Name: -Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Aprende a realizar electroporación in utero para dirigirte selectivamente a subtipos de interneuronas en el cerebro frontal en desarrollo del ratón. Este método permite la expresión génica específica para estudiar la función neuronal.

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Estamos muy agradecidos a Lihong Yin para la asistencia técnica. NVD es un destinatario de un Premio al Investigador Joven NARSAD y también es apoyado por subvenciones del NIH (5 K99 MH095825-02). La investigación en el laboratorio Fishell es apoyado por el Instituto Nacional de Salud, Instituto Nacional de Salud Mental (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) y la Fundación Simons.

Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas y directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Escuela de Medicina de NYU. Las cepas de ratón Ratones hembra Swiss Webster proporcionadas por TACONIC se utilizaron para estos experimentos. Con el fin de centrarse específicamente en las interneuronas de la capa superficial, se utilizaron embriones E15.5. Nota: El plásmido usado en este trabajo (Dlx5 / plásmido 6.eGFP 3 g / l) se generó usando técnicas de clonación estándar. El ADNc de EGFP se clonó en un / 6-Pmin-poliA plásmido Dlx5. Este plásmido está disponible bajo petición (demarn02@nyumc.org). 1 Preparación de microinyección Pipetas <ol><li> Ajuste el extractor de calor # 2-860. </li><li> Coloque y fije el capilar de vidrio cerca del filamento. Compruebe que el diámetro exterior (OD) de la pipeta es más o menos 30 micras. </li><li> Pulse el botón &quot;tirar&quot;. </li><li> Retire con cuidado el capilar. La parte inferior es la aguja. Deseche la parte superior. </li></ol> 2. Procedimiento Anestesia <ol><li> Preparar una cámara que contiene isoflurano. Nota: El isoflurano es el anestésico preferido debido a su rápida acción y una baja incidencia de efectos secundarios. El pentobarbital es otra opción; Sin embargo, la tolerancia de este fármaco es variable y puede conducir a una tasa de mortalidad más alta que isoflurano. </li><li> Ajuste el flujo de isoflurano al 4-5% en 0,5-1 L / min de O 2. </li><li> Asegúrese de que la válvula de la cámara está abierta, mientras que la válvula para el adaptador de la cabeza está cerrado. </li><li> Coloca el ratón embarazada en la cámara. </li><li> Deje que el ratón para ir bajo el efecto de la anestesia. Esto tomará alrededor de 2-3 minutos. Compruebe la velocidad de la respiración. Si el ratón comienza a hiperventilar, disminuir la dosis de isoflurano. </li><li> Una vez anestesiado el ratón, con prontitud y eliminar de la cámara. Colóquelo del lado ventral hacia arriba sobre el cojín eléctrico y insert la cabeza en la máscara que continuará para suministrar isoflurano durante toda la cirugía. Asegúrese de cambiar el flujo de isoflurano desde la cámara a la tubería de conexión de la pieza de adaptador de la cabeza. Ponga una gota de lubricante ocular en cada ojo y cerrar los ojos. </li><li> Ajuste la almohadilla térmica a 36 ° C grados para minimizar la hipotermia. </li><li> Compruebe la ausencia de reflejos del pie y de la cola pellizcando las patas traseras y la cola. </li></ol> 3. Cirugía <ol><li> Limpiar la piel que cubre el abdomen con etanol al 70%. </li><li> Use unas pinzas para tirar de la piel hacia arriba. Después de cada cirugía, lavar todos los instrumentos con agua y detergente, y se esterilizó a 72 ° CO / N. </li><li> Hacer una pequeña incisión vertical (alrededor de 2 cm) a lo largo de la línea media de partida a medio camino entre el tercer y cuarto pares de glándulas mamarias. Con unas tijeras quirúrgicas finas. Tenga cuidado de no dañar la pared abdominal. </li><li> Separar suavemente la piel del peritoneo. </li><li> Visualice las arteriasy las venas en la pared abdominal. Hacer otro 2 cm incisión vertical a través del peritoneo (evitando los vasos) para exponer la cavidad abdominal. </li><li> Abrazadera de la piel y la pared abdominal en cada lado de sujeción evitando las arterias. Nota: Si se perfora accidentalmente las arterias, sacrificar al animal de inmediato mediante la realización de dislocación cervical o sobredosis de isoflurano. </li><li> Pre calentar el PBS estéril a 37 ° C. Cubra las abrazaderas con PBS húmedos Kim toallitas. </li><li> La hidratación de la cavidad abdominal expuesta con PBS. Repita este paso varias veces mientras se realiza la cirugía. </li><li> Con unas pinzas redondas, tire suavemente de la cadena de embriones (E15.5) de distancia de la cavidad. Que el resto de la cadena en las toallitas húmedas. Iniciar mediante la exposición de una mitad de la primera útero. Una vez que los embriones en que se electroporación, traerlo de vuelta en el interior, a continuación, trabajar en la segunda mitad. </li></ol> 4. electroporación <ol><li> Siga usando pinzas redondas para manipular los embriones. </li><li> Visualize los ventrículos laterales. Los ventrículos laterales corren a lo largo de la línea media (Figura 1b). </li><li> Añadir Fast Green (Stock: 10% w / v) a la solución de ADN para una mezcla 01:20 de visualizar durante la inyección. Preparar la solución de ADN disolviendo el sedimento obtenido a partir de un protocolo de purificación maxi-prep estándar en agua destilada. </li><li> Utilice micropipetas pre desmenuzado con un émbolo para inyectar 1 ml de solución de ADN (Dlx5 / 6-eGFP, 3 g / l) con Fast Green. Cortar la punta de la micropipeta con un fórceps fino # 5 (Dumont) para salir de 6 mm de longitud desde el comienzo del hombro hasta el extremo de la punta de la aguja antes de cargar la pipeta. Sostenga la cabeza del embrión con pinzas redondas. Introduzca el cerebro con la pipeta en un ángulo de 45 ° con el objetivo para el ventrículo lateral situado cerca de la línea media. Si la aguja penetra a través del ventrículo, retraiga lentamente la pipeta y cuando utilice el émbolo para inyectar ADN. El ventrículo se volverá color verde cuando elsolución comienza a llenarlo. En este punto, dejar de moverse la pipeta y se inyecta 1 ml de ADN. Con cuidado, retire la pipeta. </li><li> Ajuste el electroporador CUY21 a cinco 45V pulsos de 50 ms espaciadas por 950 ms. </li><li> Utilice 5 mm electrodos de pádel para los embriones E15.5. Sumergir los electrodos en PBS para asegurar la transmisión de corriente eficiente. </li><li> Coloque las paletas de electrodos alrededor de la cabeza del embrión con la paleta positivo en el ventrículo que contiene la solución de ADN. Ligeramente inferior de la paleta positiva con respecto a la negativa para crear una corriente ventral a través de las eminencias ganglionares. Esta manipulación se minimizará la expresión ectópica en las células piramidales. </li><li> Después de la colocación de los electrodos, aplicar un pulso al presionar el pedal una vez. </li><li> Retire los electrodos y límpielos. Repita los pasos 4.6 a 4.9 con cada embrión. </li><li> Después de la electroporación todos los embriones, vierta 3 ml de PBS en la cavidad abdominal y devolverlos a la cavidad abdominal. </li><li>Primera sutura de la pared abdominal con una aguja curva y sutura de seda 5-0 y luego la piel. Aplicar lidocaína (4%) sobre la herida. Administrar 120 mg / kg de aspirina peritoneo intra de la analgesia. Nota: Todo el procedimiento se debe realizar en 20 min o menos. Es aconsejable que los principiantes electroporar sólo unos pocos embriones para mantener el tiempo de funcionamiento corto. Cirugías prolongadas disminuirán la tasa de supervivencia de los embriones. </li><li> Retire el animal de la tubería de la anestesia y permitir la recuperación sobre el cojín eléctrico en una toallita de papel. </li><li> Animales Regresar a la jaula, manténgalo sobre el cojín eléctrico a 37 ° C y monitorear el estado de salud. Los animales toleran generalmente bien de la cirugía y comienzan a moverse lentamente poco después de que se retiran de la tubería de la anestesia. Si se observa sangrado excesivo o letargo, sacrificar al animal inmediatamente realizando IACUC aprobó proceder a la eutanasia como la dislocación cervical o sobredosis de anestesia. </li><li> Jaula Volver a la vivarium. Las hembras dan a luz de forma natural. </li></ol>

<ol><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%26%2334%3Bwhere+the+wild+things+are%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &#34;where the wild things are&#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence%3A+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li>
<li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLX-1%2C+DLX-2%2C+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li>
<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li>
<li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Dlx-2+%28Tes-1%29+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain%2C+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1%2C+Dlx-2+%28Tes-1%29%2C+Gbx-2%2C+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li>
<li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+biologist%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li>
<li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Limitaciones de la Técnica Si bien esta técnica permite la célula de análisis autónoma de procesos celulares, no es adecuado para el análisis de la población. Los electroporaciones son muy escasos con menos de mil células por electroporación cerebro. Como consecuencia, la técnica no se puede utilizar para evaluar las consecuencias de comportamiento derivados de la manipulación genética de las interneuronas derivados de CGE. Mientras electroporaciones llevaron a c...

La mayor parte de las interneuronas GABAérgicas corticales se originan a partir de dos estructuras embrionarias transitorias nombradas las eminencias ganglionares medial y caudal (MGE y CGE, respectivamente) 4. Parvalbúmina y somatostatina expresar interneuronas se originan en el MGE mientras Calretinina (Cr), vasointestinal péptido (VIP) y Reelin (Re) que expresa interneuronas son originarios de la CGE. Estos subtipos de interneuronas pueden ser distinguidos por sus fechas de nacimiento. MGE subtipos derivados nacen entre el día embrionario 9.5 (E9.5) y E16.5 5,6. En contraste, las interneuronas CGE derivadas nacen de E12.5 E18.5 a través con su producción alcanzando un máximo de 6 E15.5. La selección genética de esta población nació tarde, sin embargo, sigue siendo difícil de alcanzar. Los distal-less genes murinos (Dlx) se expresan exclusivamente en el prosencéfalo ventral desarrollo 3. Interneuronas GABAérgicas y las neuronas de proyección estriatales pero las células piramidales corticales no expresan Dlx1, 2,5, y 6 genes en las etapas tempranas del desarrollo 3. De hecho, los genes Dlx se expresan en la zona MGE y CGE subventricular (SVZ) en todos los progenitores GABAérgicas. La expresión de estos genes se restringe para seleccionar subtipos en las etapas postnatales 7-9. Evidencia experimental anterior mostró que el elemento potenciador Dlx5 / 6 permite el señalamiento selectivo de linajes GABAérgicas en modelos de ratones transgénicos 2. Hemos probado el uso de uno de estos elementos potenciadores en el contexto de expresión episomal en el cerebro de ratón en desarrollo. Se subclonó el elemento potenciador Dlx5 / 6 junto con un promotor mínimo y la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en un Bluescript (BS) plásmido columna vertebral (Figura 1). Hemos introducido el plásmido mediante electroporación en el útero en E15.5 para atacar selectivamente Cr-, VIP e Investigación subtipos 3,8,10. Nuestra técnica permite la electroporación escasa, lo que facilitala reconstrucción de las características morfológicas de las células chamusquina. Además, los niveles excepcionalmente altos de expresión génica en neuronas GABAérgicas corticales permite para los estudios funcionales. Hemos llevado a cabo la pérdida y ganancia de estudios de la función utilizando varios tipo silvestre y genes dominantes negativos 11.

<table><tbody><tr><td>Electroporador&nbsp; con pedal</td><td>Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>5 mm paletas electrodos&nbsp;</td><td>Protech International</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-15</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Instruments P30 Puller&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>3282322</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac Sistemas de Anestesia</td><td>Harvard Aparato 726425</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de Operación Delicadas 4.75" Recta Sharp/Sharp</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Trenza Negra de Seda 18" C-1 Caja 36&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>Micro Clip Pinzas de Aplicación 5.5 "</td><td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2 Tijeras de Abrazadera</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de Sujeción&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidrio&nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm</td></tr><tr><td>ID Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de vida estériles PBS</td><td></td><td>20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

-subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

El estudio del sistema nervioso (CNS) central de la maduración depende de la orientación genética de poblaciones neuronales. Sin embargo, la tarea de restringir la expresión de genes de interés para los subtipos neuronales específicas ha demostrado ser notablemente difícil debido a la escasez relativa de los elementos específicos del promotor. Interneuronas GABAérgicas constituyen una población neuronal con amplia diversidad genética y morfológica. De hecho, más de 11 subtipos diferentes de interneuronas GABAérgicas se han caracterizado en la corteza del ratón 1. Aquí presentamos un protocolo adaptado para la orientación selectiva de poblaciones GABAérgicas. Hemos logrado subtipo dirección selectiva de las interneuronas GABAérgicas utilizando el elemento potenciador de la transcripción homeobox factores Dlx5 y Dlx6, homólogos de la (DLL)-gen distal Drosophila menos 2,3, para conducir la expresión de genes específicos a través de la electroporación en el útero.

Se adaptó la técnica de electroporación en el útero para lograr el tipo de célula orientación específica de las neuronas maduras. Para conducir la expresión de EGFP en interneuronas derivados de CGE, se utilizó el elemento potenciador Dlx5 / 6 y restringido nuestro inyecciones a E15.5, la etapa en que la mayoría de las interneuronas derivados de CGE se generan. Hemos llevado a cabo el análisis en P8 y P15 11 (Figuras 1 y 2). Se confirmó el origen ventral de ...

Este procedimiento muestra cómo dirigirse a las interneuronas en el prosencéfalo del ratón en desarrollo mediante electroporación en el útero. Esta técnica fue particularmente eficiente para lograr la expresión génica selectiva en subtipos de interneuronas destinadas a las capas superficiales de la corteza.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

El objetivo general de este procedimiento es dirigirse a las neuronas internas en el cerebro de cuatro ratones en desarrollo mediante electroporación in utero. Esto se logra primero preparando las agujas de inyección. El segundo paso consiste en extraer la cadena embrionaria del animal anestesiado.Luego se realiza la inyección de ADN y la electroforesis en el cerebro. El paso final consiste en permitir que el animal se recupere de la cirugía. En última instancia, la electroforesis in utero se utiliza para permitir el direccionamiento selectivo de subtipos de interneuronas.La ventaja de estos métodos frente a nuestras técnicas existentes, como la electrooperación inespecífica in utero, es que proporciona los medios para llevar a cabo un análisis autónomo celular de un subconjunto de interneuronas corticales. Los altos niveles de expresión de GFP permiten la visualización y el análisis de interneuronas individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales en el campo del desarrollo neurológico, como cuáles son las reglas que rigen la integración de las interneuronas en desarrollo.Para comenzar este procedimiento, prepare la pipeta de microinyección estirando una

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

En la electroporación in utero es un método valioso para la transfección de células progenitoras neuronales in vivo. Dependiendo de la colocación de los electrodos y el punto de tiempo en el desarrollo de la electroporación, ciertos subconjuntos de células corticales pueden ser atacadas. Células afectadas puede ser analizada en vivo o in vitro para los efectos de la alteración genética.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

Este artículo describe en detalle un protocolo para electroporar en el útero de la corteza cerebral y el hipocampo en E14.5 en ratones. También se muestra que este es un método valioso para estudiar las dendritas y espinas en estas dos regiones cerebrales.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Este video demuestra el protocolo para la electroporación de genes unicelulares en neuronas excitadoras e inhibidoras en una variedad de cultivos de cortes de hipocampo in vitro. La técnica es útil para examinar funciones moleculares y fisiológicas específicas de las neuronas, incluidos los mecanismos autónomos de las células y las interacciones transsinápticas de proteínas.

Electroporación de una sola célula en cultivos organotípicos de cortes de cerebro: una técnica in vitro para administrar plásmidos dentro de neuronas específicas en cortes de hipocampo cerebral

Fuente: Denaxa, M., el al., Trasplante de progenitores interneuronales corticales modificados quimiogenéticamente en cerebros de ratón posnatales tempranos. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el procedimiento para inyectar un vector plásmido que lleva el gen de interés en progenitores interneuronales en un corte de cerebro embrionario, seguido de electroporación para la entrada de plásmidos y la expresión génica. Estos progenitores modificados se pueden usar más tarde para tratar...

Transferencia de genes asistida por electroporación integrada en agarosa en progenitores de interneuronas corticales de ratón

La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el destino y las propiedades de las...

Neonatal electroporación superficie pial

Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

Aquí presentamos un protocolo, diseñado para utilizar herramientas quimiogenéticas para manipular la actividad de los progenitores interneuronales corticales trasplantados a la corteza de los primeros ratones postnatales.

Trasplante de progenitores interneuronas corticales de ingeniería química en cerebros de ratón postnatal temprano

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.

Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Aquí, presentamos la manipulación genética aguda de organoides corticales humanos cortados en rodajas por electroporación. Estos modelos de organoides corticales son particularmente susceptibles a la inyección, ya que las estructuras similares a los ventrículos se pueden identificar fácilmente después del corte, lo que permite la investigación funcional del desarrollo cortical humano, los trastornos del neurodesarrollo y la evolución cortical.

Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica

Aprende a realizar electroporación in utero para dirigirte selectivamente a subtipos de interneuronas en el cerebro frontal en desarrollo del ratón. Este método permite la expresión génica específica para estudiar la función neuronal.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

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