De dos fotones In vivo Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

El objetivo general de este procedimiento es permitir la obtención de imágenes transcraneales, una estructura sináptica marcada con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones. El primer paso después de anestesiar al ratón es realizar una preparación del cráneo adelgazado. A continuación, la cabeza del ratón se inmoviliza mediante una placa de sujeción hecha a medida.

Luego, se adquieren pilas de imágenes a través del cráneo adelgazado utilizando dos microscopías de fotones. En definitiva, la reubicación y la obtención de imágenes. La región previamente fotografiada permitió trazar la dinámica de las espinas dendríticas durante diferentes períodos de tiempo en diversas condiciones.

Para prepararse para la cirugía, anestesia a un ratón con ketamina y xilacina y realice un pellizco en el dedo del pie para asegurar una anestesia completa. Luego coloque el mouse en una almohadilla térmica y use una cuchilla de afeitar para afeitar la cabeza. Limpie la piel con almohadillas con alcohol alternas para esterilizar el área afeitada y eliminar cualquier recorte de vello residual.

Además, aplique suavemente ungüento para los ojos en ambos ojos. A continuación, haz una incisión recta a lo largo de la línea media del cuero cabelludo y mueve la piel lateralmente hacia los bordes del cráneo. A continuación, retire el tejido conectivo adherido al cráneo para comenzar la preparación del cráneo adelgazado.

En primer lugar, identifique la región de imagen deseada en función de su ubicación relativa con respecto a la línea media y el bgma. A continuación, humedece el cráneo con solución salina para observar la vasculatura y evitar el adelgazamiento del cráneo en una zona con grandes vasos sanguíneos, ya que bloquean la penetración de la luz y difuminan las estructuras de la imagen. Una vez que se haya seleccionado un área de 0,5 a un milímetro de diámetro, use un microtaladro de alta velocidad para adelgazar una región circular del cráneo.

Mueva el taladro paralelo a la superficie del cráneo en lugar de sostenerlo contra el cráneo y presionar hacia abajo para evitar daños causados por el sobrecalentamiento. Evite el contacto prolongado entre la broca y la broca de cráneo hasta que se eliminen tanto la capa ósea compacta externa como la capa ósea esponjosa media. A continuación, utilice una cuchilla microquirúrgica sostenida a aproximadamente 45 grados para adelgazar la capa ósea compacta interna en el centro de la región adelgazada de la fresa.

Raspe el cráneo sin presionar contra el cráneo hasta obtener una región uniformemente delgada de 200 a 300 micrómetros de diámetro con un grosor de aproximadamente 20 a 30 micrómetros. Una vez que el cráneo se haya adelgazado lo suficiente, retire con cuidado los restos óseos. El siguiente paso es colocar la placa de la cabeza, que está hecha de hojas de afeitar con bordes afilados cubiertos por cintas.

Comience colocando una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato en cada borde de la abertura central de la placa principal. A continuación, centre la placa de la cabeza en la región adelgazada. Sujétalo firmemente contra el cráneo.

Ahora, tire suavemente de la piel desde los lados del cráneo hasta los bordes de la abertura central de la placa de la cabeza. Sostenga la placa principal en su lugar durante uno o dos minutos. Luego espere otros ocho a nueve minutos hasta que la placa de la cabeza esté bien adherida al cráneo.

Después de 10 minutos, coloque la placa principal en los dos bloques laterales de la placa de sujeción. A continuación, apriete los tornillos sobre los bordes de la placa principal para inmovilizar el mouse en la placa de sujeción. Mire la cabeza del ratón a través de un microscopio de disección mientras acolcha suavemente la espalda del ratón para asegurarse de que la cabeza esté correctamente inmovilizada.

A continuación, enjuague el cráneo expuesto con solución salina para eliminar cualquier pegamento no polimerizado con el fin de reubicar la región previamente fotografiada. En las sesiones de imágenes posteriores, tome una foto de la vasculatura de la región adelgazada del cráneo expuesto, que se designa como mapa uno. A continuación, coloque el ratón bajo el microscopio de imágenes y localice el área reducida bajo el objetivo de aire de 10 x.

Usando la epifluorescencia, mueva el área más delgada al centro de la vista. Ahora añade una gota de solución salina en la parte superior del cráneo y cambia al objetivo 60 x. Seleccione una región en la que las espinas dendríticas individuales se visualicen claramente a lo largo de las dendritas.

Identifique y etiquete la región correspondiente en el mapa uno comparando la vasculatura entre la vista epifluorescente y la foto de la vasculatura. A continuación, ajuste la longitud de onda del láser de dos fotones de acuerdo con los cuatro fluorescentes. Luego, usando el objetivo de 60x, adquiera pilas de imágenes con pasos de dos micrómetros a lo largo del eje Z, cubriendo un área de aproximadamente 200 micrómetros por 200 micrómetros.

Esto se designa como mapa dos y se utiliza para reubicar el segmento dendrítico de la imagen durante las sesiones de imágenes posteriores. Ahora adquiera nueve pilas de imágenes dentro del mapa dos usando un zoom digital de tres x. Cada pila de imágenes cubre un área aproximada de 70 micrómetros por 70 micrómetros con pasos de 0,7 micrómetros a lo largo del eje Z.

Después de la toma de imágenes, separe suavemente la placa de la cabeza del cráneo. A continuación, utilice una cuchilla microquirúrgica para eliminar el pegamento restante del cráneo. A continuación, enjuague el cráneo y la piel con solución salina varias veces y suture el cuero cabelludo con suturas quirúrgicas estériles.

Durante la recuperación, mantenga al animal en una almohadilla térmica en una jaula separada y administre analgésico de buprenorfina por vía subcutánea para el dolor postoperatorio. Después de la recuperación completa, regrese el animal al medidor de hogar Para volver a obtener una imagen de las dendritas otro día, anestesiar al animal y exponer el cráneo. Como antes, repita la inmovilización de la cabeza montando la placa de la cabeza y fijándola a la placa de sujeción.

A continuación, localice la región de la que se ha obtenido la imagen anteriormente comparando el patrón de vasculatura con el mapa uno y el patrón de la rama dendrítica con el mapa dos. Si la reimagen se realiza dentro de una semana, la capa delgada de hueso recién crecido se puede eliminar con una cuchilla microquirúrgica. Si la reimagen se realiza después de más de una semana, primero use el microtaladro y luego la cuchilla microquirúrgica para adelgazar el cráneo.

Ahora ajuste la posición y la orientación bajo el microscopio de dos fotones para obtener pilas de imágenes que coincidan con las pilas de imágenes tomadas anteriormente. Después de adquirir imágenes, permita que el ratón se recupere y lo devuelva a su jaula como antes, y se utiliza una imagen del patrón vascular que rodea el área delgada del cráneo designada como mapa uno para hacer referencia a todas las sesiones de imágenes posteriores. La caja negra indica la región donde se adquirieron dos imágenes de fotones in vivo.

Esta imagen de ramas dendríticas en la corteza motora de un ratón de un mes de edad se designa como mapa dos. El cuadro blanco muestra el segmento dendrítico seleccionado para la obtención de imágenes. Con el tiempo, se tomaron imágenes de dos fotones del mismo segmento dendrítico en el día cero, el día dos, el día cuatro y el día ocho.

Espinas recién formadas. Es decir, las espinas que no estaban presentes en la sesión de imágenes anterior se muestran con puntas de flecha, las espinas que se eliminaron entre sesiones de imágenes se muestran con las flechas. Philip Podia están indicados por las estrellas una vez dominadas.

Esta técnica se puede realizar en una o dos horas si se realiza correctamente.