-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

El objetivo general de este procedimiento es dirigirse a las neuronas internas en el cerebro de cuatro ratones en desarrollo mediante electroporación in utero. Esto se logra primero preparando las agujas de inyección. El segundo paso consiste en extraer la cadena embrionaria del animal anestesiado.

Luego se realiza la inyección de ADN y la electroforesis en el cerebro. El paso final consiste en permitir que el animal se recupere de la cirugía. En última instancia, la electroforesis in utero se utiliza para permitir el direccionamiento selectivo de subtipos de interneuronas.

La ventaja de estos métodos frente a nuestras técnicas existentes, como la electrooperación inespecífica in utero, es que proporciona los medios para llevar a cabo un análisis autónomo celular de un subconjunto de interneuronas corticales. Los altos niveles de expresión de GFP permiten la visualización y el análisis de interneuronas individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales en el campo del desarrollo neurológico, como cuáles son las reglas que rigen la integración de las interneuronas en desarrollo.

Para comenzar este procedimiento, prepare la pipeta de microinyección estirando una capilar de vidrio con un estirador de pipetas. A continuación, retire cuidadosamente la capilar y recoja la aguja inferior para la microinyección. Ahora, coloque un ratón preñado anestesiado con el lado ventral hacia arriba sobre la placa calefactora.

Cubra sus vías con una máscara que seguirá suministrando isoflurano durante toda la cirugía. Luego, aplique un lubricante ocular en ambos ojos. Configure la almohadilla térmica a 36 grados Celsius para prevenir la hipotermia posteriormente.

Verifique la ausencia de reflejos en las patas y la cola pellizcando las patas traseras o la cola. A continuación, limpie la piel del abdomen con etanol al 70%. Utilice pinzas para levantar la piel hacia arriba.

Luego, realice una pequeña incisión vertical de dos centímetros a lo largo de la línea media, comenzando en el punto medio entre el tercer y el cuarto par de glándulas mamarias. Tenga cuidado de no dañar la pared abdominal utilizando fórceps redondos. Retire suavemente la cadena embrionaria de la cavidad.

Deje que la cadena repose sobre las toallitas húmedas. Comience exponiendo una mitad del útero. Luego continúe con la electroforesis de los embriones antes de pasar a la otra mitad.

En este procedimiento, prepare la solución de ADN disolviendo el precipitado obtenido a partir de un protocolo estándar de purificación tipo maxi prep en agua destilada. Luego, agregue azul de metileno a la solución de ADN en una proporción de uno a 20 para permitir su visualización durante la inyección. A continuación, corte la punta de una micropipeta previamente estirada con pinzas finas, dejando seis milímetros desde el inicio del hombro hasta el extremo de la punta.

A continuación, cargue la micropipeta con un microlitro de solución de ADN con verde rápido para inyección. Sujete la cabeza del embrión con pinzas redondeadas. Introduzca la pipeta en el cerebro a 45 grados, dirigiéndose hacia el ventrículo lateral ubicado cerca de la línea media.

Si la aguja penetra a través del ventrículo, retire lentamente la pipeta. El ventrículo debe volverse verde cuando la solución comience a llenarlo. En ese momento, deje de mover la pipeta e inyecte un microlitro de ADN.

Luego retire suavemente la pipeta. Configure el ECM 308 a ocho pulsos de 5,45 voltios de 50 milisegundos separados por un intervalo inter-pulso de 950 milisegundos. Sumerja los electrodos de paleta de cinco milímetros en PBS para asegurar una transmisión eficiente de la corriente.

Luego coloque las paletas del electrodo alrededor de la cabeza del embrión, con una paleta positiva sobre el ventrículo que contiene la solución de ADN. Coloque la paleta positiva ligeramente más baja que la negativa para crear una corriente ventral a través de las eminencias ganglionares. Esto minimizará la expresión ectópica en las células parametales.

Ahora, administre un pulso presionando una vez el pedal del pie, luego retire los electrodos y límpielos. Repita los pasos para cada uno de los embriones. Después de electrocutar todos los embriones.

Vierta tres mililitros de PBS en la cavidad abdominal y devuelva los embriones a la cavidad abdominal. A continuación, sutúre la pared abdominal con una aguja curva y sutura de seda cinco-oh, y luego la piel. Aplique lidocaína sobre la herida y administre 120 miligramos por kilogramo de aspirina inicialmente para analgesia.

Retire el animal del tubo de anestesia y permita la recuperación sobre una toalla de papel en la almohadilla calefactora. Posteriormente, devuelva el animal a la jaula. Manténgalo sobre la almohadilla calefactora a 37 grados Celsius y supervise su estado de salud.

En este experimento, las interneuronas electroporadas se delimitan mediante la expresión de marcadores de subtipos derivados del ECG. Esta imagen muestra que las interneuronas derivadas del ECG son electroporadas con un plásmido DLX5/6-EGFP. Esta imagen muestra una interneurona que expresa VIP en el día postnatal ocho.

La expresión de EGFP delinea todo el árbol dendrítico y la arborización axonal de neuronas individuales, y aquí se muestra una interneurona que expresa NPY en P8. La expresión de NPY delinea las células de forma neurogliforme. Por último, aquí se muestra una interneurona que expresa NPY en P15.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 20 minutos si se lleva a cabo correctamente. Al combinar el uso de plásmidos específicos y líneas de ratones modificadas genéticamente, es posible lograr un control temporal y espacial en la expresión de genes de interés. En algunos experimentos, utilizamos el plásmido A-D-L-X-T-T-A para inducir la expresión de transgenes dependientes de AU.

En estos experimentos, silenciamos la expresión del transgén mediante la administración de doxiciclina.