La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado

El objetivo general del siguiente experimento consiste en mostrar dónde se expresa un gen determinado dentro de un embrión intacto. Esto se logra fijando el ARN para que permanezca en su lugar dentro del embrión como un segundo paso. Una sonda de ARN antisentido específica para el gen de interés se hibrida con el ARN diana dentro del embrión.

Esta sonda contiene un epítopo, generalmente digoxigenina, que luego puede ser detectado. A continuación, un anticuerpo acoplado a fosfatasa alcalina se hibrida con el epítopo en la sonda de ARN, seguido del uso de un tinte colorimétrico. Con el fin de visualizar la localización del ARN dentro del embrión, se obtienen resultados que muestran con precisión dónde se expresa el gen de interés, basándose en la reacción de color y en el conocimiento de la anatomía del embrión.

La principal ventaja de nuestro protocolo del instituto frente a los protocolos existentes es que es más rápido y utiliza menos reactivos sin pérdida aparente de calidad. Este método puede responder preguntas clave en embriología, como la forma en que se especifican y organizan los tejidos. Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo de opus, también puede utilizarse para muchos otros embriones pequeños, como los embriones de pez cebra y embriones tempranos de ratón.

Comenzamos a desarrollar estos métodos porque los métodos originales requerían una gran cantidad de tiempo, y empezamos a experimentar con omitir los pasos de Ed para aumentar la eficiencia del procedimiento sin comprometer la calidad. La fijación de embriones se realiza en etapas. Primero, prepare los viales de vidrio que se utilizarán en todos los pasos, incluido el almacenamiento final de los embriones, para permitir el monitoreo de los embriones durante todas las etapas del proceso.

Utilice viales transparentes con un buen sello de teflón en la tapa y etiquete los viales con la información experimental adecuada usando un rotulador permanente. Cubra la etiqueta con cinta transparente para evitar la pérdida de la identificación durante el procedimiento. Debido al uso de alcoholes y otros disolventes, prepare la solución de fijación MFA según se describe en el texto del protocolo.

Llene cada vial de vidrio etiquetado con tres o cuatro mililitros de la solución MFA. Almacene una solución de metanol al 100 % a menos 20 grados Celsius. Prepare una pipeta de vidrio cortada y utilícela para transferir embriones a los viales de vidrio que contienen solución Memphis para la fijación.

Añada los embriones con la mínima transferencia de líquido desde el medio embrionario. Fije no más de 20 a 30 embriones por vial. Deje los embriones en la solución de Memphis durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador.

Al finalizar la fijación con paraformaldehído, reemplace la solución de Memphis con aproximadamente cuatro mililitros de metanol al 100 % a menos 20 grados Celsius para el almacenamiento de los embriones antes de armar la reacción de síntesis de la sonda; permita que la mezcla de ADN, agua, NTP y tampón de polimerasa se caliente a temperatura ambiente. Uno de los pasos más críticos para el éxito de este procedimiento es armar correctamente la reacción de la sonda.

Monte la reacción de síntesis de la sonda a temperatura ambiente. Añada los siguientes componentes a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros en este orden: ADN molde, agua ajustada a un volumen que complete un volumen total de reacción de 20 microlitros, mezcla de NTP, inhibidor de ARN, tampón de ARN polimerasa y ARN polimerasa. Incube la reacción de transcripción durante dos horas a 37 grados Celsius.

Incubaciones ligeramente más largas que dos horas no tienen efectos adversos, pero tampoco muestran un rendimiento mayor. Si se incuba durante una hora, el rendimiento se reducirá, aunque aún será suficiente para obtener una buena sonda. Cuando la reacción de transcripción haya finalizado, retire un microlitro de la mezcla de reacción para verificarlo en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE y añádalo a la mezcla de reacción restante.

Añada 80 microlitros de SDS al 1 % en tampón TE, 10 microlitros de acetato de amonio cinco molar y 220 microlitros de etanol frío. Agite la mezcla vigorosamente en vórtex y déjela reposar en hielo hasta conocer los resultados del control de calidad del ARN. Después de añadir agua y colorante de carga estándar al un microlitro de ARN retirado antes de la precipitación, corra el ARN en un gel de agarosa al 1 % en tampón TAE que contenga bromuro de AUM.

Visualice el ARN marcado con bromuro de etidio en el gel utilizando un transiluminador de luz ultravioleta para verificar la calidad de la sonda. Debe observarse una sola banda sin difuminación por encima o por debajo de ella. Una vez verificada la calidad del ARN, precipite el ARN restante que se había reservado en hielo mediante centrifugación en un microcentrífugo a velocidad máxima durante 10 a 15 minutos.

Retire el sobrenadante con una pipeta de vidrio estrechada y deje secar brevemente el ARN. Posteriormente, el sonda se resuspende en tampón de hibridación de ARN y se almacena en un tubo de poliestireno de 15 mililitros con tapón roscado a menos 20 grados Celsius. Para comenzar este procedimiento, recupere los embriones que se almacenaron en metanol a menos 20 grados Celsius y permita que alcancen la temperatura ambiente.

Todo el procedimiento se realiza en viales de vidrio. Si se van a examinar diferentes embriones de un grupo con diferentes sondas, manténgalos en un solo vial hasta justo antes de añadir las sondas. Para reducir la variabilidad y el trabajo el primer día, durante la preparación para la adición de la sonda, rehidrate los embriones mediante una serie de metanol según se indica en esta tabla; utilice pipetas de vidrio para retirar y añadir cada solución con cuidado, ya que los embriones pueden dañarse fácilmente durante este paso.

Al transferir los líquidos, revise el interior de las tapas para asegurarse de que no queden embriones atrapados allí. Agite suavemente los embriones después de cada cambio para garantizar que no se adhieran a las paredes o entre sí. Y agite los embriones colocando los viales sobre un agitador rotatorio antes de usar; el tampón de hibridación de ARN y la sonda deben precalentarse a 65 grados Celsius.

Hibride los embriones en la solución de sonda durante la noche con agitación a 65 grados Celsius al día siguiente. Retire la solución de sonda y guárdela en un tubo de poliestireno de 15 mililitros con tapón roscado, marcado con la fecha y el número de veces que se ha utilizado la sonda. Almacene la solución de sonda a menos 20 grados Celsius.

Una vez que se retire la sonda, prepare los embriones para la tinción con anticuerpos frente a la sonda mediante una serie de lavados según se indica aquí; cambie la temperatura según sea necesario moviendo el mutador con los viales de embriones directamente a hornos de hibridación ajustados a la temperatura adecuada. Durante el tiempo en que los embriones se incuban en la solución de bloqueo, prepare el volumen apropiado de la solución de bloqueo más el anticuerpo anti-D dig para que el anticuerpo se bloquee antes de su adición a los embriones. Incube los embriones en la solución de anticuerpos durante la noche con agitación a cuatro grados Celsius al día siguiente.

Retire la solución de anticuerpo y lave con mab, una solución que contiene ácido málico y cloruro de sodio. Realice al menos 12 lavados de 30 minutos con agitación a temperatura ambiente. Reemplace la última solución de lavado con el sustrato de fosfatasa alcalina.

Realice la reacción de tinción a temperatura ambiente con agitación durante la noche del día siguiente. Detenga la reacción de tinción y prepare los embriones para su almacenamiento y observación microscópica cambiando los líquidos según se indica en esta tabla. Después de rehidratar los embriones, fije la tinción con MFA durante 30 minutos.

Una vez fijados, retire el MFA y lave los embriones con metanol al 25%. Si es necesario eliminar el pigmento endógeno, retire el metanol al 25% y agregue la solución blanqueadora. Observe atentamente el blanqueamiento, ya que ocurre relativamente rápido, y el grado de blanqueamiento puede variarse para obtener diferentes efectos.

Para el almacenamiento a largo plazo, deshidrate los embriones mediante una serie de metanol hasta alcanzar metanol al 100 % tras el blanqueamiento para almacenamiento a corto plazo e imagen posterior; transfiera los embriones a PBS. Los embriones no clarificados se observan e imaginan mejor sobre un fondo de aros al 1 %. Para preparar la solución de aros, agregue aros al agua y lleve a ebullición hasta que el aros esté en solución. Una vez que el aros haya enfriado a 50 grados Celsius, viértalo en una placa de Petri hasta una profundidad de aproximadamente dos milímetros.

Cuando el platillo de aros esté listo, coloque los embriones no clarificados en el platillo y continúe con la obtención de imágenes. El aros proporciona un fondo azul grisáceo que contrasta bien con el embrión y con el color azul de la reacción de tinción. Además, ayuda a difuminar sombras y reflejos distractores que desvían la atención del embrión, lo que facilita la obtención de imágenes del embrión desde ángulos alternativos, como desde el lado ventral.

Utilice pinzas finas para hacer cortes en los aros y adaptarlos al embrión. Coloque los embriones en esos canales para orientarlos. Tenga cuidado al manipular los embriones, ya que se dañan fácilmente.

Utilice la fuente de luz de fibra óptica para iluminar el embrión desde un ángulo poco profundo, creando sombras sobre el embrión que aportan profundidad a la imagen y ayudan a discernir las estructuras superficiales, ya que el blanqueamiento puede eliminar el pigmento que proporciona puntos de referencia útiles. Use el efecto de sombreado para embriones fuertemente blanqueados. Los embriones clarificados se utilizan para obtener imágenes de tinciones localizadas profundamente dentro del embrión, como en la notocorda, el pulmón o regiones del cerebro.

En este protocolo, se utilizan diferentes niveles de blanqueamiento para visualizar la tinción en el embrión. Si la tinción es intensa, un blanqueamiento más suave que deja algo de pigmentación permite una mejor determinación de la etapa y orientación del embrión. Sin embargo, si la tinción se encuentra en una zona con altos niveles de pigmentación, como el riñón, un mayor blanqueamiento proporciona un mejor resultado.

La manipulación de la base ARO puede ayudar en la orientación del embrión. Por ejemplo, al cortar un canal fino en los ARO, un embrión en etapa de renacuajo que está acostado de lado puede observarse desde el lado ventral con suficiente estabilidad para capturar una buena imagen. Este embrión se colocó en un pequeño orificio que estabilizó su posición con el lado ventral hacia arriba, permitiendo una visualización completa del patrón de expresión del gen de interés.

Los órganos internos pueden observarse tanto en embriones sin aclarar como en embriones aclarados en un embrión opaco sin aclarar teñido para PAX dos. En la etapa 34, pueden visualizarse el conducto óptico así como el tubo neural. Sin embargo, los detalles no son nítidos. Al aclarar el embrión, los límites de los sitios de expresión, incluido el conducto óptico, son más nítidos.

El grado de clarificación se muestra por la capacidad de ver ambos ojos en este embrión. Sin embargo, un problema común con los embriones clarificados es que algunas tinciones se acumulan en las cavidades internas. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar una hibridación in situ en preparación completa rápidamente, con menos reactivos, y obtener imágenes de alta calidad.