Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

El objetivo general del siguiente experimento es identificar ligandos activadores funcionales de receptores huérfanos acoplados a proteínas G o G PCR. Esto se logra mediante el transecto transitorio A-G-P-C-R de interés y la seccionación de un constructo promiscuo G alfa 16 en un sistema de expresión celular para obtener la expresión heteróloga temporal de ambas proteínas. Como segundo paso, las células transfectadas se cargan con el colorante sensible al calcio flu oh four, que detecta la liberación de calcio de las reservas intracelulares a través de un aumento en la señal fluorescente tras la interacción con el calcio.

A continuación, el ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia se realiza desafiando el receptor heterólogo expresado con una biblioteca de compuestos de ligandos candidatos para determinar los compuestos que activan el receptor y provocan una cascada de señalización intracelular que resulta en la liberación de calcio del retículo endoplásmico, que se puede medir como una señal fluorescente. Se obtienen resultados que muestran una curva de respuesta a la concentración con la mitad de la concentración efectiva máxima de un ligando activador, que se basa en la detección de diferentes señales fluorescentes en función de las concentraciones de ligando administradas al sistema de expresión celular. La principal ventaja de realizar transfect transitorio para obtener la expresión temporal de su GPCR sobre el uso de líneas celulares clonales estables es que no requiere el establecimiento de dichas líneas celulares transfectadas de manera estable.

La transfección de la subunidad promiscua G alfa 16 puede redirigir la vía de señalización intracelular de la mayoría de los GPCR hacia la liberación de calcio, independientemente de la vía de señalización nativa en entornos endógenos. Como tal, esta configuración permite el cribado de rendimiento medio de cientos de compuestos en GPCR de interés en un corto período de tiempo, lo que demuestra que el procedimiento será gas amarillo, un estudiante de doctorado y Nick Su, un técnico de nuestro laboratorio Cultive las células T HEK 2 93 en matraces T 75 tres días antes de que se lleve a cabo el ensayo de movilización de calcio real, paso de las celdas cuando se alcanza una confluencia del 80%. Prepare un matraz T 75 para la transfección con la construcción del receptor y otro para la transfección con un vector de expresión vacío como control negativo.

Incubar los matraces a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 20 a 24 horas hasta que los cultivos celulares se acerquen al 50 al 70% de confluencia, como se muestra aquí. A continuación, agregue 3,9 microgramos de la construcción del receptor o vector vacío y 3,9 microgramos de la construcción de expresión G alfa 16 a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros. Agregue 500 microlitros del tampón jet prime.

Mezcle bien agitando el tubo en vórtice seguido de un breve giro. A continuación, añada 37,5 microlitros del vórtice del reactivo jet prime y gire durante un minuto a la máxima velocidad. Incubar la mezcla de transfección durante 10 minutos.

A temperatura ambiente, etiquete una población de células como transfectada con el vector de expresión, codificando el GPCR de interés y el constructo G alfa 16 y el segundo matraz con el vector vacío y el constructo G alfa 16. Después de la incubación, agregue la mezcla de transfección gota a gota al medio de cultivo celular, asegurándose de pipetear directamente en el medio y evitar el contacto con las paredes del matraz de cultivo. Incubar los matraces a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada al 5%CO2 durante 20 a 24 horas para el ensayo de movilización de calcio.

Las células transfectadas se recolectan y se siembran en 96. Placas inferiores transparentes de paredes negras. Primero cubra las placas con 60 microlitros por pocillo de temperatura ambiente.

Solución salina tamponada con fosfato con fibronectina. Incube las placas a temperatura ambiente durante una hora con la tapa puesta. Retire la solución de los pocillos y vuelva a incubar las placas durante una hora sin la tapa a temperatura ambiente.

Mientras tanto, retire el medio de crecimiento viejo de las células. Enjuague las células muertas con tres mililitros de PBS y retire el PBS. A continuación, añada tres mililitros de PBS a temperatura ambiente probando la incubación de EDTA durante un minuto antes de retirar la solución.

En este punto, la morfología de las células cambia de forma de estrella a forma de esfera. Afloje las células del fondo del matraz dando golpecitos suaves y recójalas enjuagando varias veces con 10 mililitros de temperatura ambiente. Medio de transferencia DM em.

Transfiera las células a un tubo de halcón de 50 mililitros. Para contar el número de células por mililitro, agregue 100 microlitros del cultivo celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego agregue 100 microlitros de tampón de lisis y mezcle golpeando el tubo.

Finalmente, agregue 100 microlitros de tampón estabilizador y mezcle dando golpecitos. Llene un casete de núcleos con la suspensión celular y cuente las células con el contador. El software de visualización de núcleos multiplica automáticamente el número de células por tres a medida que las células se diluyen por un factor de tres.

Al agregar el tampón de lisis y estabilizador, diluya las células hasta una concentración final de 600, 000 células por mililitro y siembre 150 microlitros de las células por pocillo en las placas recubiertas. Para obtener una densidad celular de aproximadamente 90.000 células por pocillo, evite las burbujas de aire y golpee la placa para distribuir las células de manera uniforme. Para obtener una capa celular contigua, incube las placas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 16 a 24 horas.

Deseche el medio de las celdas. Lave las celdas con 200 microlitros de PBS por pocillo y retire el PBS. Tenga en cuenta que todos los pasos siguientes que impliquen operaciones con las celdas deben realizarse en la oscuridad porque a partir de este punto, las celdas se cargarán con el fluoro cuatro.

Agregue 55 microlitros de tampón de carga por pocillo, envuelva la placa en papel de aluminio para evitar la exposición de la placa a la luz e incube durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, utilice un tampón de lavado para solubilizar los péptidos secos en tubos de microcentrífuga siliconados de 1,5 mililitros. Prepare una serie de diluciones para realizar un análisis de respuesta a la concentración y determinar el valor EC 50 de un ligando.

Tenga en cuenta que 50 microlitros de un ligando de la placa de compuestos se transferirán a un pocillo con 100 microlitros de tampón de lavado en la placa de celdas durante el ensayo, así que prepare los compuestos a tres veces su concentración final deseada. A continuación, agregue 70 microlitros del ligando en el pocillo correspondiente de la placa compuesta por triplicado. Incluya controles positivos y negativos en cada plato.

Deseche el tampón de carga de la placa de la celda y agregue 100 microlitros de tampón de lavado a cada pocillo, evitando la exposición a la luz. Incubar la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente. Deseche el tampón de lavado de la placa de celdas y agregue 100 microlitros de tampón de lavado nuevo a cada uno.

Incube bien la placa de celdas, la placa compuesta y una rejilla de puntas durante 15 minutos. A 37 grados centígrados, cree y cargue el archivo de protocolo deseado con el software y active aquí la unidad de control de temperatura para la cámara de lectura. Las respuestas de calcio se miden a 37 grados Celsius durante dos minutos, una fila a la vez, con un intervalo de 1,52 segundos entre lecturas sucesivas a 525 nanómetros.

Ajuste la excitación de la gripe a 488 nanómetros y transfiera un volumen total de 50 microlitros de compuesto a la placa celular. 18 segundos después de la lectura. Comience con la velocidad de dispensación ajustada a 26 microlitros por segundo y una altura de pipeta de 135 microlitros.

Coloque el compuesto y la placa de celda y el bastidor de puntas en los cajones apropiados del dispositivo de la estación. Realice una sola lectura de la placa de celda a la misma longitud de onda de excitación y emisión en el modo de punto final antes de iniciar la pantalla real en modo flexible. Inicie el ensayo y proceda a analizar los datos utilizando el software descrito.

A continuación se muestran los gráficos correspondientes a una de las tres réplicas de la serie corta de una concentración de NPF de doofus. El control negativo no indujo una señal fluorescente. Mientras que el control positivo provocó una fuerte activación del receptor uno activado por la proteasa endógena, lo que condujo a una señal fluorescente alta.

El software permite introducir fórmulas para determinar el porcentaje de activación o los errores estándar de las diferentes concentraciones entre otros. Los datos resultantes se utilizan para componer curvas preliminares de respuesta a la concentración para estimar los valores de EC 50 como se muestra para los cuatro péptidos NPF cortos del esófago. Las curvas también incluyen los datos del control negativo, donde se probaron las series de concentración de los péptidos NPF cortos de Drosophila en células transfectadas con un vector vacío.

Los resultados indican que la adición de los péptidos a estas células no tiene ningún efecto sobre los receptores endógenos, pero sí activa el receptor de interés. Se realizaron curvas preliminares de respuesta a la concentración del ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia y las concentraciones ensayadas se adaptaron para cubrir el rango dinámico de la curva. Los valores de EC 50 de Drosophila short npf 1, 2, 3 y four son similares, lo que indica que son igualmente potentes para activar el receptor siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la estructura, la actividad y los estudios de relaciones, para responder a preguntas adicionales, como qué aminoácidos del péptido son cruciales para la activación del receptor. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una movilización de calcio basada en el sentido de fluer para identificar ligandos activadores funcionales de receptores acoplados a proteínas G. Esto incluye el mantenimiento de los sistemas de expresión solar seguido de la transfección transgénero del sistema celular por el receptor de interés.

Después de la movilización rígida del calcio, se puede realizar un ensayo.