Evaluar Aportes específicos de la especie para el desarrollo craneofacial Utilizando quimeras Quail-pato

El objetivo general de este procedimiento es utilizar las quimeras del conducto de codorniz como un medio para investigar los mecanismos a través de los cuales las células de la corteza neural generan patrones específicos de la especie durante el desarrollo facial craneal. Esto se logra diseccionando y extrayendo primero una tira del pliegue neural de la región media y anterior del cerebro posterior de un embrión de codorniz en etapa 9.5. El segundo paso consiste en transferir el pliegue neural del donante de codorniz al embrión huésped del pato.

El tercer paso consiste en diseccionar y extirpar la región equivalente de un embrión huésped de pato en estadio 9.5. El paso final es colocar el pliegue neural de la bobina en la región del cerebro posterior medio y anterior del pato. En última instancia, los embriones quiméricos resultantes pueden identificar cambios mediados por la cresta neural en la expresión génica a través de la hibridación en C dos, y también pueden revelar cambios morfológicos a través de análisis histológicos.

La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando observaba a los pelícanos marrones volar sobre Ocean Beach en San Francisco. Me di cuenta de que las células de la cresta neural deben ser la fuente de un patrón específico de la especie, ya que dan lugar a los huesos y cartílagos de su largo esqueleto de pico. Aunque no pude localizar huevos de pelícano marrón, pude encontrar pato blanco de Pekín.

Dado que San Francisco tiene el barrio chino más grande fuera de Asia explotando las diferencias en las tasas de maduración y morfología entre codornices y patos. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en la biología del desarrollo, como la comprensión de los orígenes del patrón específico de la especie, La realización de la cirugía estará a cargo de la Dra. Jennifer Fish, quien es una becaria postdoctoral En mi laboratorio, la asistencia será Kate Ovitz, quien es una estudiante graduada Usando un bollo y un quemador, caliente el extremo estrecho de una pipeta de pasta hasta que el vidrio a lo largo del cono comience a derretirse. Retírelo de la llama y tire de la punta hasta que la pipeta quede sellada.

Asegúrese de que una parte de la parte cónica tenga un diámetro exterior de entre 0,7 y un milímetro. A continuación, rompa el extremo sellado a unos cuatro centímetros del cono. A continuación, conecte aproximadamente dos pies de tubo de goma al extremo abierto del soplado de pipeta en el otro extremo.

No debe haber aire que pase a través de la conexión u otro extremo de la pipeta mientras se proporciona una presión suave soplando sobre el tubo. Use un lápiz de propano, un soplete de llama para calentar un área ovalada en un lado de la pipeta justo debajo del inicio del cono. Tan pronto como el vidrio comience a doblarse hacia afuera, retire la pipeta de la llama y sople suavemente a través del tubo de goma.

Esto hará que la parte calentada del vaso forme una burbuja en forma de salchicha. Demasiada presión hará que la burbuja de vidrio explote, y esto debe evitarse. La ventana resultante en la pipeta debe tener aproximadamente un centímetro de ancho y de un centímetro y medio a dos centímetros de largo.

Ahora apunte el extremo cónico hacia arriba y raspe la burbuja en un contenedor de residuos de vidrio mientras sopla suavemente a través del tubo para evitar que los fragmentos de vidrio entren en la pipeta. Luego, con la llama de propano, quema con cuidado los bordes restantes de la burbuja y pule al fuego los lados de la ventana abierta. A continuación, sostenga el lápiz de punta de diamante en posición vertical, use un lápiz de punta de diamante para marcar el extremo cónico de la pipeta a un centímetro del comienzo de la conicidad.

Con pinzas, rompa suavemente la pipeta en la línea marcada. Para quitar la punta, revisa bajo un microscopio de disección para asegurarte de que la rotura esté limpia y no dentada. Sostenga la pipeta como se sostendría un lápiz con el dedo índice sobre la ventana abierta a aproximadamente 9,5 milímetros de la punta.

Ablande el vidrio de la pipeta sosteniéndolo junto al borde de la llama de un quemador de alcohol. Aplique presión a la punta con pinzas para doblar el extremo estrecho de la pipeta hacia abajo en un ángulo de 60 grados bajo un endoscopio de disección. Rápida y cuidadosamente, el fuego pulió la punta con el quemador de alcohol.

La abertura terminada debe ser redondeada y sin obstrucciones. Tenga en cuenta que la punta se constreñirá y quedará inutilizable si se mantiene en la llama demasiado tiempo. Ahora lubrique un tubo de goma de 2,5 centímetros de longitud con etanol al 70%.

Deslícelo sobre el eje de la pipeta desde la parte inferior hacia arriba para cubrir la ventana abierta. A continuación, coloque una pera de látex de dos mililitros en el extremo abierto de la pipeta. Para mantener la presión de aire interna, primero, prepare el huevo huésped.

Corta la membrana Vitale con una aguja de tungsteno afilada con llama y tira de la membrana sobre el embrión. Luego, vuelve a sellar el óvulo con cinta adhesiva como se hizo con el óvulo de la donante. Retire la cinta de la ventana del óvulo donado para cortar el pliegue neural del embrión donante.

Haz ranuras en ambos lados del tubo neural con una aguja de tungsteno afilada con llama. A continuación, corte a través del tubo neural en los niveles anterior y posterior deseados del injerto y separe el injerto del resto del tubo neural. Preste atención a cualquier detalle anatómico particular, como la forma anterior frente a la posterior del injerto, lo que hará que el tejido del donante se oriente correctamente.

Cuando se coloque en el host, asegúrese de que la aguja de tungsteno esté extremadamente afilada. Utilice movimientos rápidos y deliberados para eliminar el tejido por completo y en una sola pieza, retire el pliegue neural del embrión donante con una pipeta de chamán. Extraiga la menor cantidad de líquido posible o el tejido podría flotar durante la transferencia.

Ahora retire la cinta de la ventana del óvulo huésped y use la pipeta del chamán para colocar el pliegue neural del donante junto al embrión huésped adyacente a la región del tubo neural que recibirá el trasplante. Ahora separe el pliegue neural del tubo neural del embrión huésped como se hizo con el donante. Tenga cuidado de extraer un injerto del mismo tamaño que el tejido del donante.

Empuje suavemente este tejido huésped lejos del embrión. A continuación, con una aguja de tungsteno roma o con la punta redondeada de una micropipeta, mueva suavemente el pliegue neural del donante hacia el tubo neural del huésped, manteniendo las orientaciones posteriores y dorsales ventrales de la antera adecuadas. Asegúrese de que el injerto esté metido a lo largo de los lados, pero asegúrese de no pinchar ni dañar los tejidos subyacentes.

La solución salina estéril debe aplicarse con cuidado y suavidad sobre el embrión huésped. Si hay algún signo de desecación, ahora vuelva a sellar y etiquetar cuidadosamente el huevo y devuélvalo suavemente a una incubadora de alta humedad donde el embrión quimérico puede desarrollarse hasta la etapa deseada. Para el análisis.

Para el análisis, recoja los embriones quiméricos en un fijador frío de Sarah recién hecho. Luego, colóquelos inmediatamente en un balancín a cuatro grados centígrados para una fijación durante la noche. Esto permitirá una detección más sensible de los huevos de codorniz con el anticuerpo anti codorniz.

Otro paso importante para los análisis de expresión génica por PCR cuantitativa en tiempo real es congelar los embriones y el nitrógeno líquido antes del ARN. Las bobinas de extracción y los patos muestran diferencias considerables en tamaño y forma, por lo que sus embriones son ideales para hacer un sistema quimérico. Estudiar el desarrollo craneofacial C.

En concreto, el sistema es útil para investigar el papel de las células de la cresta neural. Al modelar el esqueleto facial en la quimérica qua embrión donante de codorniz, las células de la cresta neural migran hacia el arco mandibular del pato huésped. En un patrón similar al de un pato, las células donantes de codorniz en verde se ven con un anticuerpo anticodorniz desde la vista ventral.

En un embrión quimérico en etapa 12, la cresta neural del donante genera un esqueleto mandibular que es similar al de una codorniz en tamaño y forma. Una vez dominado, cada trasplante se puede realizar en aproximadamente cinco minutos. Si se hace correctamente por más tiempo, pone al embrión en riesgo de desecación y la tasa de supervivencia disminuirá.

Al realizar este procedimiento, es importante ser consciente de su postura, relajar los hombros y mantener una buena posición de las manos. Además, desarrolle una rutina y coloque sus herramientas quirúrgicas y reactivos en el mismo lugar cada vez para que pueda mantener los ojos en el microscopio y mover las manos de manera automatizada.