuste el tiempo de separación entre cada inyección (por ejemplo, 1,000 segundos) lo suficientemente grande para asegurar que la señal vuelve de calor a la línea de base antes de la siguiente adición. </li><li> En el experimento M2, ajuste múltiple (por ejemplo, 15 x 10.5 mu l) inyecciones. Establezca el intervalo entre las inyecciones (por ejemplo, 180 segundos) que permiten que el sistema se stabilize la potencia térmica a la nueva línea de base después de cada inyección. NOTA: El tiempo de separación entre las inyecciones en el experimento M2 debe ser lo suficientemente corto para evitar la conversión de una cantidad significativa de sustrato, permitiendo que las mediciones que se llevan a cabo bajo condiciones de estado estacionario. </li><li> En el experimento M2, utilizar pequeños volúmenes (por ejemplo, 2 l) para la primera inyección, cuyo valor correspondiente se desecha durante el posterior análisis de datos. De hecho, con frecuencia se presenta artefactos debido a la difusión inicial del sustrato a través de la punta de la jeringa, y para la presencia de burbujas de aire atrapadas en la aguja de la jeringa. </li><li> Establecer la potencia de referencia, el nivel aproximado en el que se coloca la línea de base antes de la reacción se inicia, en un valor de 20. A continuación, defina la enzima experimental y concentraciones de sustrato y eligió un nombre para el experimento. </li><li> Definir la temperatura experimental, por lo general a los 25 ° C. ITC permite temperaturas de trabajo entre 2<html> ° C y 80 ° C. El experimento está listo para el funcionamiento. Pulse el botón &quot;Inicio&quot; para iniciar el experimento. </li></ol></li><li> Una vez que el experimento ha terminado, limpiar la celda de muestra y la jeringa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Repetir el experimento al menos una o dos veces más para comprobar la reproducibilidad de los datos. </li></ol> 3. Análisis de Datos <ol><li> Desde el programa de análisis, haga clic en el botón &quot;Leer datos&quot;, y vaya a la carpeta donde se encuentra el archivo de itc. Del experimento realizado M2. Haga clic en la flecha de desplazamiento hacia abajo de los &quot;Archivos de tipo&quot; y seleccione &quot;Ensayo de enzimas (que?)&quot;. Posteriormente, haga clic en y abra el archivo itc. Del experimento M2. </li><li> Obtener el delta H de la reacción de la integración de la curva del experimento M1 de acuerdo con la Ecuación 5. &quot;Width =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol><li> Haga clic en el botón &quot;Leer datos&quot;, y seleccione el archivo. Itc del experimento M1 realizado. El uso de Origin, dividir la traza en diferentes partes contienen un pico y guardar cada pico como un archivo opj.. Abrir el archivo correspondiente al primer pico, resultante de la desviación de línea de base en el termograma de la inyección única M1 experimento, integrarlo y dividir el valor del área obtenida, expresada en μcal, por la concentración de sustrato final en la celda de muestra, expresado en M, y por el volumen de la celda expresada en litros, determinar, de acuerdo con la Ecuación 5, el delta H de la reacción. </li><li> Repita el mismo procedimiento para el segundo pico del experimento M1 y obtener un valor promedio de las dos mediciones? H. </li></ol></li><li> Determinar dQ / dt en el experimento M2 medir la diferencia entre la línea de base original y la nueva línea de base después de cada inyección. Convertir el correodatos Xperimental a velocidades de reacción de acuerdo con la ecuación 4, utilizando el valor de entalpía obtenidos en el experimento M1 y ajustar los datos a la ecuación de Michaelis-Menten. <ol><li> Desde el programa de análisis, haga clic en el botón &quot;Leer datos&quot;, y seleccione el archivo. Itc del experimento realizado M2. Haga clic en la flecha de desplazamiento hacia abajo de los &quot;Archivos de tipo&quot; y seleccione &quot;Ensayo de enzimas (que?)&quot;. </li><li> Se abre el cuadro de diálogo Ensayo de enzimas, lo que permite la selección de uno de los cuatro modelos. Seleccione &quot;Método 2 - único sustrato&quot; de la ventana. </li><li> En la ventana? H, indicar el valor de? H obtenido en el paso 4.2. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Concentración&quot; para comprobar los valores de concentración para ser utilizado en el procedimiento de ajuste. Haga clic en el botón &quot;Tiempo Promedio (P)&quot;. El cuadro de diálogo se abre dando la oportunidad de cambiar o aceptar el valor predeterminado. Este valor representa el tiempo antes de cada inyecciónde iones en el que los promedios de instrumentos la señal de potencia para determinar el nivel de potencia en cada concentración de sustrato. Haga clic en Aceptar para confirmar el valor predeterminado. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Zero Eje&quot;. El cursor se convierte en una cruz lo que permite hacer doble clic en un punto, para colocar en y = 0. Haga doble clic justo antes del primer punto de inyección. </li><li> Haga clic en el botón Calcular Cambio. Cambio se representó frente a la concentración de sustrato, derivada dividiendo el sustrato añadido durante la titulación para el volumen de celda de muestra (teniendo en cuenta los efectos de dilución). Esta operación da un típico diagrama de Michaelis-Menten que puede ser instalado para obtener K M y k gato. </li><li> Si se deben eliminar algunos puntos, seleccione el botón &quot;Truncar datos&quot;. Mueva los marcadores de datos para excluir a los puntos de datos malos y hacer doble clic sobre uno de los marcadores o pulse Intro. </li><li> Utilice la función &quot;Ajustar a modelar&quot; para adaptarse a la curva y paraobtener las constantes cinéticas. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Importancia de las TIC para estudiar la actividad enzimática con respecto a los métodos existentes Además de sus aplicaciones clásicas para estudiar los equilibrios de unión, calorimetría de titulación isotérmica proporciona un método fiable y rápido para caracterizar reacciones enzimáticas en solución utilizando el calor de reacción como una sonda, sin requerir la modificación del sistema o etiquetado. Los parámetros cinéticos k gato y K M...

La determinación cuantitativa de las reacciones bioquímicas proporciona información detallada sobre los procesos biológicos en la base de la vida. Calorimetría ofrece una metodología libre de marca para caracterizar cuantitativamente virtualmente cada reacción química en la solución. Esta técnica mide el calor liberado o absorbido con el tiempo, y por lo tanto es un sistema de detección universal y una metodología muy conveniente para cuantificar la cantidad de moléculas que reaccionan (es decir, la termodinámica de unión), así como para medir la velocidad de reacción (es decir, la cinética). En particular, Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) ha sido adoptado como método de elección para caracterizar la termodinámica de los equilibrios biomoleculares, que implica la proteína-ligando, proteína-proteína, proteína de iones metálicos y la proteína-DNA 1.6. Además, la capacidad de CCI para proporcionar información cinética hace que sea un sistema muy potente para medir la catálisis enzimática, aunque el potencial de esta aplicación es todavíasubestimado 7-9. La ecuación de Michaelis-Menten 10 es una descripción cuantitativa de las reacciones enzimáticas, ya que proporciona una relación entre la velocidad de reacción y la concentración de sustrato, dependiendo de dos parámetros cinéticos: la constante de Michaelis (K M) y la constante de velocidad catalítica (kcat) . El k cat / K proporción M se conoce como la eficiencia catalítica de una enzima. En la práctica, la determinación de K M y k gato para una reacción específica proporciona una descripción completa de la catálisis. En una reacción enzimática típica (Figura 1), un sustrato (S) interactúa con la enzima (E) que forma el complejo enzima-sustrato (ES), que se activa posteriormente en el estado de transición (ES *). Este último se convierte en el complejo enzima-producto (EP) que, finalmente, se disocia. Estos pasoss se describen mediante la siguiente reacción. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) donde k 1 es la constante de velocidad para la formación del complejo ES, k -1 es la constante de velocidad para la disociación del complejo ES, mientras que k gato es la constante de velocidad catalítica o número de recambio. De acuerdo con la ecuación de Michaelis-Menten 10, la velocidad de la reacción se puede calcular como: <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) en la que M = K (k -1 + k gato) / k 1 y k cat = V max / [E], con v max siendo la velocidad máxima se alcanza cuando toda la enzima se une al sustrato. El calorímetro de titulación isotérmica es el instrumento utilizado en este estudio para caracterizar la hidrólisis enzimática de la urea. Este instrumento es de un escudo adiabático que contiene dos células en forma de cuño (Figura 1). Estos están conectados al exterior con tubos de acceso estrechos. La celda de muestra (aproximadamente 1,4 ml) se carga con la solución de enzima, mientras que la celda de referencia es generalmente llena con agua o con el disolvente utilizado para el análisis. Una jeringa que gira con una aguja larga y una paleta de agitación adjunta, que normalmente contiene ca. 0,3 ml de solución de sustrato, está montado en la celda de muestra. Un dispositivo termoeléctrico mide la diferencia de temperatura entre la muestra y la celda de referencia y, utilizando una &quot;red de realimentación de células&quot;, mantiene esta diferencia a cero por la adición o sustracción de calor. Durante el experimento, el sustrato se inyecta en la solución de enzima a una temperatura elegida constante. Cuando la lineaenzimáticos reacción tiene lugar, la cantidad de calor liberada o absorbida es proporcional al número de moléculas de sustrato que se convierten en moléculas de producto. Además, la tasa de flujo de calor está directamente relacionada con la velocidad de la reacción. Los datos medidos, que aparece como una desviación de la traza de calor de línea de base inicial (Figura 1), representan la potencia térmica (μcal / seg) suministrado por el instrumento para la celda de muestra, que es proporcional al flujo de calor se produce en la celda de muestra con el tiempo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Representación esquemática de calorímetro de titulación isotérmica para estudiar las reacciones enzimáticas. Una reacción enzimática que ocurre durante la titulación del sustrato (en la jeringa de inyección) en la solución de enzima (en la celda de muestra) resulta en un cambio de la Therpoder mal lanzado por el calorímetro, necesaria para mantener la diferencia de temperatura entre la celda de muestra y la constante de celda de referencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> En general, el cambio de calor (Q) es proporcional a la entalpía molar de la reacción (H) y el número de moles de producto generado (N), que a su vez viene dada por los tiempos totales de volumen de la concentración: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) La formación de producto a través del tiempo (dP / dt), que corresponde a la velocidad de reacción, puede por lo tanto estar relacionado con la cantidad de calor generado durante el mismo tiempo (dQ / dt) a través de la relación: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) De acuerdo con esta ecuación, a fin de obtener una de Michaelis-Menten trazar es necesario medir i) el total delta H entalpía molar, y ii) el flujo de calor dQ / dt en diferentes concentraciones de sustrato. Por lo general, esto se realiza en dos experimentos diferentes: en el primer experimento (Método 1, M1), el sustrato se inyecta en la solución de enzima y se mide el calor para la conversión completa del sustrato; en el segundo experimento (Método 2, M2), múltiples inyecciones de sustrato se llevan a cabo y la tasa de producción de calor se mide a diferentes concentraciones de sustrato. Estos dos conjuntos de datos son suficientes para derivar los parámetros cinéticos K M y K gato. En el presente artículo, un protocolo general para determinar los parámetros cinéticos de las reacciones enzimáticas realizadas utilizando ITC se describe. Se aplicó el método de hidrólisis de la urea con urea Canavalia ensiformisse, como un sistema de referencia. La buena concordancia entre los resultados obtenidos con este método y los datos reportados en la literatura demuestra la fiabilidad de este enfoque.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>que se disuelve en agua y ajusta el pH con NaOH</td></tr><tr><td>TRIZMA-Base</td><td></td><td>Sigma T1503</td><td>que se disuelve en agua y ajusta el pH con HCl</td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de sodio</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>4270</td><td>que se disuelve en agua</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>30427</td><td>que se disuelve en agua</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U4128</td><td>disolviéndose en agua a 40 &0 °C; C</td></tr><tr><td>Canavalia ensiformis ureasa (tipo C-3)</td><td>Sigma</td><td>U0251</td><td>disuelto en 20 mM HEPES pH 7 y almacenado a -80 °C; C</td></tr><tr><td>VP-ITC en Origin 7.0</td><td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td>SYS13901</td><td>instrumento&nbsp;</td></tr><tr><td>VPViewer2000 1.30.00 en</td> el software de adquisición de datos Origin 7.0 <td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td></td> <td>suministrado con el instrumento</td></tr></tbody></table>

hot catálisis biológica: calorimetría de titulación isotérmica para caracterizar las reacciones enzimáticas

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica bien descrito que mide el calor liberado o absorbido durante una reacción química, utilizando como una sonda intrínseca para caracterizar prácticamente todos los procesos químicos. Hoy en día, esta técnica se aplica ampliamente para determinar los parámetros termodinámicos de los equilibrios de unión biomoleculares. Además, el CCI se ha demostrado ser capaz de medir directamente la cinética y los parámetros termodinámicos (k gato, K M,? H) de las reacciones enzimáticas, a pesar de que esta aplicación es aún sin explotar. Como los cambios de calor se producen de forma espontánea durante la catálisis enzimática, el CCI no requiere ninguna modificación o etiquetado del sistema bajo análisis y se puede realizar en solución. Por otra parte, el método necesita poca cantidad de material. Estas propiedades hacen que el CCI una herramienta inestimable, poderosa y única para estudiar la cinética de enzimas en varias aplicaciones, tales como, por ejemplo, el descubrimiento de fármacos. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En este trabajo un método basado en la ITC experimental para cuantificar la cinética y termodinámica de las reacciones enzimáticas se describe a fondo. Este método se aplica para determinar k gato y K M de la hidrólisis enzimática de la urea por Canavalia ensiformis (canavalia) ureasa. Se realiza Cálculo de la entalpía molar intrínseca (H int) de la reacción. Los valores así obtenidos son consistentes con los datos anteriores reportados en la literatura, lo que demuestra la fiabilidad de la metodología.

La ureasa (CE 3.5.1.5; amidohidrolasa de urea) es una enzima que contiene níquel de múltiples subunidades que se encuentra en Archea, bacterias, eucariotas y plantas unicelulares. Actos esta proteína en el último paso de la mineralización de nitrógeno orgánico, que catalizan la hidrólisis de urea a amoniaco y carbamato, que se descompone espontáneamente para dar una segunda molécula de amoniaco y bicarbonato (Ecuación 6) 12. <img fo:content-width="4in" src="/files/...

Medidas de calorimetría de titulación isotérmica flujo de calor liberado o absorbido en las reacciones químicas. Este método se puede utilizar para cuantificar la enzima-catálisis. En este trabajo, el protocolo para la configuración instrumental, experimento en marcha, y el análisis de datos se describe generalmente, y se aplica a la caracterización de la hidrólisis enzimática de la urea por la ureasa jack bean.

Hot Catálisis Biológica: Calorimetría de titulación isotérmica para caracterizar las reacciones enzimáticas

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

El siguiente experimento describe un método confiable, rápido y sin marcadores que emplea calorimetría de titulación isotérmica para determinar cuantitativamente la termodinámica y la cinética de reacciones enzimáticas en solución, utilizando el calor liberado y absorbido a lo largo del tiempo como sonda interna. Esto se logra permitiendo que la reacción enzimática ocurra en la celda de muestra del instrumento a una temperatura constante y monitoreando la desviación de la traza de calor respecto a la línea base inicial. En un primer experimento denominado Método uno o M1, el sustrato se inyecta en la solución de enzima y se mide el calor para la conversión completa del sustrato, lo que permite determinar la entalpía molar total de la reacción.En un segundo experimento denominado método dos o M dos, se realizan múltiples inyecciones del sustrato, lo que permite medir la velocidad de producción de calor a lo largo del tiempo a diferentes concentraciones de sustrato. Los resultados obtenidos a partir de los dos experimentos calorimétricos permitieron determinar los parámetros cinéticos, kcat y km, asumiendo una catálisis enzimática de tipo Michaelis-Menten. La principal ventaja de utilizar la calorimetría isotérmica por titulación frente a otros métodos, como los ensayos espectrofotométricos que monitorean la formación de producto a lo largo del tiempo, es que la CIT no requiere ninguna modificación ni etiquetado del sistema bajo análisis y necesita una cantidad muy pequeña de material, ya que utiliza el calor intrínseco de la reacción como sonda interna. A continuación se describe el procedimiento con lusai.Un estudiante de doctorado de nuestro laboratorio primero diluye una solución concentrada de la enzima con dos mililitros de tampón para obtener una concentración final de enzima en el rango de nanomoles para el experimento M1. Luego, añada 0,5 mililitros de tampón a una solución concentrada del sustrato para obtener una concentración de sustrato al menos tres órdenes de magnitud mayor que la concentración de enzima y por encima de la km. Para el experimento M2, prepare una solución de enzima de dos mililitros con una concentración final en el rango de picomoles a nanomoles.Diluya el sustrato con 0,5 mililitros de tampón para obtener una concentración de sustrato en el rango de milimolar. Después de verificar que la celda de muestra y la jeringa de inyección se han limpiado según las instrucciones del fabricante, llene la jeringa de carga con agua destilada. Luego inserte suavemente la aguja en la celda de muestra, llene la celda y retire el líquido utilizando el método descrito anteriormente, lave la celda de muestra dos veces con agua destilada y dos veces con tampón.Injecte lentamente la solución enzimática en la celda hasta que rebose por la parte superior del vástago de la celda. Para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la celda de muestra, produzca un chorro de aproximadamente 0,25 mililitros de solución dentro de la celda. Después, repita el chorro dos veces más.Coloque la aguja de la jeringa de carga sobre el reborde entre el vástago de la celda y el puerto de la celda, y retire cualquier solución excesiva. Inicie el programa VP viewer y equilibre el instrumento de CIT a una temperatura tres grados Celsius por debajo de la temperatura experimental deseada. Después de llenar la celda de referencia con agua destilada de la misma manera que antes, conecte una jeringa de plástico al puerto de llenado de la jeringa de inyección mediante un tubo delgado de silicona, coloque la punta de la jeringa de inyección en agua y llene la jeringa hasta que el agua salga por el puerto superior de llenado, lo que indica que la jeringa de inyección está llena.Luego retire la punta de la jeringa del agua y aspire aire para vaciar la jeringa de inyección. Usando el mismo procedimiento, lave la jeringa de inyección con tampón y haga pasar aire a través del sistema. A continuación, coloque la solución de sustrato en un tubo estrecho y limpio.Colóquelo debajo de la jeringa e inserte completamente la aguja de la jeringa de inyección en ella. Llene la jeringa de inyección, dejando una pequeña cantidad de solución en la parte inferior del tubo desde la interfaz de la computadora. Presione cerrar puerto de llenado.Una vez que se haya retirado el tubo de carga de silicio, presione purgar y rellenar para desalojar cualquier burbuja de aire de la jeringa de inyección y expulsarla de vuelta a la solución principal. A continuación, limpie los lados de la jeringa de inyección con una toalla de papel para eliminar cualquier solución residual y colóquela en la celda de muestra. En el experimento M1, establezca al menos dos adiciones de cinco a 30 microlitros de sustrato para verificar la reproducibilidad.Luego, establezca un tiempo de separación entre cada inyección lo suficientemente largo para asegurar que la señal térmica regrese a la línea base antes de la siguiente adición. En el experimento M dos, configure múltiples inyecciones de cinco a 10 microlitros. Establezca el intervalo entre las inyecciones, permitiendo que el sistema estabilice la potencia térmica a la nueva línea base tras cada inyección.En este momento, ajuste la potencia de referencia a 20. Luego defina las concentraciones experimentales de enzima y sustrato y elija un nombre para el experimento. Establezca la temperatura en 25 grados Celsius e inicie el experimento.Una vez finalizado el experimento, limpie la celda de muestra y la jeringa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de abrir el software Origin 7.0, haga clic en el botón de abrir y seleccione el archivo correspondiente a la primera inyección en el trazado térmico del experimento M1. Para determinar la ΔH de la reacción, integre el primer pico resultante de la desviación respecto a la línea base en el termograma de la inyección única.Experimento M1. Luego, divida el valor del área obtenido, correspondiente al calor total de reacción expresado en microcalorías, por la concentración final del sustrato en la celda de muestra expresada en micromolar y por el volumen de la celda de muestra expresado en litros. Repita el mismo procedimiento para el segundo pico del experimento M1 y promedie los valores obtenidos para las dos mediciones de ΔH. Posteriormente, determine DQ/DT a partir del experimento M2 midiendo la diferencia entre la línea base original y la nueva línea base tras cada inyección.Esto puede realizarse convirtiendo los datos experimentales en velocidades de reacción de acuerdo con la siguiente ecuación. Utilizando el valor de entalpía obtenido en el experimento M1. Luego, ajuste los datos a la ecuación de Michalis-Menten, particularmente mediante el programa de análisis.Haga clic en el botón leer datos y navegue hasta la carpeta donde se ha ubicado el experimento M dos. A continuación, haga clic en la flecha de desplazamiento hacia abajo del menú archivos de tipo y seleccione ensayo enzimático. Posteriormente, haga clic y abra el archivo.Realice la CIT del experimento M dos. Después de que se abra el cuadro de diálogo del ensayo enzimático, seleccione el método dos sustratos únicamente en la ventana; en la ventana de delta H, indique el valor de delta H obtenido en el experimento M1. A continuación, haga clic en el botón de eje y cero y haga doble clic justo antes del primer punto de inyección.Haga clic en el botón calcular velocidad para trazar la velocidad frente a la concentración de sustrato. Finalmente, utilice la función de ajuste de modelo para ajustar la curva y obtener la constante cinética. La actividad lítica de cannavale y CMIS o URIs de frijol JAK se eligió como una reacción representativa para demostrar la aplicabilidad de la ITC en la determinación cuantitativa de la catálisis enzimática.Se midió un valor de ΔH de -10,5 kilocalorías por mol en el experimento M1 mediante la integración de la potencia térmica resultante de la inyección del sustrato urea en la solución de ureasa y permitiendo que la reacción transcurriera hasta su finalización. La potencia térmica registrada en el experimento M2 se convirtió en la velocidad de reacción utilizando la siguiente ecuación. El ajuste de los datos obtenidos a la ecuación de McKayla Cementin proporcionó los parámetros cinéticos de la ureasa JAK bean en 20 milimolares de heaps.pH siete como kcat igual a 30.200 por segundo, y KM igual a 3,45 milimolar, en concordancia con datos previamente reportados. El cambio térmico total medido en el experimento M1 representa la suma de todos los eventos que ocurren durante la reacción bajo análisis, y depende de la entalpía molar de todos los procesos involucrados, y no solo de la conversión de sustrato a producto. En un proceso genérico en el que el sistema reactante adquiere protones en una solución amortiguadora, el tampón libera protones produciendo calor adicional dentro de la celda de reacción.Por lo tanto, el delta H medido es aparente e incluye el delta H intrínseco de la reacción, así como la entalpía de ionización del tampón y el número de protones intercambiados según la ecuación resaltada. Utilizando esta ecuación en experimentos M1, se pueden determinar el número de protones intercambiados y el delta H intrínseco realizando el mismo experimento en tampones con diferente entalpía de ionización. La reacción global de hidrólisis de la urea da como resultado la adquisición de un protón del tampón.Por lo tanto, como se describió anteriormente, el calor de la reacción incluye la contribución de la protonación del tampón d. Con el fin de calcular la delta H intrínseca de la reacción de hidrólisis, se realizaron tres experimentos M1 en diferentes tampones, caracterizados por tres entalpías de ionización conocidas y distintas. La entalpía intrínseca y el número de protones liberados desde el tampón pueden calcularse a partir de la ordenada en el origen y la pendiente del ajuste lineal de los datos experimentales.Fueron de -14,7 kilocalorías por mol y 0,98 respectivamente, en completo acuerdo con los datos previamente reportados. Las aplicaciones de este procedimiento se extienden desde la investigación básica hasta la aplicada y el cribado de fármacos, ya que una vez determinada la cinética de la reacción enzimática, el experimento puede repetirse en presencia de diferentes tipos y concentraciones de inhibidores enzimáticos con el fin de monitorear las constantes de inhibición.

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