Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es detectar automáticamente las células que responden al estrógeno en larvas vivas de pez cebra. Esto se logra mediante la cría inicial de cinco peces adultos X-E-R-E-G-F-P para generar embriones de pez cebra reportero de estrógeno. A continuación, los embriones se colocan en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos.

A continuación, se añaden estrógenos a la placa de embriones. Finalmente, la placa se escanea para determinar la fluorescencia utilizando un microscopio epifluorescente con una platina motorizada. En última instancia, la microscopía fluorescente se utiliza para mostrar la actividad específica del tejido de los receptores de estrógeno.

Por lo tanto, la principal ventaja de usar esta técnica sobre otras técnicas tradicionales como el cribado de alto rendimiento o alto contenido, es que la fluorescencia específica del tejido en las larvas de pez cebra se puede obtener con un microscopio epifluorescente estándar. Equipado con una etapa motorizada, no es necesario un lector de placas especializado. Precaución: los productos químicos con BPA y estradiol son peligrosos y pueden tener efectos nocivos en el feto humano.

Manipule los disruptores endocrinos con cuidado y utilice siempre el equipo de protección personal adecuado. En esta demostración, el pez cebra estará expuesto a los estrógenos 17 beta estradiol, bisfenol A y genina en varias dosis, comenzando a las 48 horas después de la fertilización después de la cría de pez cebra, y recolectando y equiparando huevos. De acuerdo con el texto el día del tratamiento, diluya las soluciones químicas de descongelación de stock, de uno a 1000 en un mililitro de E tres B más el vórtice de PTU vigorosamente.

Como control de vehículos. Utilice una dilución de uno a 1000 de DMSO en E, tres, B y PTU utilizando una transferencia de plástico de gran diámetro. La pipeta transfiere tres embriones por pocillo a una placa de 96 pocillos, preparando tres pocillos por condición.

Evite colocar los embriones en pozos exteriores para evitar la evaporación del medio durante un tratamiento prolongado. Trabajando rápidamente para evitar la desecación de los embriones, retire el medio de cada pocillo y agregue 200 microlitros de solución de tratamiento bien mezclada. Confirme visualmente que todos los embriones estén sumergidos en la solución y no estén pegados al costado del pocillo.

Incubar los embriones a 28,5 grados centígrados a las 72 horas. Anestesiar los embriones después de la fertilización añadiendo 10 microlitros de cuatro miligramos por mililitro de trica. Para cada pozo, coloque la placa de 96 pocillos en una platina motorizada y utilizando el software Zeiss Zen Blue 2011.

Calibre la platina seleccionando la opción de portador de muestras y eligiendo multipocillo 96. A continuación, seleccione calibrar antes de seguir las instrucciones paso a paso, utilizando un objetivo de 10x y la configuración de campo claro o BF, identifique un embrión de control positivo y establezca los ajustes de exposición adecuados para los canales BF y GFP, asegurándose de que la señal de fluorescencia no sature la cámara. Concéntrese en un solo embrión y programe el microscopio para adquirir un total de tres secciones Z que incluyen una imagen a 50 micrómetros por encima y otra a 50 micrómetros por debajo del plano focal actual.

A continuación, configure los parámetros del software para adquirir una imagen en mosaico utilizando los canales GFP y BF. En la pestaña de adquisición, seleccione configuración avanzada, seleccione regiones de mosaico y, a continuación, mosaicos. Elige el círculo.

Opción de pozo: seleccione el portador y el factor de llenado 90% para capturar varias imágenes de los pozos seleccionados, de modo que el 90% del área de cada pozo sea visible en la imagen compuesta. En opciones, seleccione la cantidad de superposición deseada, como cinco a 10%, lo que permite una costura suave entre las imágenes. A continuación, comience a tomar imágenes para capturar imágenes manualmente utilizando un objetivo de 20 x y la configuración BF, identifique un embrión de control positivo.

Establezca los ajustes BF y GFP como antes y tome imágenes. Esta figura muestra imágenes compuestas de pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Cada imagen se compone de 59 imágenes individuales con un 5% de superposición de imágenes.

Tenga en cuenta que los peces cebra vivos están orientados aleatoriamente dentro de cada pozo. Sin embargo, somos capaces de distinguir la fluorescencia en el corazón de la fluorescencia en el hígado. Las imágenes de campo claro son útiles como referencia para evaluar la orientación del pez cebra y visualizar anomalías morfológicas.

Las imágenes que se muestran aquí se capturaron con un objetivo de distancia de trabajo de 20 veces para un análisis más detallado, y se tomaron directamente después del escaneo automatizado que se acaba de mostrar sin quitar la placa de la platina del microscopio. Usando un objetivo de 20x, la fluorescencia en el corazón se puede localizar con precisión en las válvulas ventriculares auriculares señaladas por las flechas y las válvulas aórticas como lo indica la punta de flecha. Una vez que se domina esta técnica, se pueden capturar imágenes de 3 96 placas de pared por día.

No olvide que trabajar con compuestos disruptores endocrinos puede ser peligroso, así que siempre tome las precauciones adecuadas, como usar el equipo de protección personal adecuado mientras realiza este procedimiento.