Name: De dos fotones In vivo Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprende a realizar imágenes de dos fotones in vivo de espinas dendríticas en la corteza del ratón mediante una preparación de cráneo adelgazado. Este método permite observar la reorganización estructural sin dañar el tejido cerebral.

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Damos las gracias a James Perna para la ilustración gráfica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud Mental a YZ

Aprobación necesita ser obtenido de instituciones de origen antes del inicio de la cirugía y estudio de imágenes. Los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos de la Universidad de California, Santa Cruz Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. 1. Cirugía <ol><li> Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y esterilizar el área de trabajo con un 70% de alcohol a fondo antes de la cirugía. </li><li> Se anestesia el ratón por inyección intraperitoneal (IP) de solución anestésica KX (200 mg / kg de ketamina y 20 mg / kg de xilazina) de acuerdo con el peso corporal del ratón Nota:. Dosificación KX puede ser ajustado de acuerdo a la cepa, edad, y estado de salud de los ratones. También se recomienda la consulta veterinaria para determinar la dosis óptima. </li><li> Realice una prueba de toe-pinch periódicamente presionando los dedos del ratón y de la comprobación de una respuesta refleja para supervisar el estado de anestesia.Asegúrese de que el ratón esté totalmente anestesiado antes de iniciar la cirugía Nota:. Durante las sesiones de formación de imágenes prolongados, comprobar el estado de la anestesia del ratón periódicamente, administrar KX adicional si es necesario. </li><li> Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo durante la cirugía. </li><li> Afeitarse la cabeza del ratón utilizando una hoja de afeitar para exponer el cuero cabelludo. </li><li> Esterilizar el área afeitada limpiando la piel con la alternancia de algodón con alcohol y betadine. Retire todos los recortes de pelo residuales. </li><li> Aplique suavemente ungüento para los ojos para lubricar los dos ojos, por lo tanto, la prevención del daño permanente causado por la deshidratación durante el experimento. </li><li> Hacer una incisión recta a lo largo de la línea media del cuero cabelludo, y mover la piel lateralmente hacia los bordes del cráneo. </li><li> Retire el tejido conectivo unido al cráneo. </li></ol> 2. Diluido-cráneo Preparación <ol><li> Identificar la región de imagen basada en ster. coordenadas eotaxic Nota: Trate de evitar los grandes vasos sanguíneos, lo que la penetración de luz bloque y difuminar las estructuras proyectadas. Se observa mejor vasculatura cuando el cráneo es húmeda con solución salina estéril. </li><li> Utilice el micro taladro de alta velocidad para diluir una región circular de cráneo (0,5-1,0 mm de diámetro). Mueva el taladro paralelo a la superficie del cráneo, en vez de sostener contra el cráneo y presionando hacia abajo. Taladro hasta tanto la capa de hueso compacto exterior y la capa esponjosa media se eliminan Nota:. Para evitar daños causados ​​por el sobrecalentamiento, evitar el contacto prolongado entre la broca y el cráneo. </li><li> Continuar el adelgazamiento de la capa de hueso compacto interior con una cuchilla microquirúrgica en el centro de la región de perforación-adelgazado. Mantenga la cuchilla microquirúrgica en un ángulo de aproximadamente 45 ° para raspar el cráneo sin presionar hacia abajo contra el cráneo hasta que un afinado de manera uniforme pequeña región (200-300 micras de diámetro) con un espesor de aproximadase obtiene LY 20-30 micras. Debido a la auto-fluorescencia del cráneo, el espesor se puede medir mediante el escaneo de la distancia entre la superficie superior e inferior del cráneo bajo el microscopio de dos fotones Nota:. Aunque un espesor cráneo de menos de 20 micras proporciona una buena calidad de imagen, no es recomendable porque hace que el proceso de adelgazamiento en posteriores sesiones de re-proyección de imagen difícil. Para evitar el exceso de adelgazamiento, el espesor del cráneo necesita ser comprobada periódicamente durante la cirugía (ver Discusión). </li></ol> 3. Inmovilización <ol><li> Retire con cuidado los restos de los huesos. </li><li> Coloque una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato en cada borde de la abertura central de la placa de cabeza estéril, que ha sido tratado en autoclave (véase la Figura 1). Mantenga la placa de cabeza firmemente contra el cráneo con la región adelgazada situado en el centro de la abertura Nota:. Si el pegamento contamina el R adelgazadaegión por accidente, retire con cuidado con la cuchilla microquirúrgica. </li><li> Tire suavemente de la piel de los lados del cráneo hasta los bordes de la abertura central de la placa de cabeza. </li><li> Espere aproximadamente 10 minutos hasta que la placa de cabeza está bien adherida al cráneo. </li><li> Coloque la placa de cabeza en dos bloques laterales de la placa de sujeción y apriete los tornillos en los bordes de la placa de cabeza para inmovilizar el ratón sobre la placa de sujeción (véase la Figura 1) Nota:. Asegúrese de que no hay piel o los bigotes entre la placa de cabeza y los bloques antes de apretar los tornillos. Una buena preparación inmovilizada no debe mostrar ningún movimiento observable del cráneo bajo el microscopio de disección cuando la parte posterior del animal se dio unos golpecitos suavemente. </li><li> . Enjuagar el cráneo expuesto con solución salina para eliminar el pegamento no polimerizado Nota: Es importante eliminar cualquier pegamento restante, como pegamento no polimerizado difumina las imágenes y los daños objetivos de microscopio &lt;./ Li&gt; </ol> 4. Imaging <ol><li> Tome una foto de la vasculatura del cráneo expuesta con la región adelgazada como mapa 1, que se utiliza para la ubicación de la zona visualizada en las sesiones de formación de imágenes posteriores (véase la Figura 2). </li><li> Coloque el ratón bajo el microscopio de formación de imágenes. Ubicar la zona adelgazada bajo un objetivo de aire 10 veces usando epifluorescencia y mover el área más delgada para el centro de la vista. </li><li> Añadir una gota de solución salina en la parte superior del cráneo y cambiar a la objetivo 60X, que ha sido enjuagado con agua estéril. Seleccione una región donde las espinas dendríticas individuales están claramente visualizadas junto dendritas. Identificar y etiquetar la región correspondiente en el mapa 1 comparando vasculatura entre la vista de epifluorescencia y la foto vasculatura. </li><li> Sintonice la longitud de onda del láser de dos fotones de acuerdo con los fluoróforos. Por ejemplo, 920 nm para YFP; 890 nm para GFP; 1000 nm para DsRed y tdTomato 24. </li><li> Adquirir pilas de imágenes con 2pasos micras a lo largo del eje z usando el objetivo 60X. Esta pila de imagen cubre un área de 200 x micras aproximadamente 200 micras (512 x 512 píxeles) y se utiliza como mapa 2 para el traslado durante las sesiones de formación de imágenes posteriores (véase la Figura 2). </li><li> Adquirir nueve pilas de imágenes en el mapa 2 se utiliza el zoom digital de 3X. Cada pila de imagen cubre un área aproximada de 70 m x 70 m (512 x 512 píxeles), con 0,7 m pasos a lo largo del eje z Nota:. La intensidad del láser debe estar por debajo de 40 mW cuando se mide en muestras para reducir al mínimo la fototoxicidad. </li></ol> 5. Recuperación <ol><li> Tras las imágenes, separe con cuidado la placa de cabeza del cráneo. </li><li> Limpiar a fondo el cráneo y la piel para eliminar todo el pegamento restante Nota:. Cualquier pegamento que queda en la piel causará irritaciones y retrasar la cicatrización de la piel, mientras que el pegamento que queda en el cráneo provocará la erosión del cráneo y unngiogenesis en la capa de hueso recién crecido, por lo que la posterior reubicación y reconstrucción de imagen difícil. </li><li> Enjuague el cráneo y la piel con solución salina varias veces. </li><li> Suturar el cuero cabelludo con sutura quirúrgica estéril. </li><li> Mantenga al animal en una almohadilla térmica en una jaula separada. Administrar analgésico buprenorfina (0,1 mg / kg) por vía subcutánea para mitigar el dolor post-operatorio. Volver al animal a la jaula después de la recuperación completa. Vigilar estrechamente el animal (marque al menos una vez al día) hasta que la incisión haya sanado y se retiran las suturas. Administrar las inyecciones posteriores de buprenorfina analgésica si es necesario. </li></ol> 6. Creación de imágenes <ol><li> Repita los pasos 1.1 a 1.8. </li><li> Repita los pasos 3.1 a 3.6 </li><li> Localice región previamente fotografiado al comparar el patrón de vascularización a Mapa 1 y el patrón de ramificación dendrítica a Mapa 2. </li><li> Si se realiza la creación de las imágenes dentro de 1 semana, repita el paso 2.3 para quitar la fina capa de hueso recién crecido en la parte superior de la re adelgazadaregión utilizando la cuchilla microquirúrgica. Si reimaging se realiza después de más de 1 semana, repita los pasos tanto de 2.2 y 2.3 Nota:. La capa de hueso recién crecido consiste en una estructura menos condensada en comparación con la capa de hueso compacto original, que conduce a una menor calidad de imagen. Por lo tanto, para adquirir la misma calidad, es necesario diluir el cráneo ligeramente más de la sesión de formación de imágenes anterior. </li><li> Ajuste la posición y la orientación para obtener pilas de imágenes que coinciden previamente tomadas pilas de imágenes en el microscopio de dos fotones. </li><li> Adquirir imágenes como en el paso 4.6. </li><li> Repita los pasos 5.1 a 5.5 después de la impresión. </li></ol>

<ol><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li>
<li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+plasticity+in+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li>
<li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+plasticity%3A+looking+beyond+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li>
<li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+and+long-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li>
<li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li>
<li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li>
<li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li>
<li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li>
<li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li>
<li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li>
<li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li>
<li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Para obtener una exitosa preparación de calavera adelgazado, varios pasos de este protocolo son cruciales. 1) El espesor del cráneo. El hueso craneal tiene una estructura de sándwich, con dos capas de hueso compacto de alta densidad y una capa intermedia de hueso esponjoso de baja densidad. Mientras que el micro taladro de alta velocidad es adecuado para la eliminación de las capas externas de hueso compacto y el hueso esponjoso, la cuchilla microquirúrgica es ideal para el adelgazamiento de la capa interior de hueso co...

La corteza de los mamíferos participa en muchas funciones cerebrales, de la percepción sensorial y el movimiento de control de abstraer el procesamiento de información y la cognición. Varias funciones corticales se basan en diferentes circuitos neuronales, que se componen de diferentes tipos de neuronas que se comunican e intercambian información en las sinapsis individuales. La estructura y la función de las sinapsis están siendo modificados constantemente en respuesta a las experiencias y patologías. En el cerebro maduro, la plasticidad sináptica toma la forma de ambos cambios de resistencia y la adición / eliminación de sinapsis, que juega un papel importante en la formación y mantenimiento de un circuito neuronal funcional. Las espinas dendríticas son los componentes postsinápticos de la mayoría de las sinapsis excitadoras en el cerebro de los mamíferos. La constante rotación y los cambios morfológicos de las espinas se cree que servirá como un buen indicador de las modificaciones en las conexiones sinápticas 1-7. Dos fotones de escaneo láser microscopy ofrece una penetración profunda a través, preparaciones opacas gruesas y baja fototoxicidad, que lo hace adecuado para las imágenes en directo en el cerebro intacto 8. En combinación con marcaje fluorescente, dos fotones de imágenes proporciona una poderosa herramienta para mirar en el cerebro vivo y siga reorganización estructural en las sinapsis individuales con alta resolución espacial y temporal. Varios métodos han sido utilizados para preparar los ratones para formación de imágenes en vivo 9-13. Aquí se describe una preparación de cráneo adelgazado de imágenes in vivo de dos fotones para investigar la plasticidad estructural de las espinas dendríticas postsinápticos en la corteza del ratón. Con este enfoque, los estudios recientes han representado una imagen dinámica de los cambios de la espina dendrítica en respuesta a las habilidades motoras de aprendizaje Con el aumento de la disponibilidad de animales transgénicos con subconjuntos neuronales marcados con fluorescencia y el rápido desarrollo de las técnicas in vivo de etiquetado, los procedimientos similares a los descritos aquí se pueden aplicar también de investigaciónTE otros tipos de células y regiones corticales, en combinación con otras manipulaciones, así como se utiliza en modelos de enfermedad 16-23.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-034-10</td><td>Mezclada con xilacina para anestesia</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Lloyd laboratories</td><td>139-236</td><td>Mezclada con ketamina para anestesia</td></tr><tr><td>Solución salina</td><td>Hospira</td><td>0409-7983-09</td><td>NaCl al 0,9% para inyección e imagen</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>72000</td><td>Hojas de afeitar de acero inoxidable de doble filo</td></tr><tr><td>Almohadillas con alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>Almohadillas estériles para la preparación con alcohol</td></tr><tr><td>Ungüento para los ojos</td><td>Henry Schein</td><td>102-9470</td><td>Pomada oftálmica de vaselina lubricante ocular estéril</td></tr> Micro <tr><td>taladro de alta velocidad</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>El microtaladro de alta velocidad es adecuado para adelgazar la capa exterior de hueso compacto y apuntar a un área pequeña</td></tr><tr><td>Rebabas</td> <td>de acero de microtaladroFine Science Tools</td><td>19007-14 1,4</td><td>mm de diámetro</td></tr><tr><td>Cuchilla microquirúrgica</td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>La cuchilla microquirúrgica es adecuada para adelgazar la capa interna de hueso compacto y la capa intermedia de hueso esponjoso</td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>Fisher Scientific NC9062131</td><td></td><td>Fije la placa de la cabeza en el cráneo</td></tr><tr><td>Sutura</td><td>Havard Apparatus</td><td>510461</td><td>Sutura de seda estéril no absorbente, 6-0 monofilamento</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Infinity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de dos fotones</td><td>Prairie Technologies</td><td></td><td>Ultima IV</td></tr><tr><td>Objetivo 10X</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 0.30, objetivo aire</td></tr><tr><td>60X</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 1.1, permeable a los infrarrojos, láser de zafiro de titanio por inmersión en agua</td></tr><tr><td></td><td>Espectro-Física</td><td></td><td>Mai Tai HP</td></tr></tbody></table>

de dos fotones<em&gt; in vivo</em&gt; imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón usando un diluido-cráneo preparación

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

En la corteza de los mamíferos, las neuronas forman redes muy complicadas y el intercambio de información en las sinapsis. Los cambios en la fuerza sináptica, así como la adición / eliminación de sinapsis, se producen de una manera dependiente de la experiencia, que proporciona la base estructural de la plasticidad neuronal. Como componentes postsinápticos de las sinapsis excitatorias más en la corteza, las espinas dendríticas se considera que son un buen indicador de las sinapsis. Tomando ventajas de la genética del ratón y técnicas de marcaje fluorescente, neuronas individuales y de sus estructuras sinápticas pueden ser etiquetados en el cerebro intacto. Aquí presentamos un protocolo de imágenes transcraneal utilizando dos fotones microscopía de escaneo láser para seguir la etiqueta fluorescente espinas dendríticas postsináptica a través del tiempo en vivo. Este protocolo utiliza una preparación de cráneo adelgazado, que mantiene el cráneo intacto y evita efectos inflamatorios causados ​​por la exposición de las meninges y la corteza. Por lo tanto, las imágenes pueden ser adquiridas inmediatamente después dose realiza rgery. El procedimiento experimental se puede realizar de forma repetitiva durante diversos intervalos de tiempo que van desde horas hasta años. La aplicación de esta preparación también se puede ampliar para investigar diferentes regiones y capas corticales, así como otros tipos de células, en condiciones fisiológicas y patológicas.

En YFP-H línea de ratones 25, proteína fluorescente amarilla expresa en un subconjunto de neuronas piramidales capa de V, que se proyectan sus dendritas apicales de las capas superficiales de la corteza. A través de la preparación de calavera adelgazado, los segmentos dendríticas marcados con fluorescencia pueden ser repetitivamente reflejados bajo el microscopio de dos fotones a través de varios intervalos de formación de imágenes, que van desde horas a meses. Aquí se muestra un ejemplo de una imagen en cuat...

Las imágenes de lapso de tiempo en el animal vivo proporcionan información valiosa sobre la reorganización estructural en el cerebro intacto. Aquí, presentamos una preparación de cráneo adelgazado que permite la obtención de imágenes transcraneales de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

El objetivo general de este procedimiento es permitir la imagen transcraneal de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza de ratón vivo mediante microscopía de dos fotones. El primer paso después de anestesiar al ratón es realizar una preparación de cráneo delgado. A continuación, se inmoviliza la cabeza del ratón utilizando una placa de sujeción hecha a medida.Luego se adquieren series de imágenes a través del cráneo delgado utilizando microscopía de dos fotones. Finalmente, al reubicar e imaginar la región previamente observada, se permitió rastrear la dinámica de las espinas dendríticas durante diferentes períodos de tiempo bajo diversas condiciones.Para prepararse para la cirugía, anestesie un ratón con ketamina y xilacina y realice una compresión del dedo del pie para asegurar una anestesia completa. A continuación, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica y use una cuchilla de afeitar para rasurarle la cabeza. Limpie la piel con toallitas de alcohol alternadas para esterilizar el área rasurada y eliminar cualquier residuo de cortes de cabello.Asimismo, aplique suavemente pomada ocular en ambos ojos. A continuación, realice una incisión recta a lo l

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la...

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

Mediante la combinación de un pulido y reforzado delgada cráneo (puertos) craneal ventana y glioblastoma (GBM) la inyección de células, se puede observar la iniciación glioma y el crecimiento de las células de GBM inyectados en el cerebro de un ratón vivo longitudinalmente.

Imágenes Glioma Iniciación<em&gt; En Vivo</em&gt; A través de un pulido y reforzado fina calavera ventana craneal

Fuente: Pekarek, B. T., et. al., Obtención de imágenes y cuantificación de dendritas neuronales intactas mediante la limpieza de tejidos CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)En este video, demostramos la preparación, la obtención de imágenes y el análisis de un cerebro de ratón aclarado para examinar los ejes dendríticos, la morfología de la columna vertebral y la distribución neuronal utilizando técnicas de microscopía confocal y reconstrucción 3D.

Imágenes de microscopía confocal de árboles dendríticos intactos y morfología de la columna vertebral en un cerebro de ratón despejado

En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo in vitro utilizando Estructurado Iluminación Microscopía (SIM). Super-resolución de la microscopía utilizando SIM ofrece una resolución de imagen de manera significativa más allá del límite de difracción de la luz en las tres dimensiones espaciales, lo que permite la obtención de imágenes de las espinas dendríticas individuales con detalles mejorados.

Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

La microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) se aplica para obtener imágenes y analizar espinas dendríticas en el hipocampo murino.

Microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) para el estudio de espinas dendríticas

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Este protocolo contiene una descripción detallada de un enfoque paso a paso para un modelo ratón de ventana craneal crónica y embolia microvascular, optimizado para la imagen in vivo de microscopía de dos fotones utilizando microesferas fluorescentes de poliestireno.

Modelo de Ratón de Embolia Microvascular para Microscopía de Dos Fotones In Vivo usando Microsferas de Poliestireno Fluorescente

Aprende a realizar imágenes de dos fotones in vivo de espinas dendríticas en la corteza del ratón mediante una preparación de cráneo adelgazado. Este método permite observar la reorganización estructural sin dañar el tejido cerebral.

De dos fotones

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