Name: La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado In Situ Protocolo de hibridación en Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: Aprende hibridación in situ en Xenopus laevis para localizar expresión génica en embriones intactos. Este protocolo simplificado permite visualizar patrones de ARN con menos reactivos y mayor rapidez.

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Los autores desean agradecer al CIHR por el apoyo de Steve Deimling y al Departamento de Pediatría de la Universidad de Western Ontario por el apoyo de Steve Deimling, Rami Halabi y Stephanie Grover. Este trabajo fue apoyado por el R2654A11 de subvenciones de NSERC y un suplemento del NSERC Discovery Accelerator

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<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+alphaA-+and+betaB1-crystallin+during+normal+development+and+regeneration%2C+and+proteomic+analysis+for+the+regenerating+lens+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis.</a> Mol Vis. 17, 768-778 (2011).</li>
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<li>Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Xenopus+primordial+germ+cell+migration+depends+on+the+germplasm+mRNA+encoding+the+PDZ+domain+protein+Grip2%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2.</a> Differentiation. 76, 392-403 (2008).</li>
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<li>Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+FGF+signaling+in+the+establishment+and+maintenance+of+mesodermal+gene+expression+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus.</a> Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).</li>
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<li>Horb, M. E., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoderm+specification+and+differentiation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos.</a> Dev Biol. 236, 330-343 (2001).</li>
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<li>Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Lithium+on+the+Competence+of+the+Ectoderm+in+Ambystoma+Mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum.</a> J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).</li>
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<li>Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPOX2-peroxidase+expression+and+the+XLURP-1+promoter+reveal+the+site+of+embryonic+myeloid+cell+development+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus.</a> Mech Dev. 117, 173-186 (2002).</li>
<li>Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+I+is+a+heart-specific+marker+in+the+Xenopus+embryo%3A+expression+during+abnormal+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis.</a> Dev Biol. 165, 432-441 (1994).</li>
<li>Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+pronephric+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of pronephric development.</a> Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).</li>
<li>Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNkx-2.5%2C+a+Xenopus+gene+related+to+Nkx-2.5+and+tinman%3A+evidence+for+a+conserved+role+in+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development.</a> Dev Biol. 162, 325-328 (1994).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).</li>
<li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que divulgar.

La capacidad de utilizar la hibridación in situ para visualizar el patrón de expresión de genes específicos sigue siendo el método más comúnmente utilizado para identificar órganos específicos o tipos de células en el embrión de Xenopus. Esto es debido a varias ventajas ofrecidas por esta técnica. La expresión de un gen puede identificar estructuras específicas así antes de cualquier signo histológico de diferenciación como es el caso para la expresión nkx2.5 en los progenitores del corazón an...

El patrón de expresión de un gen específico es una información importante para determinar el papel potencial de ese gen en el desarrollo de un órgano o tipo de célula específico. En pocas palabras, si no se expresa en el momento y lugar adecuados, es poco probable que juegue un papel clave. En Xenopus, como en la mayoría de los embriones tempranos, el ensayo más comúnmente utilizado para detectar la expresión de un gen es la hibridación in situ de montaje completo utilizando sondas de ARN antisentido marcadas. El uso de la tinción de anticuerpos para evaluar la expresión de un gen en Xenopus se está volviendo más común a medida que los investigadores descubren anticuerpos, generalmente generados contra proteínas de mamíferos, que reaccionan de manera cruzada al homólogo de Xenopus o generan sus propios 1-3. Sin embargo, la gran mayoría de los estudios sobre la organogénesis de Xenopus todavía utilizan sondas de ARN antisentido. Cuando se utilizan anticuerpos, cada anticuerpo individual a menudo requiere una optimización para la concentración de anticuerpos primarios o los protocolos de fijación. Por el contrario, el protocolo para hibridaciones in situ es esencialmente invariante para diferentes sondas. El concepto básico es relativamente simple y se ha establecido un excelente protocolo estándar 4. Nuestro protocolo es una versión simplificada del protocolo original 4 que sigue proporcionando una excelente detección de los patrones de expresión génica en el embrión temprano. Los embriones se fijan y luego se preparan para la hibridación cambiando las soluciones y las temperaturas de modo que permita la unión de alta rigurosidad de la sonda de ARN antisentido marcada a su ARNm objetivo. La sonda no unida se lava y los embriones se preparan para la unión de un anticuerpo contra la etiqueta de las sondas de ARN. A continuación, el exceso de anticuerpos se elimina y se utiliza una reacción de color enzimática para localizar el lugar al que se une la sonda de ARN en el embrión. En la actualidad hay una serie de líneas transgénicas de Xenopus que impulsan la expresión de proteínas fluorescentes en tejidos específicos y están disponibles en los centros de almacenamiento de Xenopus, como el National Xenopus Resource en Woods Hole. Si bien es muy útil para muchos experimentos que requieren examinar la organogénesis en embriones vivos, esta opción requiere un alojamiento separado para las líneas transgénicas. 
La hibridación in situ puede delinear claramente dónde se formarán órganos específicos o tipos de células en el embrión temprano (Figura 1). La técnica es notablemente sensible dado que se puede detectar la expresión génica en un pequeño número de células en un solo embrión 5. Sin embargo, la hibridación in situ utilizando la intensidad de la tinción colorimétrica no se considera cuantificable porque la reacción de color no es lineal. A pesar de la dificultad para cuantificar la intensidad de la tinción, los cambios en la expresión suelen ser bastante notables; particularmente cuando la hibridación in situ muestra aumentos o disminuciones cuantificables en el tamaño de los dominios de expresión 6,7. 
Las claras ventajas de la hibridación in situ de montaje completo la convierten en un ensayo crítico en el estudio del desarrollo temprano. Sin embargo, requiere mucho tiempo y muchos pasos a lo largo de varios días. Este protocolo es una versión simplificada del protocolo estándar que elimina varios pasos sin reducir la calidad del resultado in situ. La simplificación también elimina las fuentes de variabilidad, lo que facilita la resolución de problemas si una hibridación in situ no es óptima. En concreto, hemos eliminado el uso de tratamientos con proteinasa K y ARNasa del embrión, dos pasos que pueden depender de la calidad del reactivo y que también pueden reducir la intensidad de la señal si se exageran. El protocolo también proporciona cierto grado de ahorro de costos debido a la eliminación del uso de varios reactivos. Por último, este protocolo también proporciona algunas pautas sencillas para mejorar la captura de imágenes de los resultados de la hibridación in situ. Aunque este protocolo está optimizado para el trabajo en embriones de Xenopus, es probable que al menos algunas de las simplificaciones sean aplicables al trabajo de hibridación in situ en otros sistemas embrionarios.

<table><tbody><tr><td>Agitadores de tubos Labguake</td><td>VWR</td><td>17-08-2011</td><td></td></tr><tr><td>Viales VWR</td><td>VWR</td><td>10-07-2012</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>BioShop</td><td>CYS342.500</td><td></td></tr><tr><td>Juego de trifosfato de ribonucleósidos, 100 mM</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de rnasa (Rnase OUT)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>T7 ARN polimerasa</td><td>fermentas</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>T3 ARN polimerasa</td><td>fermentas</td><td>EPO101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 ARN polimerasa</td><td>fermentas</td><td>EPO131</td><td></td></tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18047-019</td><td></td></tr><tr><td>Suero de oveja</td><td>&nbsp; Wisent</td><td>31150</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo bloqueador</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>BM púrpura Ap Sustrato</td><td>Roche</td><td>11442094001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-Ap Fragmentos de Feb</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>CAMX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>BioShop SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>EM&nbsp;</td><td>7910</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>EM&nbsp;</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Mopas</td><td>BioShop</td><td>MOP001.250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td></td><td>BioShop PAR070.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>&nbsp; VWR&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAFX0420-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ARN</td><td>Roche</td><td>10109223001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido maleico</td> <td>&nbsp; VWR&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAMX0100-3</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio tri-Shop</td><td>BioShop</td><td>CIT001</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (solución al 30%)</td><td>EM&nbsp;</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.100</td><td></td></tr><tr><td>PVP-40</td><td>ICN</td><td>195451</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Bencílico</td><td>Sigma</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzoato de Bencilo</td><td>Sigma</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa ultrapura&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>16500-500</td><td></td></tr></tbody></table>

la comprensión temprana organogenesis usando una simplificado<em&gt; in situ</em&gt; protocolo de hibridación en<em&gt; xenopus</em

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

La organogénesis es el estudio de cómo se especifican los órganos y luego adquieren su forma y funciones específicas durante el desarrollo. El embrión de Xenopuslaevis es muy útil para el estudio de la organogénesis porque su gran tamaño los hace muy adecuados para identificar órganos en las primeras etapas de la organogénesis. En este momento, el método principal utilizado para identificar un órgano o primordio específico es la hibridación in situ de montaje completo con sondas de ARN antisentido marcadas específicas de un gen que se expresa en el órgano de interés. Además, es relativamente fácil manipular genes o vías de señalización en Xenopus y la hibridación in situ permite analizar los cambios en la presencia o morfología de un órgano diana. La hibridación in situ de montaje completo es un protocolo de varios días con muchos pasos involucrados. Aquí proporcionamos un protocolo simplificado con un número reducido de pasos y reactivos utilizados que funciona bien para los ensayos de rutina. Los robots de hibridación in situ han facilitado enormemente el proceso y detallamos cómo y cuándo utilizamos esa tecnología en el proceso. Una vez que se completa una hibridación in situ, capturar la mejor imagen del resultado puede ser frustrante. Proporcionamos asesoramiento sobre cómo optimizar la obtención de imágenes de los resultados de hibridación in situ. Aunque el protocolo describe la evaluación de la organogénesis en Xenopus laevis, es casi seguro que el mismo protocolo básico puede adaptarse a Xenopus tropicalis y otros sistemas modelo.

El uso de sondas específicas de tejido puede proporcionar información relevante en cuanto a la situación del desarrollo de órganos específicos. En los siguientes ejemplos, la etapa del embrión se basa en la tabla de etapas Nieuwkoop y Faber 11. Si uno utiliza genes forman sondas expresadas después de la diferenciación, la troponina I cardiaca en etapa de 28 a 30, por ejemplo (Figura 1C), la presencia o el tamaño de un órgano diferenciado se pueden evaluar en cualquier diferenciación ...

El embrión de Xenopus laevis sigue siendo excepcionalmente útil en el estudio del desarrollo temprano debido a su gran tamaño y facilidad de manipulación. Se proporciona un protocolo simplificado para el protocolo de hibridación in situ de montaje completo que se puede utilizar en la identificación de órganos específicos en este sistema modelo.

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en mostrar dónde se expresa un gen determinado dentro de un embrión intacto. Esto se logra fijando el ARN para que permanezca en su lugar dentro del embrión como un segundo paso. Una sonda de ARN antisentido específica para el gen de interés se hibrida con el ARN diana dentro del embrión.Esta sonda contiene un epítopo, generalmente digoxigenina, que luego puede ser detectado. A continuación, un anticuerpo acoplado a fosfatasa alcalina se hibrida con el epítopo en la sonda de ARN, seguido del uso de un tinte colorimétrico. Con el fin de visualizar la localización del ARN dentro del embrión, se obtienen resultados que muestran con precisión dónde se expresa el gen de interés, basándose en la reacción de color y en el conocimiento de la anatomía del embrión.La principal ventaja de nuestro protocolo del instituto frente a los protocolos existentes es que es más rápido y utiliza menos reactivos sin pérdida aparente de calidad. Este método puede responder preguntas clave en embriología, como la forma en que se especifican y organizan los tejidos. Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo de opus, también puede utilizarse para muchos otros embriones pequeños, como los embriones de pez cebra y embriones tempranos de ratón.Comenzamos a desarrollar estos métodos porque los métodos originales requerían una gran cantidad de tiempo, y empezamos a experimentar con omitir los pasos de Ed para aumentar la eficiencia del procedimiento sin comprometer la calidad. La fijación de embriones se realiza en etapas. Primero, prepare los viales de vidrio que se utilizarán en todos los pasos, incluido el almacenamiento final de los embriones, para permitir el monitoreo de los embriones durante todas las etapas del proceso.Utilice viales transparentes con un buen sello de teflón en la tapa y etiquete los viales con la información experimental adecuada usando un rotulador permanente. Cubra la etiqueta con cinta transparente para evitar la pérdida de la identificación durante el procedimiento. Debido al uso de alcoholes y otros disolventes, prepare la solución de fijación MFA según se describe en el texto del protocolo.Llene cada vial de vidrio etiquetado con tres o cuatro mililitros de la solución MFA. Almacene una solución de metanol al 100 % a menos 20 grados Celsius. Prepare una pipeta de vidrio cortada y utilícela para transferir embriones a los viales de vidrio que contienen solución Memphis para la fijación.Añada los embriones con la mínima transferencia de líquido desde el medio embrionario. Fije no más de 20 a 30 embriones por vial. Deje los embriones en la solución de Memphis durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador.Al finalizar la fijación con paraformaldehído, reemplace la solución de Memphis con aproximadamente cuatro mililitros de metanol al 100 % a menos 20 grados Celsius para el almacenamiento de los embriones antes de armar la reacción de síntesis de la sonda; permita que la mezcla de ADN, agua, NTP y tampón de polimerasa se caliente a temperatura ambiente. Uno de los pasos más críticos para el éxito de este procedimiento es armar correctamente la reacción de la sonda.Monte la reacción de síntesis de la sonda a temperatura ambiente. Añada los siguientes componentes a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros en este orden: ADN molde, agua ajustada a un volumen que complete un volumen total de reacción de 20 microlitros, mezcla de NTP, inhibidor de ARN, tampón de ARN polimerasa y ARN polimerasa. Incube la reacción de transcripción durante dos horas a 37 grados Celsius.Incubaciones ligeramente más largas que dos horas no tienen efectos adversos, pero tampoco muestran un rendimiento mayor. Si se incuba durante una hora, el rendimiento se reducirá, aunque aún será suficiente para obtener una buena sonda. Cuando la reacción de transcripción haya finalizado, retire un microlitro de la mezcla de reacción para verificarlo en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE y añádalo a la mezcla de reacción restante.Añada 80 microlitros de SDS al 1 % en tampón TE, 10 microlitros de acetato de amonio cinco molar y 220 microlitros de etanol frío. Agite la mezcla vigorosamente en vórtex y déjela reposar en hielo hasta conocer los resultados del control de calidad del ARN. Después de añadir agua y colorante de carga estándar al un microlitro de ARN retirado antes de la precipitación, corra el ARN en un gel de agarosa al 1 % en tampón TAE que contenga bromuro de AUM.Visualice el ARN marcado con bromuro de etidio en el gel utilizando un transiluminador de luz ultravioleta para verificar la calidad de la sonda. Debe observarse una sola banda sin difuminación por encima o por debajo de ella. Una vez verificada la calidad del ARN, precipite el ARN restante que se había reservado en hielo mediante centrifugación en un microcentrífugo a velocidad máxima durante 10 a 15 minutos.Retire el sobrenadante con una pipeta de vidrio estrechada y deje secar brevemente el ARN. Posteriormente, el sonda se resuspende en tampón de hibridación de ARN y se almacena en un tubo de poliestireno de 15 mililitros con tapón roscado a menos 20 grados Celsius. Para comenzar este procedimiento, recupere los embriones que se almacenaron en metanol a menos 20 grados Celsius y permita que alcancen la temperatura ambiente.Todo el procedimiento se realiza en viales de vidrio. Si se van a examinar diferentes embriones de un grupo con diferentes sondas, manténgalos en un solo vial hasta justo antes de añadir las sondas. Para reducir la variabilidad y el trabajo el primer día, durante la preparación para la adición de la sonda, rehidrate los embriones mediante una serie de metanol según se indica en esta tabla; utilice pipetas de vidrio para retirar y añadir cada solución con cuidado, ya que los embriones pueden dañarse fácilmente durante este paso.Al transferir los líquidos, revise el interior de las tapas para asegurarse de que no queden embriones atrapados allí. Agite suavemente los embriones después de cada cambio para garantizar que no se adhieran a las paredes o entre sí. Y agite los embriones colocando los viales sobre un agitador rotatorio antes de usar; el tampón de hibridación de ARN y la sonda deben precalentarse a 65 grados Celsius.Hibride los embriones en la solución de sonda durante la noche con agitación a 65 grados Celsius al día siguiente. Retire la solución de sonda y guárdela en un tubo de poliestireno de 15 mililitros con tapón roscado, marcado con la fecha y el número de veces que se ha utilizado la sonda. Almacene la solución de sonda a menos 20 grados Celsius.Una vez que se retire la sonda, prepare los embriones para la tinción con anticuerpos frente a la sonda mediante una serie de lavados según se indica aquí; cambie la temperatura según sea necesario moviendo el mutador con los viales de embriones directamente a hornos de hibridación ajustados a la temperatura adecuada. Durante el tiempo en que los embriones se incuban en la solución de bloqueo, prepare el volumen apropiado de la solución de bloqueo más el anticuerpo anti-D dig para que el anticuerpo se bloquee antes de su adición a los embriones. Incube los embriones en la solución de anticuerpos durante la noche con agitación a cuatro grados Celsius al día siguiente.Retire la solución de anticuerpo y lave con mab, una solución que contiene ácido málico y cloruro de sodio. Realice al menos 12 lavados de 30 minutos con agitación a temperatura ambiente. Reemplace la última solución de lavado con el sustrato de fosfatasa alcalina.Realice la reacción de tinción a temperatura ambiente con agitación durante la noche del día siguiente. Detenga la reacción de tinción y prepare los embriones para su almacenamiento y observación microscópica cambiando los líquidos según se indica en esta tabla. Después de rehidratar los embriones, fije la tinción con MFA durante 30 minutos.Una vez fijados, retire el MFA y lave los embriones con metanol al 25%. Si es necesario eliminar el pigmento endógeno, retire el metanol al 25% y agregue la solución blanqueadora. Observe atentamente el blanqueamiento, ya que ocurre relativamente rápido, y el grado de blanqueamiento puede variarse para obtener diferentes efectos.Para el almacenamiento a largo plazo, deshidrate los embriones mediante una serie de metanol hasta alcanzar metanol al 100 % tras el blanqueamiento para almacenamiento a corto plazo e imagen posterior; transfiera los embriones a PBS. Los embriones no clarificados se observan e imaginan mejor sobre un fondo de aros al 1 %. Para preparar la solución de aros, agregue aros al agua y lleve a ebullición hasta que el aros esté en solución. Una vez que el aros haya enfriado a 50 grados Celsius, viértalo en una placa de Petri hasta una profundidad de aproximadamente dos milímetros.Cuando el platillo de aros esté listo, coloque los embriones no clarificados en el platillo y continúe con la obtención de imágenes. El aros proporciona un fondo azul grisáceo que contrasta bien con el embrión y con el color azul de la reacción de tinción. Además, ayuda a difuminar sombras y reflejos distractores que desvían la atención del embrión, lo que facilita la obtención de imágenes del embrión desde ángulos alternativos, como desde el lado ventral.Utilice pinzas finas para hacer cortes en los aros y adaptarlos al embrión. Coloque los embriones en esos canales para orientarlos. Tenga cuidado al manipular los embriones, ya que se dañan fácilmente.Utilice la fuente de luz de fibra óptica para iluminar el embrión desde un ángulo poco profundo, creando sombras sobre el embrión que aportan profundidad a la imagen y ayudan a discernir las estructuras superficiales, ya que el blanqueamiento puede eliminar el pigmento que proporciona puntos de referencia útiles. Use el efecto de sombreado para embriones fuertemente blanqueados. Los embriones clarificados se utilizan para obtener imágenes de tinciones localizadas profundamente dentro del embrión, como en la notocorda, el pulmón o regiones del cerebro.En este protocolo, se utilizan diferentes niveles de blanqueamiento para visualizar la tinción en el embrión. Si la tinción es intensa, un blanqueamiento más suave que deja algo de pigmentación permite una mejor determinación de la etapa y orientación del embrión. Sin embargo, si la tinción se encuentra en una zona con altos niveles de pigmentación, como el riñón, un mayor blanqueamiento proporciona un mejor resultado.La manipulación de la base ARO puede ayudar en la orientación del embrión. Por ejemplo, al cortar un canal fino en los ARO, un embrión en etapa de renacuajo que está acostado de lado puede observarse desde el lado ventral con suficiente estabilidad para capturar una buena imagen. Este embrión se colocó en un pequeño orificio que estabilizó su posición con el lado ventral hacia arriba, permitiendo una visualización completa del patrón de expresión del gen de interés.Los órganos internos pueden observarse tanto en embriones sin aclarar como en embriones aclarados en un embrión opaco sin aclarar teñido para PAX dos. En la etapa 34, pueden visualizarse el conducto óptico así como el tubo neural. Sin embargo, los detalles no son nítidos. Al aclarar el embrión, los límites de los sitios de expresión, incluido el conducto óptico, son más nítidos.El grado de clarificación se muestra por la capacidad de ver ambos ojos en este embrión. Sin embargo, un problema común con los embriones clarificados es que algunas tinciones se acumulan en las cavidades internas. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar una hibridación in situ en preparación completa rápidamente, con menos reactivos, y obtener imágenes de alta calidad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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