Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios

Este protocolo combina electrospinning y microesferas para desarrollar andamios de ingeniería tisular para dirigir neuronas. El factor de crecimiento nervioso se encapsuló dentro de microesferas de PLGA y se electrohiló en andamios fibrosos de ácido hialurónico (HA). La bioactividad proteica se probó sembrando los andamios con ganglios primarios de la raíz dorsal del pollito y cultivando durante 4-6 días.

El objetivo general de este procedimiento es crear un entorno multifacético para apoyar el crecimiento y la reparación de los nervios. Esto se logra encapsulando primero los factores de crecimiento dentro de microesferas degradables. El segundo paso es preparar el material de soporte para la mayor parte del entorno.

A continuación, las microesferas y el material de soporte se combinan y se electrohilan en un andamio fibroso alineado. El paso final es probar el andamio con neuronas de los ganglios de la raíz dorsal del pollo. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia se utiliza para mostrar que el crecimiento y la dirección de las neuritas se aceleran en comparación con los controles.

Aunque este sistema está diseñado para tejido neural con ligeros cambios en las proteínas y materiales utilizados, también podría aplicarse a varios tipos de tejidos, incluidos corazones, pulmones y huesos. Antes de comenzar este procedimiento, prepare los reactivos necesarios, soluciones de 2% y 0,5% de peso por volumen de alcohol polivinílico o PVA en agua desionizada, una solución de 2% volumen por volumen, alcohol isopropílico y agua desionizada, y una solución acuosa de la proteína hidrofílica deseada. Lugar. 40 mililitros de la solución de PVA al 0,5% en un tubo de centrífuga de 50 mililitros y se reservaron en un pequeño vial disueltos 300 miligramos de ácido coglicólico poliláctico 65 a 35 o PLGA y tres mililitros de diclorometano.

Se puede utilizar un mezclador de vórtice para acelerar la disolución de PLGA combinada con 200 microlitros de solución de proteínas y cuatro microlitros de solución de PVA al 2%. Vierta la mezcla de proteína PVA en la solución de PLGA. Las soluciones permanecerán en su mayoría separadas.

Coloque el vial en un vaso de precipitados con agua helada usando un W ator a unos 10 vatios, agite la solución durante cinco a 10 segundos hasta que se cree una emulsión blanca cremosa uniforme. Vierta la emulsión en el tubo de 50 mililitros previamente preparado que contiene 0,5% de PVA. Mezcle la solución a alta velocidad en un mezclador de vórtice durante unos 20 segundos.

La solución desarrollará una apariencia turbia. Transfiera la emulsión a un vaso de precipitados de 200 mililitros y colóquela en una placa para remover a 350 RPM durante dos minutos. Agregue 50 mililitros de alcohol isopropílico al 2% al vaso de precipitados en la placa de agitación.

Deje que la mezcla continúe revolviendo durante un mínimo de una hora para permitir que el clorometano se evapore y el PLGA se endurezca. A continuación, transfiera la solución de microesferas a tubos de centrífuga, centrifugar a 425 veces G durante tres minutos. Las microesferas se acumularán en la parte inferior del tubo y aparecerán blancas Retire con cuidado el sobrenadante del tubo por encima de las microesferas y guárdelo en una botella de 500 mililitros.

Enjuague las microesferas con agua desionizada llenando cada tubo tres cuartos de su capacidad y agitándolo para redistribuir las microesferas en el líquido. Repetir la centrifugación, eliminar el sobrenadante y enjuagar las microesferas con agua desionizada cuatro veces después del enjuague final. Retire el sobrenadante y colóquelo en la botella de 500 mililitros con las otras muestras.

Congele las microesferas recogidas en los tubos de centrífuga a 20 grados centígrados negativos durante la noche y luego liofilicelas durante al menos 24 horas. La siguiente solución de electro hilatura debe prepararse de antemano en agua desionizada, 2% de peso por volumen, ácido hialurónico relacionado con la metanfetamina o miha con 3% de peso por volumen, óxido de polietileno de 900 kilodalton o PEO y 0,05% de peso por volumen. Solución de iniciador de fotos.

Después de hacer el volumen deseado de solución de electrohilado, agregue microesferas a la concentración deseada hasta 400 miligramos por mililitro. Mezcle la solución en un mezclador de vórtice hasta que las microesferas se distribuyan uniformemente en la solución. Transfiera la solución a una jeringa y coloque una aguja de punta roma de calibre 18 de seis pulgadas.

Coloque la jeringa en una bomba de jeringa y configúrela para que se dispense a 1,2 mililitros por hora. Pega una capa de papel de aluminio en el mandril. Esto permite una fácil limpieza y almacenamiento del andamio terminado.

Se utiliza un mandril giratorio para crear fibras alineadas. Conecte el cable de tierra de una fuente de alimentación de alto voltaje al aparato de recolección. Conecte el cable positivo a la aguja para garantizar el éxito del electrohilado.

Es muy importante verificar que todas las conexiones y configuraciones sean correctas. Inicie el bombeo de polímero y cuando la solución esté visible en el extremo de la jeringa, encienda la fuente de voltaje y ajuste el voltaje a 24 kilovoltios. Haga funcionar la solución hasta que se logre el grosor de andamio deseado.

Cuando haya terminado, apague la fuente de voltaje y la bomba de jeringa. Para comenzar este procedimiento, fije los cubreobjetos relacionados al área de recolección de la electro hilandera con cinta adhesiva extraíble de doble cara antes de electro spinning. El giro sobre los deslizamientos de la cubierta facilita el manejo y la visualización después del electrogiro hasta el grosor deseado.

Como se demostró en el segmento de video anterior, retire con cuidado los deslizamientos de la cubierta del mandril. Coloque los deslizamientos de la cubierta recubierta de andamio en una cámara de nitrógeno transparente y asegúrese de que se purgue todo el oxígeno. Coloque la cámara y el andamio bajo una luz de 365 nanómetros cuadrados de 10 milivatios centímetros cuadrados durante 15 minutos.

Después del lugar de reticulación, la tapa se desliza en una placa de pocillo de tamaño adecuado. Asegúrese de que el lado del andamio esté hacia arriba. Coloque de 100 a 200 microlitros de medio en cada andamio de la placa del pocillo. Cuidadosamente.

Coloque un ganglio de la raíz dorsal o DRG en cada andamio en la gota de medio. Para un andamio grueso, es posible que se necesiten más medios. El DRG debe estar completamente sumergido y no flotar.

Incubar el andamio y el DRG a 37 grados centígrados durante cuatro horas para permitir que la célula se adhiera al andamio. A continuación, llene el medio hasta el nivel adecuado para el pocillo. Regrese la placa a la incubadora e incube durante cuatro a seis días después del período de incubación.

Retire con cuidado el medio de cada pocillo y lávese suavemente una vez con PBS. Fije las celdas durante 30 minutos usando 4%peso por volumen. Posteriormente, el paraformaldehído tiñe las células en busca de neurofilamentos y núcleos siguiendo un protocolo establecido.

Para visualizar las células con un microscopio fluorescente, coloque la placa de pocillos en la platina del microscopio y localice la masa celular utilizando los ajustes de filtro y excitación para ppp. Una vez identificada la celda, cambie el filtro a zi. Para visualizar las neuritas extendidas, utilice la función de puntada del microscopio para recoger y combinar tantas imágenes como sea necesario para ver toda la estructura.

Repita el procedimiento para las microesferas de dpi, fite y de campo claro. Se han producido sistemáticamente 50 micrómetros de más o menos 14 micrómetros de diámetro con más del 85% de encapsulación de proteínas y se han hilado electros en andamios mediante este protocolo. Esta imagen fluorescente muestra microesferas representativas con Rod Domine en la carcasa de PLGA y ajustes BSA encapsulados en su interior.

Para evaluar la encapsulación, las microesferas se llenaron con BSA y se analizó la liberación de proteínas durante más de 60 días con un ensayo de proteínas de Bradford. La liberación comienza con una ráfaga inicial y luego continúa a medida que las microesferas se descomponen después del electrogiro. Las microesferas se pueden ver en toda la estructura fibrosa 3D.

En esta imagen SEM del andamio completo. Las esferas se pueden ver en múltiples capas indicadas por flechas. Esta imagen de gran aumento es de una microesfera con las nanofibras del andamio sobre ella.

Se utilizaron ganglios de la raíz dorsal o DRG para probar la viabilidad del factor de crecimiento nervioso o NGF en las microesferas dentro del andamio. Aquí están los DRG sentados en un andamio que contiene microesferas. Cargado con NGF se muestra junto a una microesferas sin proteína dentro de la neurita más larga Las extensiones que se extienden desde el DRG en el andamio NGF indican que el NGF es viable y puede promover el crecimiento.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo encapsular proteínas en microesferas e incorporarlas en andamios fibrosos.