Name: Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda a realizar imagen semi-automatizada de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra Danio rerio. Este protocolo permite detectar células sensibles a estrógenos y estudiar la actividad de receptores hormonales en desarrollo.

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Damos las gracias a Susan Farmer y el personal del centro de investigación de la UAB pez cebra para el cuidado de pez cebra. Financiamiento proporcionado por los fondos de puesta en marcha del Departamento de Farmacología y Toxicología.

NOTA: Este protocolo fue aprobado por la Universidad de Alabama en Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Birmingham. 1. Cría de pez cebra y huevo Colecciones <ol><li> Tres días antes de comenzar la exposición a sustancias químicas, montar tanques de cría con separadores a hombres y mujeres por separado. Rellene cada mitad del tanque con agua del sistema de acuicultura. El uso de una red, transferencia de TG (5xERE: GFP) peces c262/c262 a los tanques de cría, la colocación de 2 machos y 3 hembras en cada tanque separados por un divisor. Coloque una tapa en cada tanque y la etiqueta con la fecha y cepas para ser cruzados. </li><li> A la mañana siguiente, eliminar todos los obstáculos e inclinación desconcierta para crear una zona de poca profundidad en un extremo del tanque de cría. Permita que el pez cebra para aparearse, recogiendo embriones a intervalos de 10 minutos para asegurar la puesta en escena del desarrollo preciso. Huevos limpios de enjuague a través de un colador de té utilizando medio E3B y embriones suavemente rasantes en placas de Petri. Volver a los peces adultos permanentetanques. </li><li> El uso de un microscopio de disección, clasificar, contar y eliminar cualquier embrión no fecundados, anormales o dañados. Coloque los embriones en placas de Petri en medio E3B y la casa de 28,5 ° C con una luz 14:10: oscuridad ciclo. Densidad de embriones puede afectar el desarrollo. Coloque no más de 100 embriones en una placa de 100 mm x 35 y no más de 50 embriones en una placa de 60 mm x 15. </li><li> Por 24 HPF, sustitución de los medios con E3B contiene 200 M 1-fenil-2 tiourea (PTU). PTU impide la formación de pigmento y mantiene embriones de pez cebra y larvas transparentes para mejorar la claridad de la imagen. PRECAUCIÓN: concentrado PTU valores es peligroso; usar guantes al realizar solución E3B + PTU. </li><li> A después de la fecundación de 1 día (dpf), quite manualmente el corion de cada embrión utilizando unas pinzas finas. El corion no parece afectar a la penetración de los estrógenos, sin embargo la eliminación mejora la claridad de la imagen. No hay necesidad de eliminar chorions de los medios de comunicación. NOTA: Como alternativa a dechorionation manual, lotes de embriones pueden ser chemicamente dechorionated utilizando 1 mg / ml de pronasa tratamiento, como se ha descrito previamente 11. </li></ol> 2. Tratamiento Químico de Embriones <ol><li> El día antes del tratamiento, preparar soluciones madre de cada producto químico a una concentración 1.000 veces en DMSO (o disolvente apropiado). Por ejemplo, para exponer los embriones a 10 M bisfenol A (BPA), preparar una solución de 10 mM de BPA en 100% de DMSO. Esto asegura concentración de DMSO en cada tratamiento uniforme y permite una dilución 1:1000 no tóxico de DMSO para servir como un control del vehículo. Soluciones de tienda de existencias a -20 ° C. Para este protocolo, los embriones estarán expuestos a 1 M y 10 M de BPA, 18,5 nM y 1,85 M genisteína, 367 nM de estradiol (control positivo) y el vehículo (0,1% de DMSO, control negativo). PRECAUCIÓN: Los productos químicos como BPA y estradiol son peligrosos y pueden tener efectos nocivos sobre el feto humano. Maneje los disruptores endocrinos con cuidado y use siempre el equipo de protección personal adecuado.</li><li> En el día del tratamiento, deshielo prepara soluciones químicas de las acciones. Diluir 1:1.000 con la pipeta 1 ml E3B + PTU en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 1 l de solución madre química. Vortex vigorosamente. Diluir DMSO 1:1.000 en E3B + PTU como un control del vehículo. Utilice 1 ml E3B + PTU en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml como control no tratado. </li><li> El uso de un gran pipeta de transferencia de plástico orificio, embriones de transferencia de placas de Petri en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, 3 embriones por pocillo, 3 pocillos por condición. Para evitar la evaporación durante el tratamiento prolongado, omita los embriones de filas y columnas exteriores de la placa (filas A y E, columnas 1 y 12). Pocillos externos se pueden llenar con 300 l de E3B + PTU. Etiquetar la tapa placa adecuada. </li><li> Retire el medio de cada pocillo con una pipeta de transferencia de plástico de punta fina. Trabaje con rapidez para evitar la desecación de los embriones. </li><li> Añadir 200 l de solución de tratamiento en pocillo correspondiente. Coloque la tapa underneath la placa como una guía para asegurar Además de los tratamientos en los pocillos apropiados. Vortex cada tubo antes de dispensar para distribuir el producto químico en solución. Confirmar visualmente cada embrión es en la solución de tratamiento. Si los embriones están en el lado del pozo, utilizar una pipeta de transferencia limpia para lavarlos en el pozo con la solución de tratamiento. </li><li> Colocar la placa en la incubadora a 28,5 ° C. Se analizarán los embriones de fluorescencia a 72 HPF. </li></ol> 3. Automated Imaging de embriones en placas de 96 pocillos <ol><li> Anestesie embriones mediante la adición de 10 l de 4 mg / ml de tricaína a cada pocillo. NOTA: Anestesie embriones antes de la formación de imágenes. En 24-96 HPF, el pez cebra exhiben movimiento espontáneo y una respuesta de sobresalto a la fuente de luz cambia durante la captura de imágenes. Anestesiar embriones reduce el movimiento durante el procedimiento. </li><li> Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa motorizada y calibrar la etapa. Usando Zeiss Zen Azul 2011 software para automáticamente microscopíaencendido y de control, seleccione la opción de soporte de muestras y seleccione multiwell 96. Seleccione Calibrar. Siga las instrucciones paso a paso para calibrar el escenario. NOTA: No desactive el botón de azulejos después de este paso. Si el botón de azulejos está seleccionada, los ajustes de calibración se pueden perder y necesitarán la placa de 96 pocillos ser recalibrado. </li><li> Utilizando un objetivo de 10x y el campo claro (BF) establecer, identificar un embrión de control positivo y establecer los ajustes de exposición apropiadamente para BF y canales de GFP, asegurándose de que la señal de fluorescencia no está saturando la cámara. Centrarse en un solo embrión y programar el microscopio para adquirir 3 Z-secciones en total, una imagen de 50 m por encima y otro por debajo de 50 micras el plano focal actual. NOTA: Debido a los diferentes tejidos ocupan diferentes planos focales, esto asegurará que se capturan para cada imagen de pez cebra con el corazón y el hígado en el enfoque. </li><li> Establezca los parámetros de software para adquirir una imagen de mosaico utilizando GFP y BF channels. En la pestaña de adquisición, seleccionar Configuración avanzada. Seleccione las regiones de azulejos, a continuación, azulejos. Elija la opción círculo también. NOTA: baldosas se utiliza para crear una imagen compuesta de cada pocillo. Un campo de visión de un solo capta sólo una pequeña porción de cada pocillo. La función de mosaico puede capturar de forma automática múltiples adyacentes campos de visión de cada pozo, creando una imagen compuesta de todo el pozo. Por lo tanto, es posible capturar automáticamente 96 imágenes compuestas por placa, donde cada imagen compuesta contiene varias docenas de imágenes individuales de un solo pozo. </li><li> Seleccione la compañía y el factor de llenado del 90%. Selección de un factor de llenado de 90% será capturar múltiples imágenes de los pocillos seleccionados tal que el 90% de la superficie de cada pocillo será visible en la imagen compuesta. NOTA: Al seleccionar factor de relleno, un diagrama se muestra que representa el área a explorar. Seleccione un porcentaje que incluirá el área del pozoque es apropiado para el experimento. </li><li> En Opciones, seleccione la cantidad de superposición deseado. NOTA: Cuando la costura de azulejos para una sola imagen representativa, una superposición de 5 a 10% permite una costura lisa entre las imágenes. Sin embargo, si la imagen de costura es innecesaria, utilizando un solapamiento de 0% reducirá el tiempo de formación de imágenes. El uso de 90% de factor de relleno y 5% de superposición, una imagen compuesta de un solo pozo consta de 59 imágenes individuales. </li><li> Iniciar la formación de imágenes. El microscopio adquirirá automáticamente las imágenes. </li><li> Inspeccionar manualmente las imágenes compuestas de cada pocillo para la fluorescencia específico de tejido (Figura 1). </li><li> NOTA: Es mejor comenzar con el control positivo para confirmar que la exposición química trabajó antes de la observación de los pozos de tratamiento experimental. </li></ol> 4. Manual Image Capture de embriones de 96 pocillos Placa NOTA: Para confirmar los resultados, utilice un objetivo de 20x larga distancia de trabajo de acqui si las imágenes más detalladas manualmente (Figura 2). <ol><li> Usando un objetivo de 20x y el campo claro (BF) establecer, identificar un embrión de control positivo y establecer los ajustes de exposición para los canales de BF y GFP adecuadamente, asegurándose de que la señal de fluorescencia no está saturando la cámara. </li><li> Identificar embriones individuales y capturar imágenes de forma manual. NOTA: Una vez que los ajustes de la exposición han sido seleccionadas por el embrión de control positivo, no modifique los ajustes. Esto permite una comparación de la intensidad de fluorescencia a medida que cada imagen se captura en condiciones uniformes. </li></ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Este protocolo describe un método directo para automáticamente una imagen de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra. El protocolo fue desarrollado utilizando un Zeiss Axio Observer. Z1 con el software de Zen Azul 2011, sin embargo, la técnica se puede adaptar usando cualquier microscopio invertido con una platina motorizada y software de control de microscopio que puede realizar suelo de baldosas para crear imágenes compuestas. Equipar a un microscopio invertido con una platina motorizada puede pro...

Pez cebra transgénico se han desarrollado que permite la visualización directa de la actividad en las vías de señalización, tales como factores de crecimiento de fibroblastos 1, el ácido retinoico 2 y 3 estrógenos, en embriones vivos. Estas herramientas permiten la detección de productos químicos que perturban las vías de señalización (ensayada como el cambio en la intensidad de fluorescencia) o para los productos químicos que modulan la señalización de una manera específica de tejido (el cambio en la localización de la fluorescencia) 4. Captura de imagen automatizada aumenta el rendimiento de las pantallas químicas dramáticamente 5,6. Pantallas que la fluorescencia de ensayo de forma automática en el pez cebra en vivo a menudo dependen de un equipo caro y especializado. La llamada de cribado de alto contenido proporciona el beneficio de alta resolución, formación de imágenes cuantitativo pero a costa de la utilización de lectores de placas especializadas equipadas para microscopía confocal 7,8. El objetivo de este método es automáticamente ensayo de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebraen una placa de 96 pocillos usando un microscopio de epifluorescencia estándar. La fluorescencia específica del tejido se puede distinguir usando esta técnica y puede ser un enfoque razonable para los laboratorios que no tienen acceso a lectores de placas o equipos especializados-alto contenido de cribado. En este protocolo, utilizamos imágenes automatizado para detectar los receptores de estrógenos específico de tejido (ER) agonistas en el pez cebra en vivo en 3 días después de la fertilización (dpf). La línea transgénica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contiene 5 secuencias en tándem de respuesta de estrógeno de elementos de ADN (ERE) aguas arriba de la proteína verde fluorescente (GFP) 3. En ausencia de ligando, el ERS son normalmente inactivo. La unión del ligando provoca un cambio conformacional, permitiendo que los receptores de unirse al ADN y regulan la transcripción ERE 9. 5xERE: peces GFP se pueden utilizar para cribar bibliotecas químicas para moduladores de ER y se pueden utilizar para cribar muestras de agua ambiental para los contaminantes estrogénicos.

<table><tbody><tr><td>Pipetas de transferencia de plástico; diámetro ancho</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia de plástico; punta fina</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos, redondas, de fondo plano</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 100 x 35 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 35 x 60 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fina Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>dimensiones de la punta 0,05 x 0,01 mm, para eliminar manualmente los coriones de los embriones</td></tr><tr><td>Metanosulfonato de tricaína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>ver el Libro de pez cebra para la receta (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp;</td></tr><tr><td>1-fenil 2-tiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>Prepare 20 mM de caldo (100x) y úselo a 200 &mu; M en E3B&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>El protocolo requiere un microscopio de fluorescencia invertida con una platina motorizada</td></tr><tr><td>Objetivo de distancia de trabajo de 20x</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Utilizamos un objetivo con 0,4 NA y 8,4 mm de distancia de trabajo</td></tr><tr><td>Cámara digital Axiocam HRm</td><td>Carl Zeiss Software de control de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio ZenBlue 2011</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>El protocolo requiere un software de automatización y control de microscopía para permitir la captura de imágenes en mosaico utilizando una etapa motorizada</td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MB-1; 25 gramos</td><td>hacen una solución al 2% en agua de ósmosis inversa para usar en E3B (abajo)</td></tr><tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60X E3 SOLUCIÓN: NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 17,2 gramos KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,76 gramos CaCl2-2H2O&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 2,9 gramos MgSO4-7H2O&nbsp; - 4,9 gramos o MgSO4 - 2,39 gramos Disolver en 1 litro de agua Milli-Q; almacenar en una botella estéril de 1 litro. 1X E3B SOLUCIÓN PARA PEZ CEBRA: 60X E3&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 150 ml 2% azul de metileno&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 &mu; l&nbsp; Llevar a 9 litros con agua Milli-Q &nbsp;</td></tr></tbody></table>

imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Embriones de pez cebra son una poderosa herramienta para el cribado a gran escala de las moléculas pequeñas. Pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes reportero se utilizan con frecuencia para identificar productos químicos que modulan la expresión génica. Pantallas químicas que ensayo de fluorescencia en el pez cebra en vivo a menudo dependen de un equipo costoso, especializado para el cribado de alto contenido. Se describe un procedimiento utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar con una platina motorizada a la imagen automáticamente embriones de pez cebra y detectar la fluorescencia específica del tejido. El uso de pez cebra transgénico que reportan la actividad del receptor de estrógeno a través de la expresión de GFP, hemos desarrollado un procedimiento semi-automático para la detección de ligandos del receptor de estrógeno que activan el reportero en una manera específica de tejido. En este video se describen los procedimientos para poner en orden embriones de pez cebra a las 24-48 horas después de la fecundación (HPF) en una placa de 96 pocillos y la adición de pequeñas moléculas que se unen a receptores de estrógeno. En 72-96 HPF, las imágenes de cada pocillo detoda la placa se recogen de forma automática y la inspección manual de la fluorescencia específica del tejido. Este protocolo demuestra la capacidad para detectar los estrógenos que activan los receptores en las válvulas del corazón, pero no en el hígado.

La Figura 1 muestra imágenes compuestas a partir de pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Cada imagen compuesta se compone de 59 imágenes individuales con 5% imagen de superposición. Tenga en cuenta que el pez cebra en vivo están orientadas aleatoriamente dentro de cada pocillo, sin embargo, son capaces de distinguir la fluorescencia en el corazón desde el hígado. Imágenes de campo claro son útiles como referencias para evaluar la orientación del pez cebra y visualizar anormalidades morfoló...

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar automáticamente las células sensibles al estrógeno en larvas vivas de pez cebra. Esto se logra primero cruzando cinco peces adultos X-E-R-E-G-F-P para generar embriones de pez cebra con reportero de estrógeno. A continuación, los embriones se colocan en pozos individuales de una placa de 96 pozos.Luego se añaden estrógenos a la placa de embriones. Finalmente, se escanea la placa en busca de fluorescencia utilizando un microscopio epifluorescente con una platina motorizada. En última instancia, se utiliza la microscopía de fluorescencia para mostrar la actividad específica de los receptores de estrógenos en los tejidos.Por lo tanto, la principal ventaja de utilizar esta técnica frente a otras técnicas tradicionales, como el cribado de alto rendimiento o el cribado de alto contenido, es que se puede obtener imágenes de la fluorescencia específica de tejidos en larvas de pez cebra utilizando únicamente un microscopio epi-fluorescente estándar equipado con una platina motorizada, sin necesidad de un lector de placas especializado. Los productos químicos peligrosos como el BPA y el estradiol son peligrosos y pueden tener efectos perjudiciales sobre el feto humano.Manipule los disruptores endocrinos con cuidado y utilice siempre el equipo de protección personal adecuado. En esta demostración, los peces cebra serán expuestos a los estrógenos 17 beta estradiol, bisfenol A y genisteína en diversas dosis, comenzando a las 48 horas posteriores a la fertilización, tras reproducir los peces cebra y recolectar y equiparar los huevos. Según el texto del día del tratamiento, diluya las soluciones químicas stock descongeladas, de uno a 1000 en un mililitro de E3B más PTU, y vortexee vigorosamente.Como control de vehículo. Utilice una dilución de uno a 1000 de DMSO en E tres B y PTU usando una pipeta plástica de gran orificio. Transfiera con pipeta tres embriones por pocillo a una placa de 96 pocillos, preparando tres pocillos por condición.Evite colocar embriones en los pozos periféricos para prevenir la evaporación del medio durante tratamientos prolongados. Trabaje rápidamente para evitar que los embriones se sequen, retire el medio de cada pozo y agregue 200 microlitros de la solución de tratamiento bien mezclada. Verifique visualmente que todos los embriones estén sumergidos en la solución y no adheridos a la pared del pozo.Incubar los embriones a 28,5 grados Celsius durante 72 horas. Posterior a la fertilización, anestesiar los embriones agregando 10 microlitros de cuatro miligramos por mililitro de trica. A cada pozo, colocar la placa de 96 pozos sobre una platina motorizada y utilizando el software Zeiss Zen Blue 2011.Calibre la platina seleccionando la opción de portamuestras y eligiendo la placa de 96 pocillos. A continuación, seleccione calibrar y siga las instrucciones paso a paso, utilizando un objetivo de 10x y el ajuste de campo claro o BF; identifique un embrión de control positivo y configure adecuadamente los ajustes de exposición para los canales BF y GFP, asegurándose de que la señal de fluorescencia no sature la cámara. Enfóquese en un solo embrión y programe el microscopio para adquirir un total de tres secciones en Z, que incluyan una imagen a 50 micrómetros por encima y otra a 50 micrómetros por debajo del plano focal actual.A continuación, configure los parámetros del software para adquirir una imagen compuesta utilizando los canales GFP y BF. En la pestaña de adquisición, seleccione configuración avanzada, seleccione regiones de mosaico y luego mosaicos. Elija el círculo.Seleccione la opción de pocillos, el portador y un factor de llenado del 90 % para capturar múltiples imágenes de los pocillos seleccionados, de modo que el 90 % del área de cada pocillo sea visible en la imagen compuesta. En opciones, seleccione la cantidad de superposición deseada, como entre un 5 y un 10 %, lo que permite una transición suave entre las imágenes. Luego, inicie la adquisición de imágenes para capturar manualmente las imágenes utilizando un objetivo de 20x y el ajuste de contraste de fase (BF), e identifique un embrión de control positivo.Configure los ajustes de BF y GFP como antes y capture las imágenes. Esta figura muestra imágenes compuestas de pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Cada imagen está compuesta por 59 imágenes individuales con un solapamiento del 5% entre ellas.Téngase en cuenta que los peces cebra vivos están orientados aleatoriamente dentro de cada pocillo. Sin embargo, somos capaces de distinguir la fluorescencia en el corazón de la fluorescencia en el hígado. Las imágenes de campo claro son útiles como referencias para evaluar la orientación del pez cebra y visualizar anomalías morfológicas.Las imágenes mostradas aquí se capturaron con un objetivo de larga distancia de trabajo de 20 x para un análisis más detallado, y se tomaron inmediatamente después del escaneo automatizado que acaba de mostrarse, sin retirar la placa del portaobjetos del microscopio. Utilizando un objetivo de 20 x, la fluorescencia en el corazón puede localizarse con precisión en las válvulas aurículoventriculares señaladas por las flechas y en las válvulas aórticas, tal como indica la punta de flecha. Una vez dominada esta técnica, se pueden capturar imágenes de 3 placas de 96 pocillos por día.No olvide que trabajar con compuestos que alteran el sistema endocrino puede ser peligroso, por lo que siempre debe tomar las precauciones adecuadas, como usar el equipo de protección personal adecuado durante este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

Fuente: Zhang, X., et al. Un modelo de embrión de pez cebra para la visualización in vivo y el análisis intravital de la infección por Staphylococcus aureus asociada a biomateriales. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra imágenes de fluorescencia de embriones de pez cebra inyectados con Staphylococcus aureus, lo que permite cuantificar la progresión de la infección y la distribución bacteriana para evaluar el impacto de las microesferas de biomateriales en las interacciones huésped-patógeno in...

 Imágenes de fluorescencia de infección bacteriana asociada a biomateriales en embriones de pez cebra

El desarrollo de pez cebra se puede seguir durante días con la microscopía de lámina de luz cuando los embriones están inmersos en tubos de polímero ópticamente claros con agarosa de baja concentración.

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

La mitosis es crítica para todo organismo vivo y los defectos a menudo conducen al cáncer y trastornos del desarrollo. Utilizando este protocolo de imagen y el pez cebra como sistema modelo, los investigadores pueden visualizar la mitosis en un organismo vertebrado vivo y la multitud de defectos que surgen cuando los procesos mitóticos son defectuosos.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

Este protocolo demuestra la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en criosecciones de embriones de pez cebra en etapa temprana que permiten análisis precisos de la colocación en poblaciones celulares específicas.

Inmunofluorescencia secuencial e inmunohistoquímica en embriones de pez cebra crioseccionados

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Se describe una estrategia de preparación de muestras para obtener imágenes de embriones tempranos de pez cebra dentro de un corion intacto utilizando un microscopio de lámina de luz. Analiza las diferentes orientaciones que adquieren los embriones dentro del corion en las etapas de epibolia y yema del 70% y detalla estrategias de imagen para obtener una resolución a escala celular en todo el embrión utilizando el sistema de lámina de luz.

Imágenes de microscopía de lámina de luz y estrategias de montaje para embriones tempranos de pez cebra

Aprenda a realizar imagen semi-automatizada de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra Danio rerio. Este protocolo permite detectar células sensibles a estrógenos y estudiar la actividad de receptores hormonales en desarrollo.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

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