Monitoreo Funcionalidad y Morfología de Vasculatura Reclutado por factores secretados por las células tumorales generadoras de crecimiento rápido

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar el ultrasonido y la endomicroscopía para ilustrar el potencial angiogénico de un conjunto de factores secretados por las células cancerosas. Esto se logra implantando primero un tapón para generar un entorno similar a un tumor en el ratón en ausencia de células tumorales. A continuación, se evalúa la densidad de los vasos sanguíneos y el porcentaje de vasos sanguíneos funcionales dentro del tapón.

En el paso final, se visualiza la morfología de los vasos sanguíneos. En última instancia, el equilibrio entre los factores pro y antiangiogénicos secretados por las células y sus efectos sobre la angiogénesis se puede evaluar de manera vital, vital y en varios puntos temporales mediante las dos modalidades de imagen complementarias. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el ensayo convencional matrigel plug, es que permite el análisis de un conjunto de factores secretados por las células, al tiempo que utiliza modalidades complementarias de imágenes intravitales.

Para demostrar este procedimiento, los estudiantes de doctorado de mi laboratorio deben utilizar el ultrasonido para evaluar la vascularización del tapón de gel de la matriz extracelular o la ECM, comience colocando un tubo de einor de 1,5 mililitros que contenga 80 microlitros de medios acondicionados recién preparados en hielo. La parte más complicada del procedimiento es inyectar el gel sin burbujas con puntas heladas. Una mezcla suave y una inyección lenta asegurarán una administración óptima del gel.

Luego, usando puntas heladas de 1000 microlitros, mezcle 600 microlitros de hielo frío cuatro grados centígrados durante la noche. Gel de imitación de ECM descongelado en los medios teniendo cuidado de no formar burbujas. Después de confirmar la sedación con un pellizco en los dedos de los pies, afeitar el abdomen de cada ratón y usar una jeringa helada de un mililitro equipada con una aguja de calibre 27 para subcutánea lentamente.

Inyectar el contenido de un tubo EEND DPH por animal. Una vez que se haya administrado todo el volumen, mantenga la aguja en su lugar durante varios minutos hasta que se produzca la solidificación. Tres semanas más tarde, vuelva a afeitar la zona abdominal de los ratones, eliminando el vello extra con crema depilatoria, y luego fije a los ratones en posición supina en la platina del micromanipulador.

A continuación, llene una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30 con solución salina. Luego coloque la aguja dentro de la vena de la cola. Fije la aguja firmemente y afloje la jeringa.

Ahora coloque el transductor en el centro del área de escaneo deseada y haga clic en 3D para inicializar la etapa del motor 3D. Haga clic en 3D. Nuevamente, ingrese la distancia de escaneo y el tamaño del paso y presione escanear.

Confirme que se escaneó todo el enchufe en los datos de imagen 3D que se muestran. De lo contrario, ajuste el transductor para que todo el enchufe sea visible y escanee el área nuevamente como se acaba de demostrar. A continuación, seleccione el contraste y ajuste la compensación de ganancia de tiempo o los controles tgc para oscurecer la imagen, use un mezclador de viales para activar las microburbujas durante 45 segundos.

Luego mezcle 50 microlitros de las microburbujas con 50 microlitros de solución salina en una jeringa de un mililitro. Reemplace la jeringa aflojada que contiene solución salina con la jeringa que contiene las microburbujas activadas e inyecte las microburbujas diluidas en la vena de la cola de cada ratón. Espere unos segundos a que las burbujas alcancen un estado estable y, a continuación, haga clic en 3D y seleccione escanear para adquirir 3D.

Contraste de imágenes mejoradas. Haga clic en visto en una tienda para guardar los datos de la imagen y, a continuación, seleccione 3D y destruya 3D. Para destruir las microburbujas, haga clic en 3D de nuevo y seleccione escanear para adquirir un bucle de cena posterior a la destrucción.

A continuación, vuelva a hacer clic en Visto una tienda. A continuación, en la configuración de referencias, haga clic en crear referencia y, a continuación, seleccione Administración de estudios. Para abrir el bucle de cena previo a la destrucción.

Ahora haga clic en process cena para generar una superposición de contraste verde. A continuación, seleccione Cargar en 3D en el software de imágenes de ultrasonido. A continuación, haga clic en configuración de modo, haga clic en volumen y seleccione paralelo.

A continuación, segmente una serie de contornos para crear un volumen 3D del tejido objetivo y haga clic en finalizar para completar la segmentación. Para utilizar la endomicroscopía confocal fibrosa para evaluar la morfología de la vasculatura del tapón de gel imitador de la ECM, inyecte 200 microlitros de 10 miligramos por mililitro, ajuste el dextrano marcado con C en la vena de la cola de cada animal de experimentación. A continuación, aplique una pequeña incisión de aproximadamente un centímetro del tapón y coloque suavemente la sonda de endomicroscopía sobre el tapón mientras mantiene el tapón intacto.

Una vez que la sonda esté en su lugar, use el pedal para presionar el láser de inicio. Una vez que la fluorescencia aparezca en la pantalla, presione seleccionar con el pedal para adquirir películas cortas hasta 32 de duración entre películas, lave la punta de la sonda en un tubo que contenga agua. Una vez finalizada la filmación, limpie la punta con un bastoncillo de algodón para analizar el diámetro medio del vaso.

A continuación, haga clic en detectar micro embarcaciones para abrir la ventana del módulo de detección de embarcaciones y haga clic en preferencias. Asegúrese de que el diámetro medio del vaso esté en el estadístico de interés. Las barras de histograma de ventana y visualización en el modo de visualización están marcadas.

Haga clic en Detectar para mostrar las medidas seleccionadas. Para analizar la intensidad de la señal fluorescente en las áreas adyacentes a los vasos sanguíneos, seleccione crear círculo ROI y cree un círculo en el área de interés. Por último, seleccione calcular histograma dentro del ROI para calcular los valores relacionados con la región encerrada en un círculo.

En este caso, el reclutamiento extensivo de vasos sanguíneos funcionales dentro de los tapones de carga media acondicionados U 87 mg se revela mediante imágenes de ultrasonido mejoradas con contraste de microburbujas. Por el contrario, dentro de los tapones que contienen medio condicionado de células generadoras de tumores inactivas, el flujo sanguíneo es casi indetectable. La morfología de estos vasos sanguíneos recién formados se enfatiza aún más mediante endomicroscopía confocal fibrosa de los vasos después de la administración de dextrano fit c como se demuestra en estas imágenes representativas, observe cómo los vasos sanguíneos dentro de los tapones cargados con el medio acondicionado U 87 mg exhiben una morfología típica de vasos agrandados con extremos romos y permeables.

Los vasos sanguíneos agrandados y muy enredados también muestran un flujo no continuo y lento, y se observan fugas de sangre en el área circundante, así como la alta señal fluorescente evidente fuera de los vasos sanguíneos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en horas en varios puntos de tiempo para optimizar la cinética de la angiogénesis.