Name: Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende el método de cultivo en monocapa no colonial para células madre pluripotentes humanas utilizando inhibidores de Rho-associated kinase y laminina 521. Esta técnica permite obtener grandes cantidades de células homogéneas para manipulación genética y descubrimiento de fármacos.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) en el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares. Nos gustaría agradecer al Dr. Ronald D. McKay por su discusión y comentarios sobre este proyecto.

Basada en células Individual tipo no colonia monocapa (NCM) cultura de hPSCs. 1. Preparación <ol><li> Hacer 500 ml de medio de cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs): medio DMEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, y 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA). </li><li> Aislar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) células derivadas de la cepa CF1 siguiendo un protocolo de rutina 16 y la cultura MEFs en 0,1% 6-así placa de cultivo celular recubierto con gelatina en medio DMEM. Alternativamente, comprar acciones del MEF en el paso 3 de los recursos comerciales. </li><li> Preparar placas Matrigel. <ol><li> Diluir 5 ml de células madre calificado Matrigel acción con 5 ml de medio DMEM/F12 (refrigerado a ~ 4 ° C) y la tienda de un 50% de alícuotas en un -20 ° C congelador. Descongelar la Matrigel de stock congelado en un refrigerador (~ 4 ° C) O / N y más diluir el Matrigel en medio DMEM/F12 frío (para dar lugar a una concentración de trabajo 2,5%). </li><li&gt; Coat 6-y placas de cultivo celular con 1,5 ml de 2,5% de Matrigel por pocillo, almacenar las placas recubiertas en el refrigerador O / N (Nota: utilizar la placa recubierta con Matrigel dentro de 2 semanas). </li><li> Retire la placa de Matrigel del refrigerador, deje que la placa se caliente a temperatura ambiente en la campana de cultivo de células de 10 a 30 min (Nota: no calentar la placa en una incubadora de cultivo celular), y aspirar DMEM medio antes de chapado hPSCs. </li></ol></li><li> Hacer 500 ml de medio de células madre: 80% medio DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 0,1 mM de β-mercaptoetanol, y 4 ng / ml de FGF-2. </li><li> Preparar 10 ml de 2X HPSC medio de congelación: 60% de SFB, 20% de DMSO y 20 M Y-27632 en medio mTeSR1, esterilizar por filtración, y utilizar el medio plazo de 1 semana. </li></ol> . 2 Protocolo 1 (Básico): Crecen HPSC Colonias en Alimentadores <ol><li> Use los números de paso del MEF a las 5 o 6 (designado como P5 y P6) para la cultura HPSC el fin de obtener resul consistentets. Mitóticamente inactivar MEFs mediante el tratamiento de las células con 10 g / ml de mitomicina C durante 3 horas a 37 ° C, se lavan las células 3 veces con fosfato solución salina tamponada con 1X de Dulbecco (D-PBS), y a continuación se disocian los MEFs con 0,05% de tripsina en 0,53 mM EDTA. Alternativamente, irradiar MEFs a una dosis de 8.000 rads con un irradiador de rayos X. </li><li> Contar el número de células usando el método de exclusión con tinción de azul de tripano bajo el microscopio. Como alternativa, utilice un contador de células automático. </li><li> Placa MEFs irradiadas en placas de poliestireno de 6 pocillos recubiertas con 0,1% de gelatina a una densidad de 1,88 x 10 5 células por pocillo (es decir, 1,96 x 10 4 células / cm 2). Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas. </li><li> Retire el medio de cultivo MEF mediante aspiración con una pipeta Pasteur (Nota: no hay pasos de lavado necesarios en este momento). </li><li> Colonias Triturar HPSC de cultivo previo en pequeños grupos, examinan los grumos con el microscopio para asegurar que sus tamaños que van from 50 a 100 micras de diámetro, y la placa grumos HPSC en la parte superior de las capas alimentadoras MEF en un pocillo que contiene 2 ml de medio HPSC. </li><li> Cambie hESC medio día durante 3 a 5 días, récord de crecimiento de colonias por fotografía, marcar cualquier colonias morfológicamente alterados o diferenciados (~ 5%), y quitar manualmente las colonias marcadas por aspiración suave con una pipeta Pasteur. </li><li> Enjuague las colonias restantes en MEFs dos veces (2 min cada uno con D-PBS), e incubar las colonias con 2 ml de 1 mg / ml de colagenasa IV en medio HPSC durante 10 a 30 min), y examinar el desprendimiento de colonias HPSC de la superficie recubierta-MEF (Nota: use un raspador para ayudar al proceso de desprendimiento sólo si las colonias están estrechamente unidos a la placa). </li><li> Añadir 5 ml de medio de HPSC a cada pocillo para minimizar las reacciones enzimáticas, las colonias de la transferencia a un tubo de 15 ml, permitir colonias HPSC sedimentar durante 3 a 5 min a TA, y garantizar la sedimentación de colonias por visualización directa de la Cells en la parte inferior del tubo (Nota: No centrifugue el tubo en este paso). </li><li> Retire los sobrenadantes que contienen MEFs residuales y disociada células individuales, volver a suspender las colonias con 5 ml de medio de células madre, y repetir la etapa de sedimentación en dos ocasiones. </li><li> Retire las medianas, las colonias se tritura HPSC en pequeños grupos, tienda en 1X HPSC medio de congelación (o medio de congelación CryoStore CS10) para la crioconservación (1 confluentes bien por vial congelado) o la placa en una placa de 6 pocillos de pases celulares. </li></ol> 3 Protocolo 2:. Convertir HPSC Colonias de Comederos para NCM <ol><li> Enjuague pellets de HPSC en D-PBS una vez, incubar los gránulos con 1 ml de 1X Accutase durante 10 min, y examinar la reacción enzimática bajo un microscopio para asegurarse de disociación de una sola célula. </li><li> Terminar las reacciones enzimáticas resuspendiendo suavemente las células en 5 ml de medio mTeSR1 que contiene 10 mM de Y-27632 seguido por centrifugación a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 min(Nota, no utilice fuerzas de centrifugación excesivas que causan daño celular). </li><li> Añadir 5 ml de medio mTeSR1 al sedimento, resuspender el precipitado como células individuales, y el filtro se disoció las células a través de un filtro de células de 40 m (para eliminar cualquier agregados celulares residuales). </li><li> Semillas 1,3-2 x 10 6 hPSCs en un pocillo (1.4 a 2.1 x 10 5 células / cm 2) de una placa de 6 pocillos recubiertos con el 2,5%-hESC calificado Matrigel, añadir medio mTeSR1 hasta 2,5 ml, y se compone de 10 M Y-27632 en el medio (para facilitar la 24 hr placa inicial de una sola célula). Como alternativa, utilice los siguientes moléculas pequeñas para reemplazar 10 M Y-27632 para mejorar chapado de una sola célula: 1 M Y-39983 (ROCK I inhibidor), 1 phenylbenzodioxane mM (inhibidor ROCA II), 1 mM thiazovivin (un inhibidor de la ROCA novela) , y el inhibidor de JAK 2 M 1. </li><li> Sustituya el medio con medio mTeSR1 libre de drogas, al día siguiente (dentro de las 24 horas), disociar las células de una extraasí, y contar el número de células para determinar eficiencia de plaqueo de una sola célula (Nota: aproximadamente, 50 a 90% de eficiencia de deposición electrolítica de una sola célula que se puede lograr en esta etapa). </li><li> Permita que las células crezcan como una sola célula-formado monocapa durante unos días con 3 ml de medio mTeSR1. Cambio de medio al día. </li><li> Empíricamente determinar el calendario de pases adaptado NCM dependiendo de la densidad celular. Pasaje cuando el crecimiento celular alcanza la confluencia en el día 3 o 4 días, o en el punto de tiempo de 4 horas después de la desaparición de las fronteras de célula a célula. Disociar las células en 1 ml de Accutase, utilizar una relación de división de 1 a 3 (es decir, 1 confluentes bien de células cultivadas en placas en 3 pocillos de placa de 6 pocillos) para los pases de células, y estabilizar adaptado NCM por 5 pasajes. </li><li> Congelación de la célula <ol><li> Utilizar un pozo confluente (~ 5-6 x10 6 células) para un vial congelado: disociar las células de un confluente bien con 1 ml de Accutase durante 10 min. </li><li> Diluir wITH 5 ml de células medianas y centrifugar mTeSR1 como se describió anteriormente. </li><li> Resuspender el sedimento en 500 l de medio de mTeSR1 y luego añadir lentamente 500 l de 2X HPSC medio de congelación (que contienen 20 mM de Y-27632) en un vial de crioconservación. Alternativamente, resuspender las células en 1X HPSC medio de congelación que contienen inhibidor de JAK 2 M 1 o medio 1X CryoStor CS10 en presencia de ya sea 10 M Y-27632 o 2 inhibidor de JAK M 1. </li><li> Coloque los viales congelados en un recipiente criogénico enfriada con hielo (abajo llena con isopranol) y transferir el recipiente criogénico a -80 ° C congelador inmediatamente. </li><li> Células de transferencia del -80 ° C congelador a un tanque de nitrógeno líquido (al día siguiente) para la crioconservación a largo plazo. </li></ol></li><li> Descongelación celular <ol><li> Utilizar un vial de crioconservación para recubrir 1 pocillo de una placa de 6 pocillos. </li><li> Medio mTeSR1 Pre-caliente en un baño de agua a 37 ° C durante 10 min, las células de deshielo en el mismo baño de agua durante 2 min,gota a gota añadir células a 5 ml de medio mTeSR1 pre-calentado que contienen 10 mM de Y-27632, y se centrifuga como se describió anteriormente. </li><li> Resuspender suavemente los sedimentos de células con 2 ml de medio mTeSR1 que contienen 10 mM de Y-27632 y transferir lentamente las células a un pocillo de pre-recubierta con Matrigel (Nota: evitar la producción de burbujas de aire). </li><li> Cambiar medio diario y esperamos que el crecimiento HPSC alcanzar confluencia en el día 3 o 4. </li></ol></li></ol> 4 Protocolo 3:. Convertir HPSC colonias en Matrigel a NCM Cultura <ol><li> Quitar una placa recubierta con Matrigel del refrigerador, coloque la placa en la campana de cultivo de tejidos de 10 a 30 min, se elimina el medio de cada pocillo de la placa, y añadir 2 ml de medio mTeSR1 precalentado a cada pocillo. </li><li> Transferencia trituró grupos HPSC de la cultura alimentador (Paso 2,10 del protocolo básico) a la placa de Matrigel anteriormente. Añadir medio mTeSR1 hasta 2,5 ml de volumen final en cada pocillo. </li><li> Cambie medio diario del 3 al 4 díass hasta que las colonias alcanzan 80 a 90% de confluencia. </li><li> Para pases de células: aclarar las colonias con D-PBS dos veces, el tratamiento de las células con 1 ml de 2 mg / ml dispasa a 37 ° C durante 15 a 20 minutos, y de sedimentos y de paso de células en forma de grumos. </li><li> Para la cultura NCM: repita los pasos 3.1 a 3.9 describen en el Protocolo 2. </li></ol> 5 Protocolo 4:. NCM Cultura de hPSCs sobre LN-521 <ol><li> Descongelar la solución recombinante LN-521 a 4 ° C antes de que el día de uso y hacer que la solución de revestimiento laminina (LCS) diluyendo la laminina descongelado con 1X D-PBS (que contiene Ca 2 + / Mg 2 +) a una concentración final de 10 g / ml. </li><li> Añadir 1 ml de la LCS a un pocillo de placa de 6 pocillos (nota: evitar en seco durante el proceso de recubrimiento). </li><li> Sellar la placa recubierta con Parafilm para evitar la evaporación y almacenar el plato en el refrigerador (4 ° C) O / N (nota: utilizar la placa dentro de 1 semana). </li><li> Retire con cuidado los LCS con una pipeta Pasteur y sin queuching la superficie recubierta y añadir 2 ml de medio mTeSR1 a un pocillo. </li><li> Calentar todas las soluciones de cultivo (incluyendo D-PBS) en un baño de agua a 37 ° C durante 25 min. </li><li> Convertir colonias HPSC a NCM <ol><li> Disociar agregados celulares de células individuales con Accutase como se describe en el Protocolo 2. </li><li> Semillas 1,3-2 x 10 6 hPSCs en una sola LN-521 con revestimiento de pozo (1.4 a 2.1 x 10 5 células / cm 2), sin la presencia de inhibidores de ROCK. </li><li> Cambio de medio al día durante 3 a 4 días. </li><li> Disociar las células en 1 ml de Accutase en el día 3 o 4 para la próxima pases de células utilizando una relación de división de 1 a 3. </li></ol></li></ol> . 6 Protocolo 5: NCM cultura para el ADN plásmido transfección <ol><li> Adaptar colonias HPSC a la cultura NCM como se describe en los Protocolos 2 a 4. </li><li> Placa disociado hPSCs en placa de 12 pocillos con una densidad celular de 7,5 x 10 5 células / pocillo en medio mTeSR1 en presencia de 10 mM de Y-27632. </li><li> Reemplace medio mTeSR1 con medio mTeSR1 libre de drogas entre 4-8 horas después de la siembra de las células. </li><li> Para cada transfección, diluir 2,5 g de plásmidos de expresión (por ejemplo, pmaxGFP) y 5 l de Lipofectamine 2000 en tubos Eppendorf separados en 125 l de cada uno de Opti-MEM medio de suero reducido. </li><li> Después de 5 min, mezclar los reactivos diluidos y se incuba durante 20 min a TA (para formar complejos de transfección). </li><li> Agregue los complejos de transfección mu l 250 a cada pocillo que contiene hPSCs en 1 ml de medio mTeSR1 e incubar las células a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 24 horas. </li><li> Examinar la eficacia de la transfección con un microscopio de fluorescencia y la fotografía al azar para el cálculo de la eficiencia de transfección real. </li></ol> . 7 Protocolo 6: NCM Cultura para la transfección de microARNs <ol><li> Disociar hPSCs semi-confluentes en el día 2, en condiciones NCM añadiendo 1 ml de Accutase por pocillo en 6<html> Y placa. </li><li> Añadir 10 ml de medio mTeSR1 para diluir las reacciones enzimáticas y centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender el sedimento celular con medio mTeSR1, sembrar las células a una densidad de 7,5 x 10 5 células por pocillo en una placa de 12 pocillos en un medio que contiene 10 mM mTeSR1 Y-27632, y dejar que las células se adhieren durante 4 horas. </li><li> Sustituya el medio con medio Y27632 libre mTeSR1. </li><li> Utilice disponible comercialmente microRNAs (por ejemplo, un miRIDIAN miRNA control de transfección no dirigido etiquetado con Dy547). Valorar concentraciones que van desde 0 hasta 160 nM usando los reactivos proporcionados y siga las instrucciones del fabricante. </li><li> Optimizar la eficacia de transfección para cada concentración en líneas HPSC por imágenes de la fluorescencia Dy547 de las células vivas con un microscopio a las 24 horas después de la transfección. </li><li> Cálculo de las eficiencias de transfección basados ​​en el porcentaje de células positivas Dy547 sobre todas las células de imágenes. </li></ol>. tle &quot;&gt; 8 Protocolo 7: NCM Cultura para la transducción de vector lentiviral <ol><li> Repita los pasos 7.1 a 7.4 del Protocolo 6. </li><li> Calcule las cantidades de partículas virales que se utilizarán para la transducción: Utilice la siguiente fórmula: TU = (MOI x CN) / VT, mientras que TU denota el número total de unidades de transformación, MOI es igual a la multiplicidad deseada de la infección en el pozo (MOI o TU / célula), CN especifica el número de células en cada pocillo, y VT indica los títulos virales de archivo (TU / ml). Por ejemplo, dado que los títulos virales de acciones para SMART-shRNA vector es igual a 1 x 10 9 TU / ml (unidades de transformación por ml), 7,5 x 10 5 células por pocillo en el momento de la transducción, y una MOI esperado de 20: uso de 15 l de las partículas virales de valores para cada bien (nota: se recomienda esta condición para la inducción lentiviral transitorio). </li><li> Pre-caliente 300 l de medio de mTeSR1 con 10 mg / ml de polibreno durante 30 min. </li><li> Añadir 15 l de partículas virales de acciones enel medio mTeSR1 precalentado que contiene polibreno y mezclar suavemente la solución. </li><li> Reemplazar el medio de cultivo celular con 300 l de medio precalentado que contienen las partículas virales. </li><li> Después de 4 horas de incubación, examinar turboGFP fluorescencia (una máquina para la expresión shRNA) para determinar la eficacia de la transducción. </li><li> Añadir 300 l de medio de mTeSR1 adicional a la transducción bien cuando las células comienzan a expresar turboGFP. </li><li> Después de 12-16 horas de incubación, examinar de nuevo la expresión turbo-GFP. </li><li> Lleve a cabo los experimentos de seguimiento deseados con estas células transducidas dentro de 72 horas. </li></ol>

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<li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+laminins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).</li>
<li>Liew, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum+and+feeder-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media.</a> Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Hay dos formas principales para hPSCs de cultivo in vitro: cultura convencional de tipo colonia (de las células en los comederos o matrices extracelulares) y de cultivo en suspensión de hPSCs como agregados sin alimentadores 6. Las limitaciones de los métodos de cultivo, tanto de tipo colonia y suspensión incluyen la heterogeneidad acumulada y los cambios epigenéticos heredables. Cultura NCM, basada tanto en los pases de una sola célula y de las planchas de células de alta densidad, represen...

La capacidad de hPSCs para diferenciar hacia los tejidos adultos multilinaje ha abierto nuevas vías para el tratamiento de pacientes que sufren de enfermedades graves que involucran cardiovasculares, hepáticas, pancreáticas, y los sistemas neurológicos 1-4. Varios tipos de células derivadas de hPSCs también proporcionarían plataformas móviles robustos para el modelado de la enfermedad, la ingeniería genética, la detección de drogas y 1,4 pruebas toxicológicas. La cuestión clave que garantiza sus futuras aplicaciones clínicas y farmacológicas es la generación de un gran número de hPSCs de grado clínico a través de cultivo celular in vitro. Sin embargo, los sistemas de cultivo actuales son insuficientes o intrínsecamente variables, diversos cultivos de alimentación y libres de alimentador de hPSCs como colonias 5,6. Crecimiento de tipo colonia de acciones hPSCs muchas características estructurales de la masa celular interna (ICM) de embriones de mamíferos tempranos. El ICM es propenso a diferenciarse en las tres capas germinalesen un entorno multicelular debido a la existencia de gradientes de señalización heterogéneos. Por lo tanto, la adquisición de la heterogeneidad en el desarrollo embrionario temprano se considera como un proceso necesario para la diferenciación, pero una característica no deseada de la cultura HPSC. La heterogeneidad en la cultura HPSC es a menudo inducida por señales apoptóticas excesivas y diferenciación espontánea debido a las condiciones de crecimiento subóptimas. Por lo tanto, en el tipo de colonia de cultivo, las células heterogéneas se observan a menudo en la periferia de las colonias 7,8. También se ha demostrado que las células en células madre embrionarias (células madre) colonias de respuestas diferenciales de exposición a moléculas de señalización tales como BMP-9 4. Por otra parte, los métodos de cultivo de colonias producen rendimientos bajos de células, así como las tasas de recuperación muy bajo de células de la criopreservación, debido a las tasas de crecimiento incontrolable y señalización apoptótica pathways 6,9. En los últimos años, diversos cultivos en suspensión han sido desarrollados para hPSCs de cultivo, particulArly para la expansión de grandes cantidades de hPSCs en subordinado, y las condiciones de matriz libre 6,10-13. Obviamente, diferentes sistemas de cultivo tienen sus propias ventajas y desventajas. En general, la naturaleza heterogénea de hPSCs representa uno de los principales inconvenientes en los métodos de tipo colonia y cultura agregada, que son subóptimas para la entrega de materiales de ADN y de ARN en hPSCs para la ingeniería genética 6. Claramente, existe una necesidad imperiosa de desarrollar nuevos sistemas que evitan algunas deficiencias de los métodos de cultivo actuales. Los descubrimientos de inhibidores de moléculas pequeñas (como el inhibidor de la ROCA Y-27632 y JAK inhibidor 1) que mejoran la supervivencia de una sola célula preparan el terreno para el cultivo disociado-HPSC 14,15. Con el uso de estas moléculas pequeñas, hemos desarrollado recientemente un método de cultivo basado en el tipo no-colonia (NCM) de crecimiento de-hPSCs disociadas 9. Este método de cultivo de la novela combina pases de una sola célula y de alta densidadchapado métodos, que nos permite producir grandes cantidades de hPSCs homogéneas bajo ciclos de crecimiento consistentes sin mayores anomalías cromosómicas 9. Alternativamente, la cultura NCM podría ser implementado con diferentes moléculas pequeñas y matrices definidas (tales como lamininas) con el fin de optimizar el método de cultivo para amplias aplicaciones. A continuación, presentamos varios protocolos de detalle sobre la base de la cultura NCM y delinear los procedimientos detallados para la ingeniería genética. Para demostrar la versatilidad de los protocolos de NCM, también a prueba la cultura NCM con inhibidores de ROCK diversos y con la única isoforma laminina 521 (es decir, LN-521).

<table><tbody><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Conteo automático de células</td></tr><tr><td>Sistema de rayos X de gabinete Faxitron</td><td>Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL&nbsp;</td><td>Modelo RX-650</td><td>Irradiación de rayos X de MEFs</td></tr><tr><td>MULTIWELL Placas de 6 pocillos</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>353046</td><td>Placas de poliestireno</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11965 y ndash; 092</td><td>Para el medio MEF</td></tr><tr><td>Mitomicina C Roche</td><td></td><td>107409</td><td>Inhibidor mitótico</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>25300-054</td><td>Para disociación de MEF</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11330 y ndash; 032</td><td>Para hPSC medio</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Suero Reducido Medio&nbsp;</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>31985-062</td><td>Para transfección hPSC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash; 044</td><td>Componente del repuesto MEF medium</td></tr><tr><td>Knockout Serum</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>10828 y ndash; 028</td><td>KSR, Componente del medio hPSC</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td>D-PBS, libre de Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Invitrogen</td><td>11140&ndash; 050</td><td>NEAA, componente del medio hPSC</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>25030&ndash; 081</td><td>Componente del medio hPSC</td></tr><tr><td>mTeSR1 & Suplementos</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>Sin proteína animal</td></tr><tr><td>TeSR2 & Suplementos</td><td>StemCell Technologies</td><td>5860</td><td>Medio libre de xeno</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M7522</td><td>Componente de hPSC medio</td></tr><tr><td> MEF (CF-1) ATCC</td><td>Colección de Cultivos Tipo Americanos (ATCC)&nbsp;</td><td>SCRC-1040</td><td>Para el cultivo alimentador de hPSCs</td></tr><tr><td>Matrigel BD Bioscience con calificación hESC</td><td></td><td>354277</td><td>Para el cultivo sin alimentador de hPSCs</td></tr><tr><td>Laminina-521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td>Proteína recombinante humana</td></tr><tr><td>FGF-2 (FGF recombinante, básica)</td><td>R& D Systems, MN</td><td>223-FB Factor de</td><td>crecimiento en medio hPSC</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>1X solución enzimática mixta</td></tr><tr><td>inhibidor de JAK I</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>420099</td><td>Un inhibidor de la quinasa Janus</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>688000</td><td>Inhibidor de ROCK</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>Inhibidor de ROCK</td></tr><tr><td>Y-39983</td><td>Stemgent</td><td>04-0029</td><td>Inhibidor de ROCK</td></tr><tr><td>I Phenylbenzodioxane</td><td>Stemgent</td><td>04-0030</td><td>Inhibidor de ROCK II</td></tr><tr><td>Tiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Un nuevo inhibidor de ROCK</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer</td><td>BD Bioscience</td><td>352340</td><td>40 &micro; m filtro</td></tr><tr><td>de células Nalgene 5100-0001 Cryo 1 &deg; C</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>C6516F-1</td><td>"Sr. Helado" Contenedor de congelación</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11668-027</td><td>Reactivos de transfección</td></tr><tr><td>DharmaFECT Duo</td><td>Thermo Scientific</td><td>T-2010-02</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>MiRIDIAN no dirigido Control de transfección de miARN</td><td>Thermo Scientific</td><td>IP-004500-01-05</td><td>Marcado con Dy547, para monitorizar la entrega de microARN&nbsp;</td></tr><tr><td>SMART-shRNA</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Por determinar</td><td>Vector lentiviral</td></tr><tr><td>pmaxGFP</td><td>amaxa Inc (Lonza)</td><td>Incluido en cada kit de transfección</td><td>Plásmido de expresión para el control de la transfección</td></tr><tr><td>Oct-4 Santa</td><td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-5279</td><td>IgG2b de ratón, marcador pluripotente</td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21702</td><td>IgM de ratón, marcador de diferenciación</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Santa Cruz Biotecnología</td><td>sc-21704</td><td>IgG3 de ratón, marcador pluripotente</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21705&nbsp;</td><td>IgM de ratón, marcador pluripotente</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21706</td><td>IgM de ratón, marcador pluripotente</td></tr><tr><td>CK8 (C51)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8020</td><td>IgG1 de ratón, contra citoqueratina 8</td></tr><tr><td>&alfa;-fetoproteína</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8399</td><td>AFP, IgG2a</td></tr><tr><td>de ratón HNF-3&beta; (P-19)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9187</td><td>FOXA2, anticuerpo policlonal de cabra</td></tr><tr><td>Troponina T (Av-1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-295-P0</td><td>Ratón IgG1</td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9014-P1</td><td>Conejo IgG</td></tr><tr><td>Anti-NANOG</td><td>ReproCELL Inc, Japón</td><td>RCAB0004P-F</td><td>Anticuerpo policlonal&nbsp;</td></tr><tr><td>Rata anti-GFAP</td><td>Zymed</td><td>13-0300</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina (clon HSA1/25.1.3)</td><td>Cedarlane Laboratories Ltd.</td><td>CL2513A</td><td>Ratón IgG1</td></tr><tr><td>Actina de músculo liso (clon 1A4)</td><td>DakoCytomation Inc</td><td>IR611/IS611</td><td>Ratón IgG2a</td></tr><tr><td>Nestina</td><td>Chemicon International</td><td>MAB5326</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo</td></tr><tr><td>TUBB3</td><td>Convance Inc</td><td>MMS-435P</td><td>Tuj1, ratón IgG2a</td></tr><tr><td>HNF4&alpha; (C11F12)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>3113</td><td>Anticuerpo monoclonal de conejo</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (solución)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td>PFA, fijador, diluido en D-PBS</td></tr></tbody></table>

culturas alternativas para pluripotentes stem cell production, mantenimiento y análisis genético

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) son muy prometedoras para la medicina regenerativa y las aplicaciones biofarmacéuticas. En la actualidad, el cultivo óptimo y la expansión eficiente de grandes cantidades de hPSC de grado clínico son cuestiones críticas en las terapias basadas en hPSC. Convencionalmente, las hPSC se propagan como colonias en sistemas de cultivo alimentados y sin alimentadores. Sin embargo, estos métodos tienen varias limitaciones importantes, como el bajo rendimiento celular y la generación de células heterogéneamente diferenciadas. Para mejorar los métodos actuales de cultivo de hPSC, recientemente hemos desarrollado un nuevo método, que se basa en el cultivo monocapa (NCM) de tipo no colonia de células individuales disociadas. Aquí, presentamos protocolos detallados de NCM basados en el inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632. También proporcionamos nueva información sobre el cultivo de NCM con diferentes moléculas pequeñas como Y-39983 (inhibidor de ROCK I), fenilbenzodioxano (inhibidor de ROCK II) y tiazovivina (un nuevo inhibidor de ROCK). Ampliamos aún más nuestro protocolo básico para cultivar hPSCs en proteínas extracelulares definidas, como la laminina isoforma 521 (LN-521) sin el uso de inhibidores de ROCK. Además, basándonos en NCM, hemos demostrado una transfección o transducción eficiente de ADN plasmídico, partículas lentivirales y microARN basados en oligonucleótidos en hPSC con el fin de modificar genéticamente estas células para análisis moleculares y descubrimiento de fármacos. Los métodos basados en NCM superan las principales deficiencias del cultivo de tipo colonia y, por lo tanto, pueden ser adecuados para producir grandes cantidades de hPSC homogéneas para futuras terapias clínicas, investigación con células madre y descubrimiento de fármacos.

Un esquema general de la cultura NCM La figura 1 representa un esquema típico de la cultura NCM que muestra los cambios dinámicos de hPSCs después de alta densidad de placas de una sola célula en presencia del inhibidor de Rock y-27632. Estos cambios morfológicos incluyen conexiones intercelulares después de la siembra, la formación de grupos celulares, y el crecimiento celular exponencial seguida de la condensación de células (Figura 1A). U...

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de células madre pluripotentes humanas (hPSC), basados en el crecimiento de células individuales disociadas de monocapa (NCM) de tipo no colonia. Este nuevo método, que utiliza inhibidores de la quinasa asociada a Rho o la isoforma de laminina 521 (LN-521), es adecuado para producir grandes cantidades de hPSC homogéneas, la manipulación genética y el descubrimiento de fármacos.

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

alternative-cultures-for-human-pluripotent-stem-cell-production

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo demuestra cómo mantener sano, indiferenciada madre embrionarias humanas (ES) las células.

La cultura y el mantenimiento de células estaminales embrionarias humanas

El siguiente protocolo proporciona instrucciones para la adaptación humana células madre pluripotentes inducidas (iPS) celdas para alimentación libre de la cultura a través del alimentador de Libre completa golpe de gracia suero sustitución medio (KSR-FF). Una vez adaptado, instrucciones para el mantenimiento continuo también se proporcionan.

Alimentador de Libre adaptación, Cultura y pases de células iPS humanas con alimentador de Libre Completa golpe de gracia suero sustitución Media

Los protocolos descritos permiten a los laboratorios realizar cultivos de células madre adherentes y escalables con un rendimiento mínimo con un costo mínimo de inversión en mano de obra, experiencia y equipo utilizando un robot de manejo de líquidos programable y placas de 96 pocillos.  Las iPSCs transitadas más de 20 veces en este sistema mantuvieron la pluripotencia, los cariotipos normales y se diferenciaron en cardiomiocitos.

Escalable 96 pocillos Placa base IPSC Cultura y Producción Usando un sistema de manipulación robótica Líquido

Este protocolo proporciona una forma sencilla y eficiente de propagar células madre pluripotentes humanas (hPSCs) utilizando solo medios condicionados derivados de la placenta humana en un plato recubierto de gelatina sin suplementación exógena adicional o sustratos sintéticos específicos de hPSC.

Una Cultura Modelo Novela de Pluripotentes Stem Cell Propagación de gelatina en Media Placenta acondicionado

Aquí hay un protocolo para cultivar células madre pluripotentes (PSC) y células madre neurales (NSC) en un sistema de cultivo celular cerrado que permite la máxima esterilidad y reproducibilidad, reemplazando el gabinete de bioseguridad y la incubadora tradicionales. Este equipo cumple con las pautas de buenas prácticas clínicas de fabricación (cGMP) y buenas prácticas de laboratorio clínico (cGLP).

El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica

La caracterización regular de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), para determinar el mantenimiento de su estado pluripotente, es un paso importante antes de que estas células se utilicen para otras aplicaciones. En este trabajo describimos un método para la propagación a pequeña escala de iPSCs humanas diseñado específicamente para permitir su caracterización fácil y rutinaria a través de inmunocitoquímica.

Propagación de pequeña escala de iPSCs humano en condiciones sin suero para la caracterización inmunocitoquímica de rutina

derivación robusta de las células inducido por el hombre pluripotentes madre (HIPS) se logró mediante el uso de no-integración de virus Sendai (SeV) vector reprogramación mediada de fibroblastos dérmicos. el mantenimiento de células caderas y la expansión clonal se realizó utilizando condiciones de cultivo libre de xeno y definidos químicamente con laminina humana recombinante 521 (LN-521) de matriz y esencial E8 (E8) Medium.

Integración Derivación Gratuita de Células Madre Pluripotentes Inducidas Humanas Usando Laminin 521 Matrix

Presentamos un protocolo de reversión química rápida, eficiente y a granel de las células madre pluripotentes humanas linaje preparado convencional (hPSC) en un estado de preimplantación epiblasto como pluripotentes ingenua de epigenomically estable. Este método resulta en expresión génica disminución linaje preparado y notable mejora en la diferenciación del multilineage dirigida a través de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC.

Reversión química de células madre pluripotentes humanas convencionales a un estado ingenuo con potencia mejorada del Multilineage diferenciación

Para evitar las limitaciones asociadas con el paso enzimático o mecánico de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) cultivadas en células alimentadoras, hemos establecido un método rápido, efectivo, rentable y de alto rendimiento para recolectar colonias de hESC o hiPSC mantenidas en una capa de células alimentadoras de fibroblastos del prepucio humano utilizando la desadhesión mediada por EDTA.

Pase rápido, rentable y sin enzimas de células madre pluripotentes humanas a células alimentadoras mediante desadhesión mediada por ácido etilendiaminotetraacético

Aquí, presentamos un protocolo para un sistema automatizado de cultivo celular. Este sistema de cultivo automatizado reduce la mano de obra y beneficia a los usuarios, incluidos los investigadores que no están familiarizados con el manejo de células madre pluripotentes inducidas (iPS), desde el mantenimiento de las células iPS hasta la diferenciación en varios tipos de células.

Un sistema de cultivo automatizado para mantener y diferenciar células madre pluripotentes inducidas por humanos

Aprende el método de cultivo en monocapa no colonial para células madre pluripotentes humanas utilizando inhibidores de Rho-associated kinase y laminina 521. Esta técnica permite obtener grandes cantidades de células homogéneas para manipulación genética y descubrimiento de fármacos.

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

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