Name: Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende a encapsular factores de crecimiento en microesferas de PLGA y electrohilarlas en andamios fibrosos de ácido hialurónico para ingeniería de tejidos nerviosos. Este método promueve el crecimiento y dirección de neuritas.

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Este trabajo fue parcialmente financiado a través de la Fundación Richard Barber y una beca Thomas Rumble (TJW).

1. agua / aceite / agua Doble Emulsión Microsphere Producción <ol><li> En primer lugar preparar 2% y 0,5% w / v de las soluciones de alcohol polivinílico (PVA) en agua desionizada. Revuelva las soluciones a 50 ° C hasta que se aclare, esto puede tardar varias horas. Preparar una solución de 2% v / v de alcohol isopropílico en agua desionizada. </li><li> Preparar una solución acuosa de proteína hidrófila deseada. La siguiente tabla proporciona ejemplos de formulaciones. </li></ol><img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> Tabla 1:. Ejemplo Proteína soluciones Las siguientes soluciones de proteínas se han encapsulado con éxito y electrospun usando este protocolo. Otras soluciones de proteínas hidrófilas se pueden usar según sea necesario. <ol start="3"><li> Coloque 40 ml de la solución de PVA al 0,5% en un tubo de centrífuga de 50 ml y reservar. </li><li> En un tubo de centrífuga de 15 ml disolver 300 mg de 65:35poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) en 3 ml de diclorometano. Un mezclador de vórtice puede ser utilizado para acelerar la disolución de PLGA. </li><li> Combinar 200 l de solución de proteína y 4 l de solución de PVA al 2%. Verter la mezcla de proteína en la solución de PLGA (paso 1.4). Las soluciones se mantendrán básicamente individualista. </li><li> Se coloca el tubo en un vaso de agua helada. Uso de un aparato de ultrasonidos varita a ~ 10 vatios (RMS), agitar la solución durante unos pocos segundos (5-10) hasta que se crea una emulsión blanca cremosa uniforme. </li><li> Se vierte la emulsión en el tubo de 50 ml que contiene 0,5% de PVA (paso 1.3). Mezcle la solución a alta velocidad en un vórtex durante ~ 20 seg. La solución desarrollará un aspecto turbio. </li><li> Se transfiere la emulsión a un vaso de 200 ml y colocar en una placa de agitación a 350 rpm durante 2 min. Añadir 50 ml de 2% de alcohol isopropílico al vaso de precipitados en la placa de agitación. Deje que la mezcla se continúa agitando durante un mínimo de 1 hora para permitir que el DCM se evapore y el PLGA a endurecerse. </li><li> Transferencia tél microesfera solución en tubos de centrífuga. </li><li> Se centrifuga a 425 g durante 3 min. Las microesferas se concentren en la parte inferior del tubo y aparecerá blanco. Retire con cuidado el sobrenadante del tubo, por encima de las microesferas, y almacenar en una botella de 500 ml. </li><li> Enjuague las microesferas con agua desionizada, llenando el tubo de tres cuartos llena y agitarlo para redistribuir las microesferas en el líquido. </li><li> Repita los pasos 1.10 y 1.11 cuatro veces. </li><li> Tras el enjuague final, separar el sobrenadante de nuevo y colocar en la botella de 500 ml con las otras muestras. Congelar las microesferas recogidos en el tubo de centrífuga, a continuación, se liofiliza durante al menos 24 h. </li><li> Visualizar las microesferas con un microscopio de luz o con un microscopio electrónico de barrido. Las microesferas no mayores de 60 micras son para electrospinning efectiva. Si las microesferas son demasiado grandes, sonicación o de vórtice tiempos más largos pueden ser requeridos en el paso 1.6 o 1.7. </li> &lt;li&gt; Guarde las microesferas secas en un -20 ° C congelador. </li><li> Opcional: Utilice un ensayo de proteínas, por las instrucciones del fabricante, para medir la cantidad de proteína en la botella de 500 ml desde el paso 30 1.10. Esto se utiliza para calcular el porcentaje de proteína encapsulada en las microesferas, restando la cantidad en la solución de lo que fue utilizado en el proceso de producción. </li></ol> NOTA: Para visualizar la ubicación de proteína en la microesfera añadir Rodamina 2 mg / ml a la solución de PLGA 31 y encapsular una proteína conjugada con FITC Figura 1 muestra un ejemplo.. 2. electrospinning con microesferas <ol><li> Antes de preparar la solución de electrospinning, crear un 0,5% w / v solución de fotoiniciador, en agua desionizada mediante la disolución a 37 ° C. Este proceso puede tardar varias horas. </li><li> Crear un 2% w / v ácido hialurónico metacrilatado (MEHA) (ver Burdick et al. Para la síntesis) 29, 3%w / v 900 kD poli (óxido de etileno) (PEO) y 0,05% w / v solución de fotoiniciador en agua desionizada. <ol><li> Calcular la cantidad correcta de MEHA y PEO para el volumen deseado. Por ejemplo, 10 ml de electrospinning solución requiere 200 mg de MEHA y 300 mg de PEO. </li><li> Disolver el PEO en agua desionizada a 90% del volumen final deseado (9 ml para este ejemplo). Esto puede tomar varias horas, una placa de agitación caliente o baño de agua a 37 ° C pueden ser utilizados para acelerar el proceso. </li><li> A continuación añadimos la MEHA y utilizar un mezclador de vórtice para agitar la solución hasta que se aclare. Esto sólo tomará unos minutos. </li><li> Finalmente añadir la solución de fotoiniciador 0,5% para llenar el volumen restante 10% (1 ml para este ejemplo). </li></ol></li><li> Añadir las microesferas a la concentración deseada de hasta 400 mg / ml. Mezclar la solución en un mezclador de vórtice hasta que las microesferas se distribuyeron uniformemente en la solución. </li><li> Transferir la solución a una jeringa y fijar un 6 pulgadas bl calibre 18aguja punta unt. </li><li> Coloque la jeringa en una bomba de jeringa y la puso para dispensar a 1,2 ml / hr. </li><li> Pegue una capa de papel de aluminio en el plato de la colecta o mandril. Esto permite una fácil limpieza y almacenamiento del andamio terminado. Un mandril giratorio se utiliza para crear fibras alineadas. Una placa plana o mandril estacionario se traducirá en fibras dispuestas al azar. </li><li> Conectar el cable de tierra de una fuente de alimentación de alto voltaje para el aparato de recogida. Conecte el cable positivo a la aguja. </li><li> Ajuste la superficie de la bomba de jeringa y la recolección de modo que haya 15 cm entre la punta de la aguja y la superficie de recogida. </li><li> Iniciar el bombeo de polímero, cuando la solución es visible en el extremo de la jeringa, encender la fuente de tensión y ajustar la tensión de 24 kV PRECAUCIÓN:. Una vez que la tensión se enciende no toque ninguna parte metálica del sistema. Carga también puede saltar distancias cortas a partir de piezas electrificadas a la piel. </li><li> Ejecute la solución hasta que dse consigue espesor andamio esired. Cuando completa apagar la fuente de tensión y la bomba de jeringa. </li><li> Retire el papel aluminio con el andamio colocado. Completadas andamios que contienen proteínas se almacenan en un congelador de -20 ° C. </li></ol> 3. Proteína Testing bioactividad <ol><li> Preparar medios de cultivo celular. Añadir 10% v / v de suero fetal bovino, 1% v / v L-glutamina, y 1% v / v penicilina-estreptomicina al medio de Eagle modificado de Dulbecco. </li><li> Seleccione cubreobjetos de vidrio que cabe totalmente en un plato bien. </li><li> Utilice 3 (trimetoxisilil) propil metacrilato para tratar los cubreobjetos tal como se describe por el fabricante. Metacrilación mejora la adherencia andamio para los cubreobjetos. </li><li> Adjuntar cubreobjetos metacrilados a la zona de recogida de la electrospinner con cinta adhesiva de doble cara antes de electrospinning. Spinning sobre los cubreobjetos facilita la manipulación y visualización. </li><li> Electrospin al espesor deseado como se describe anteriormente. </li><li> Aespués de electrospinning retire con cuidado cubreobjetos de mandril. Coloque el andamio cubreobjetos recubiertos en una cámara de nitrógeno clara y asegúrese de que todo el oxígeno se purga. </li><li> Coloque la cámara y bajo un andamio 10 mW / cm 2 365 nm de luz durante 15 min. Después de la reticulación lugar en placa de tamaño apropiado. Asegúrese de que el lado del andamio esté hacia arriba. </li><li> Coloque los andamios bajo una lámpara germicida durante 30 min para esterilizar. Si la fibronectina u otra proteína deseada se utiliza como un recubrimiento para mejorar la adhesión celular. Siga las instrucciones del fabricante de andamios abrigo. </li><li> Harvest ganglios de raíz dorsal (DRG), como se describe anteriormente por Hollenbeck 32. Se necesitará un DRG para cada andamio cubierto cubreobjetos probado. </li><li> Coloque 100-200 l de los medios de comunicación en cada andamio en la placa también. Con cuidado, coloque uno en cada DRG andamio en la gota de los medios de comunicación. Para andamios de espesor pueden ser necesarios más medios de comunicación; DRG necesita estar totalmente sumergido y no Floating. </li><li> Incubar el andamio y DRG a 37 ° C durante 4 horas para permitir que la célula se adhiera a la andamio. </li><li> Rellene los medios de comunicación para el nivel apropiado para el bien y colocar de nuevo en la incubadora. Continuar la incubación durante 4-6 días. </li><li> Tras el período de incubación retire con cuidado los medios de cada pocillo y lavar suavemente una vez con PBS. Fijar las células durante 30 min utilizando 4% w / v de paraformaldehído. </li><li> Las células de la mancha utilizando una mancha de anticuerpos para neurofilamentos. Esto permitirá la visualización del crecimiento de neuritas para la cuantificación. DAPI también se puede utilizar para ver núcleos de las células. Un ejemplo de protocolo de tinción fue descrito por Sundararaghavan y sus colegas 14. </li><li> Visualice las células utilizando un microscopio de fluorescencia. <ol><li> Colocar la placa de bien en la platina del microscopio. </li><li> Busque la masa celular utilizando los filtros de excitación y ajustes para DAPI. </li><li> Una vez que la célula es cambiar el filtro para FITC para visualizar las neuritas extendidas. Ucantar la función de puntada en el microscopio recoger y combinar tantas imágenes como sea necesario para ver toda la estructura. Repita el procedimiento para DAPI, FITC y campo claro. </li></ol></li></ol>

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<li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+proteins+in+poly%28L-lactide-co-caprolactone%29+fibers+by+emulsion+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li>
<li>Wang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li>
<li>Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly%28lactic+acid-caprolactone%29%2Fnerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Muchos estudios han demostrado que las células nerviosas pueden ser dirigidas por señales topográficas (alineación de la fibra) y señales químicas (factores de crecimiento) 1,2,10,11,35. Electrospinning es un método fácil para crear fibras alineadas. Los factores de crecimiento estimulan el crecimiento del nervio, pero con el fin de incluirlos en los conductos de los nervios (NC), se requiere un método para la liberación sostenida. Para crear un sistema más robusto con ambas señales, estas dos señales se debe...

Uno de los retos actuales en la ingeniería de tejido neural es la creación de un conducto nervioso (NC) que imita la matriz extracelular, donde los nervios crecen naturalmente. La investigación ha demostrado que las células responden a varios factores en su entorno, incluyendo las señales químicas 1-3 mecánica, topográficos, adhesivo y. Uno de los principales desafíos en este campo consiste en determinar la combinación adecuada de señales y la fabricación de un sistema que puede mantener las señales durante un período prolongado para apoyar el crecimiento celular 4. Neuronas periféricas se sabe que prefieren un sustrato blando, ser dirigidos por fibras alineadas, y responden al factor de crecimiento nervioso (NGF) 5-7. CN que puede proporcionar señales químicas durante semanas se ha demostrado para proporcionar una mejor recuperación funcional más cercana a la de los aloinjertos, el estándar de oro actual para la reparación del nervio 8,9. Materiales y métodos de producción Varios se puede utilizar para producir mecánica y topográficoal cues 10-13. Señales mecánicas son inherentes al material elegido, haciendo la selección del material apropiado para la aplicación crítica 1,13. Los métodos de producción para el control de señales topográficas incluyen la separación de fases, auto-ensamblaje y electrospinning 1,13. Para aplicaciones a microescala, microfluídica, photopatterning, aguafuerte, sanguijuelas sal, o espumas de gas también se puede utilizar 14-17. Electrospinning se ha convertido en la manera más popular para diseñar sustratos fibrosos para el cultivo de tejidos, debido a su flexibilidad y facilidad de producción 13,18-23. Nanofibras electrohiladas se fabrican aplicando un alto voltaje a una solución de polímero haciendo que repeler a sí mismo y se extienden a través de una breve pausa para descargar 24. Un andamio alineados se puede crear mediante la recopilación de las fibras sobre un mandril giratorio a tierra y andamios no alineados se recogen en una placa estacionaria 25. Adhesión de señalización se puede lograr mediante el recubrimiento del ingenio andamio fibrosoh fibronectina o la conjugación de un péptido de adhesión, tales como RGD, al HA antes de electrospinning 26. Las señales químicas, tales como factores de crecimiento, son los más difíciles de mantener durante períodos prolongados, ya que necesitan una fuente de liberación controlada. Muchos sistemas se han intentado añadir liberación controlada a las redes fibrosas electrohiladas con diferentes niveles de éxito. Estos métodos incluyen electrospinning mezcla, emulsión electrospinning, electrospinning núcleo de carcasa y conjugación de la proteína 27. Además, electrospinning se realiza tradicionalmente en un disolvente volátil, que puede afectar a la viabilidad de la proteína de 28, por lo tanto mantener la bioactividad de la proteína debe ser considerado. Este enfoque aborda específicamente la combinación de señales mecánicas, topográficos, químicos y adhesivos para crear un andamio ajustable para el crecimiento de los nervios periféricos. La mecánica del andamio se controla con precisión mediante la síntesis deÁcido Hialurónico metacrilado (HA). Los sitios metacrilación se utilizan para unir fotos reticulantes reactivos. El material reticulado ya no es soluble en agua y se divide exclusivamente por las enzimas 29. La cantidad de reticulación cambia la velocidad de degradación, la mecánica y otras propiedades físicas del material. Uso de HA con 30% metacrilación, que tiene un módulo de tracción de ~ 500 Pa, crea un sustrato blando que está cerca de la mecánica nativos de tejido neural y típicamente se prefiere por las neuronas 26,29. Electrospinning en un mandril giratorio se utiliza para crear fibras alineadas para una señal topográfica. Usando electrospinning junto con microesferas proporciona señales químicas dentro del andamio durante períodos prolongados. Para apoyar microesferas de crecimiento de neuritas que contienen NGF se utilizan para crear la señal química. A diferencia de la mayoría de materiales electrospun HA es soluble en agua por lo que el NGF no se encuentra con solventes fuertes durante la producción. Para añadir una señal de adhesivo, la scaffold está revestida con fibronectina. El sistema completo contiene los cuatro tipos de señales descritos anteriormente: (mecánicas) alineados fibras suaves (topográficos) con la liberación de microesferas de NGF (química) recubiertas con fibronectina (adhesivo). Producción y pruebas de este sistema se describe en este protocolo. El proceso comienza con la producción de las microesferas con un agua-en-aceite-en-agua de doble emulsión. La emulsión se estabiliza con un tensioactivo, alcohol polivinílico (PVA). La fase acuosa interna contiene la proteína. Como se añade a la fase oleosa, que contiene el material de la cáscara PLGA disuelto en diclorometano (DCM), el tensioactivo crea una barrera entre las fases que protegen la proteína de la DCM. Esta emulsión es de otra fase dispersa en agua que contiene PVA para crear la superficie exterior de las microesferas. La emulsión estable se agita para permitir que el DCM se evapore. Después de enjuagar y liofilización que se quedan con la microesferas cont secoaining la proteína. Después de que las microesferas se completan están listos para ser electrospun en andamios. En primer lugar se prepara la solución electrospinning. La viscosidad de la solución es crítico para la formación de fibras adecuado. Las soluciones de HA pura no cumplen con este requisito; PEO se agrega como un polímero portador para permitir electrospinning. Las microesferas se añaden a la solución y electrospun resultando en un andamio fibroso con microesferas distribuidas a lo largo. Una vez que la producción se ha completado, la proteína debe ser probado para verificar su viabilidad. Para ello, una célula primaria que responde a NGF puede ser utilizado. Este protocolo utiliza ganglios de raíz dorsal (DRG) 8-10 días embriones de pollo de edad. Los haces de células se siembran en los andamios que contienen microesferas llenas de NGF los que están vacías o. Si el NGF es todavía viable debería ver un mayor crecimiento de axones en los andamios que contienen NGF. Si el NGF ya no es viable que lo haráno promover neuritas para ampliar y debe ser similar a la de control. El procedimiento exacto se describe en el presente documento se centra en el apoyo neural, sin embargo, con modificaciones sencillas en el material, el método de electrospinning, y proteínas que el sistema puede ser optimizado para diferentes tipos de células y tejidos.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF</td><td>24650-42-8</td><td>Proteger de la luz</td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Metacriloxetil tiocarbamoil rodamina B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>Prepare la solución madre en</td></tr><tr><td>la bomba de jeringa</td> DMSO <td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td> Gamma Motor <td>ES30P-5W</td><td></td>de <td>alto voltaje</td></tr><tr><td></td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>Debe conectarse a un mandril hecho a medida</td></tr><tr><td>Tacómetro</td><td>Red Almacén de herramientas</td><td>ESI-330</td><td>Úselo para monitorear la velocidad</td></tr> <tr><td>del mandrilSistema de curado puntual UV Omnicure con adaptador de colimación</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>Agujas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol polivinílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isoporopílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>080M7400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Factor de crecimiento nervioso (NGF)</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG</td><td></td></tr><tr><td>65:35 Ácido poliláctico-glicólico (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001554270</td><td></td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856-2L</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Ensayo de proteínas</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetoxisilil)metacrilato de propilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001558456</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

factor de crecimiento de electrospinning liberar microesferas en fibrosa andamios

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Este procedimiento describe un método para fabricar un sustrato multifacético para dirigir el crecimiento de las células nerviosas. Este sistema incorpora señales mecánicas, topográficas, adhesivas y químicas. Las propiedades mecánicas están controladas por el tipo de material utilizado para fabricar las fibras electrohiladas. En este protocolo utilizamos un 30% de ácido hialurónico (AH) metacrilado, que tiene un módulo de tracción de ~500 Pa, para producir un andamio fibroso suave. El electrogiro sobre un mandril giratorio produce fibras alineadas para crear una señal topográfica. La adhesión se logra recubriendo el andamio con fibronectina. El desafío principal que se aborda aquí es proporcionar una señal química a través de la profundidad del andamio durante períodos prolongados. Este procedimiento describe la fabricación de microesferas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) que contienen factor de crecimiento nervioso (NGF) e impregnación directa del andamio con estas microesferas durante el proceso de electrohilado. Debido al duro entorno de producción, que incluye altas fuerzas de horma y cargas eléctricas, la viabilidad de la proteína se mide después de la producción. El sistema proporciona liberación de proteínas durante más de 60 días y se ha demostrado que promueve el crecimiento de las células nerviosas primarias.

Las microesferas 50 ± 14 micras de diámetro con una proteína de encapsulación más del 85% se han producido y electrospun en andamios consistentemente. Tamaño se determinó mediante la formación de imágenes de muestras de microesferas de tres lotes de producción separadas. Las imágenes en las que capturaron en un microscopio óptico y longitudes donde mide utilizando software laboratorio comercial. Figura 1 muestra un histograma de la distribución de tamaños. Tasa de encapsulación también se ensayó a parti...

Este protocolo combina electrospinning y microesferas para desarrollar andamios de ingeniería tisular para dirigir neuronas. El factor de crecimiento nervioso se encapsuló dentro de microesferas de PLGA y se electrohiló en andamios fibrosos de ácido hialurónico (HA). La bioactividad proteica se probó sembrando los andamios con ganglios primarios de la raíz dorsal del pollito y cultivando durante 4-6 días.

Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un entorno multifacético que apoye el crecimiento y la reparación de nervios. Esto se logra primero encapsulando factores de crecimiento dentro de microesferas degradables. El segundo paso consiste en preparar el material de soporte para la mayor parte del entorno.A continuación, se combinan las microesferas y el material de soporte y se electrohilan en un andamiaje fibroso alineado. El paso final consiste en probar el andamiaje con neuronas de ganglios de la raíz dorsal de pollo. En última instancia, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia para demostrar que el crecimiento y la dirección de los neuritos se aceleran en comparación con los controles.Aunque este sistema está diseñado para tejido neural, con ligeras modificaciones en las proteínas y materiales utilizados, también podría aplicarse a diversos tipos de tejidos, incluyendo corazones, pulmones y hueso. Antes de comenzar este procedimiento, prepare los reactivos necesarios: soluciones al 2 % y al 0,5 % peso por volumen de alcohol polivinílico o PVA en agua desionizada, una solución al 2 % volumen por volumen de alcohol isopropílico y agua desionizada, y una solución acuosa de la proteína hidrofílica deseada. Coloque 40 mililitros de la solución al 0,5 % de PVA en un tubo cónico de 50 mililitros y resérvelo. En un vial pequeño, disuelva 300 miligramos de ácido poliláctico co glicólico 65 a 35 o PLGA y tres mililitros de diclorometano.Se puede utilizar un mezclador de vórtice para acelerar la disolución de PLGA combinando 200 microlitros de solución de proteína y cuatro microlitros de solución de PVA al 2%. Vierta la mezcla de proteína y PVA en la solución de PLGA. Las soluciones permanecerán principalmente separadas.Coloque el vial en un vaso de precipitados con agua y hielo utilizando un W ator a aproximadamente 10 vatios, agite la solución durante cinco a 10 segundos hasta obtener una emulsión uniforme de color blanco cremoso. Vierta la emulsión en el tubo de 50 mililitros previamente preparado que contiene PVA al 0,5 %. Mezcle la solución a alta velocidad en un mezclador vortex durante aproximadamente 20 segundos.La solución desarrollará un aspecto turbio. Transfiera la emulsión a un vaso de precipitados de 200 mililitros y colóquelo en una placa agitadora a 350 RPM durante dos minutos. Añada 50 mililitros de alcohol isopropílico al 2% al vaso de precipitados que está en la placa agitadora.Deje que la mezcla continúe agitándose durante un mínimo de una hora para permitir que el clorometano se evapore y el PLGA se endurezca. A continuación, transfiera la solución de microesferas a tubos de centrífuga y centrifugue a 425 veces G durante tres minutos. Las microesferas se acumularán en el fondo del tubo y aparecerán blancas. Retire cuidadosamente el sobrenadante del tubo por encima de las microesferas y guárdelo en un frasco de 500 mililitros.Lave las microesferas con agua desionizada llenando cada tubo hasta tres cuartas partes de su capacidad y agitándolo para redistribuir las microesferas en el líquido. Repita la centrifugación, la eliminación del sobrenadante y el lavado de las microesferas con agua desionizada cuatro veces tras el lavado final. Retire el sobrenadante y colóquelo en el frasco de 500 mililitros junto con las otras muestras.Congele las microesferas recogidas en los tubos de centrífuga a menos veinte grados Celsius durante la noche y luego liofilice durante al menos 24 horas. La siguiente solución para electrohilado debe prepararse previamente en agua desionizada: ácido hialurónico metilado o miha al 2% peso por volumen, poli(óxido de etileno) de 900 kilodalton o PEO al 3% peso por volumen y solución de iniciador fotográfico al 0,05% peso por volumen.Después de preparar el volumen deseado de solución para electrohilado, agregue microesferas a la concentración deseada hasta 400 miligramos por mililitro. Mezcle la solución en un vórtex hasta que las microesferas se distribuyan uniformemente en la solución. Transfiera la solución a una jeringa y coloque una aguja de punta roma de 18 gauge y seis pulgadas.Coloque la jeringa en una bomba de jeringa y ajústela para dispensar a 1,2 mililitros por hora. Tape el mandril con una capa de papel de aluminio. Esto permite una limpieza y almacenamiento fáciles del andamio terminado.Se utiliza un mandril giratorio para crear fibras alineadas. Conecte el cable de tierra de una fuente de alto voltaje al aparato de recolección. Conecte el cable positivo a la aguja para garantizar un electrohilado exitoso.Es muy importante verificar que todas las conexiones y configuraciones sean correctas. Inicie el bombeo del polímero y, cuando la solución sea visible al final de la jeringa, encienda la fuente de voltaje y ajuste el voltaje a 24 kilovoltios. Haga correr la solución hasta alcanzar el espesor deseado del andamio.Cuando finalice, apague la fuente de voltaje y la bomba de jeringa. Para comenzar este procedimiento, sujete cubreobjetos relacionados al área de recolección del electrohilador mediante cinta adhesiva doble cara desmontable antes del electrohilado. El hilado sobre los cubreobjetos facilita su manipulación y observación tras el electrohilado hasta el grosor deseado.Como se demostró en el segmento de video anterior, retire cuidadosamente las laminillas del mandril. Coloque las laminillas recubiertas con el andamio en una cámara transparente de nitrógeno y asegúrese de que todo el oxígeno sea eliminado. Somete la cámara y el andamio a una luz de 10 milivatios por centímetro cuadrado a 365 nanómetros durante 15 minutos.Después del entrecruzamiento, coloque las laminillas en una placa de pocillos de tamaño adecuado. Asegúrese de que el lado del andamio esté orientado hacia arriba. Coloque de 100 a 200 microlitros de medio sobre cada andamio en la placa de pocillos. Con cuidado.Coloque un ganglio de la raíz dorsal o DRG sobre cada andamio en la gota de medio. Para un andamio grueso, puede ser necesario más medio. El DRG debe estar completamente sumergido y no flotar.Incube el andamio y el ganglio de la raíz dorsal a 37 grados Celsius durante cuatro horas para permitir que las células se adhieran al andamio. A continuación, agregue el medio hasta el nivel adecuado para el pocillo. Regrese la placa al incubador e incube durante cuatro a seis días después del período de incubación.Retire cuidadosamente el medio de cada pocillo y lave suavemente una vez con PBS. Fije las células durante 30 minutos utilizando paraformaldehído al 4 % peso por volumen. Posteriormente, tiña las células para neurofilamentos y núcleos siguiendo un protocolo establecido.Para visualizar las células utilizando un microscopio fluorescente, coloque la placa de pocillos sobre la platina del microscopio y localice la masa celular utilizando los ajustes de filtro y excitación para dpi. Una vez identificada la célula, cambie el filtro a zi. Para visualizar las neuritas extendidas, utilice la función de empalme del microscopio para recopilar y combinar tantas imágenes como sean necesarias para observar toda la estructura.Repita el procedimiento para microesferas dpi, fite y de campo brillante. Mediante este protocolo se han producido de forma consistente microesferas de 50 ± 14 micrómetros de diámetro con una encapsulación de proteína superior al 85%, y se han electrohilado en andamios. Esta imagen fluorescente muestra microesferas representativas con Rodamina en la cáscara de PLGA y BSA encapsulada en su interior.Para evaluar la encapsulación, las microesferas se cargaron con BSA y se analizó la liberación de proteína durante más de 60 días mediante un ensayo de proteína de Bradford. La liberación comienza con una ráfaga inicial y luego continúa a medida que las microesferas se degradan tras la electrospinning. Las microesferas pueden observarse a lo largo de toda la estructura fibrosa tridimensional.En esta imagen de MEB del andamio completo, se pueden observar las esferas en múltiples capas indicadas por flechas. Esta imagen de alta magnificación corresponde a una microesfera con las nano fibras del andamio situadas encima.Se utilizaron ganglios de la raíz dorsal o DRG para evaluar la viabilidad del factor de crecimiento nervioso o NGF en las microesferas dentro del andamiaje. Aquí se observan DRG asentados sobre un andamiaje que contiene microesferas. Cargadas con NGF, se muestran junto a una microesfera sin proteína. Las extensiones de neuritas más largas que se extienden desde el DRG sobre el andamiaje con NGF indican que el NGF es viable y puede promover el crecimiento.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo encapsular proteínas en microesferas e incorporarlas en andamios fibrosos.

electrospinning-growth-factor-releasing-microspheres-into-fibrous

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

El proceso de electrospinning polímeros de ingeniería de tejidos y cultivos celulares se trata en este artículo. En concreto, el electrospinning de macrómeros fotorreactivos con capacidades de procesamiento adicional de photopatterning y electrospinning multi-polímero se describe.

Electrospinning andamios fibroso polímero para ingeniería de tejidos y cultivos celulares

Alineados fibras electrospun dirigir el crecimiento de las neuronas in vitro y son un componente potencial de andamios la regeneración nerviosa. Se describe un procedimiento para la preparación de sustratos electrospun fibra y el cultivo libre de suero de rata principal E15 sensorial (GRD) y las neuronas motoras. La visualización de las neuronas por inmunocitoquímica también se incluye.

La cultura de la motora primaria y las neuronas sensoriales en los medios de comunicación definidas en Electrospun poli-L-láctico andamios nanofibras

Andamios electrospun puede ser procesado post-producción para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Aquí se describen los métodos para hacer girar los andamios complejos (por hilado consecutivos), para la fabricación de andamios más gruesas (por el multi-capas usando calor o recocido de vapor), para lograr la esterilidad (la producción aséptica o esterilización de la post-producción) y para la consecución de adecuadas propiedades biomecánicas.

Postproducción de procesamiento de las Fibras electrospun de Ingeniería de Tejidos

Los nanosensores sol-gel biocompatibles que responden al pH se pueden incorporar en andamios electrohilados de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Los andamios autoinformados producidos se pueden utilizar para el monitoreo in situ de las condiciones microambientales mientras se cultivan células en el andamio. Esto es beneficioso ya que la construcción celular 3D se puede monitorear en tiempo real sin perturbar el experimento.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Un método para obtener nanofibras y nanoestructuras complejas de proteínas de la matriz extracelular individuales o múltiples se describe. Este método utiliza las interacciones proteína-superficie para la creación de materiales a base de proteínas exentas con la composición sintonizable y la arquitectura para el uso en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.

Las nanofibras ECM proteínas y Uso Asamblea Superficie iniciadas Nanoestructuras Engineered

Se informó de síntesis y fabricación de fibras electrohiladas largos que abarcan un área de depósito más grande a través de un colector de nuevo diseño de un nuevo polímero biodegradable llamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD). Las fibras fueron capaces de apoyar el crecimiento de células derivadas de células madre pluripotentes de ratón.

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A continuación, presentamos un protocolo para fabricar nanofibras andamios electrospun con organización gradated de fibras y explorar sus aplicaciones en la regulación de la morfología celular / orientación. Gradientes con respecto a las propiedades físicas y químicas de las nanofibras andamios ofrecen una amplia variedad de aplicaciones en el campo biomédico.

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Los avances en las tecnologías de biomateriales permiten el desarrollo de construcciones tridimensionales de tipo multicélula. Hemos desarrollado protocolos de electrospinning para producir tres andamios individuales para cultivar las principales células estructurales de la vía aérea y proporcionar un modelo 3D in vitro de la pared del bronquiolo de la vía aérea.

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Este protocolo sirve como una guía completa para la fabricación de andamios mediante electrospinning con polímero se funde en un modo de escritura directa. Sistemáticamente el proceso del esquema y definir la configuración de los parámetros apropiados para lograr arquitecturas específicas andamio.

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Este artículo demuestra la técnica de expansión de una estera de nanofibras electrospun (2D) tradicional, dos dimensiones en un andamio de tres dimensiones (3D) a través de la despresurización de subcritical CO2 líquido. Estos andamios aumentados son 3D, cerca mímica celular nanotopographic señales y preservar las funciones de las moléculas biológicas encapsuladas dentro de las nanofibras.

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Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios

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