De un solo paso de purificación de proteínas etiquetadas-Twin-Strep y sus complejos de Strep-Tactin resina reticulado con Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

Hola, soy Christina McKennan de la Universidad de Helsinki, Finlandia. Uno de los desafíos en la caracterización de un complejo proteico particular consiste en determinar su composición molecular. Esto requiere el desarrollo de métodos para aislar y purificar el complejo de su entorno celular.

El área de investigación en microbios es la interacción entre virus vegetales y sus huéspedes, por lo tanto estamos interesados en los diversos complejos de proteínas nucleares virales que se forman durante la infección. En el pasado, hemos estudiado con éxito estos complejos utilizando la purificación basada en afinidad al ducto en nuestras manos. El ducto de doble strep resultó ser uno de los mejores ductos.

Sin embargo, hemos observado ciertas limitaciones en su uso, una de ellas siendo el bajo rendimiento, por lo que deseamos mejorar este método. Hola, mi nombre es Mata y les guiaré a través del protocolo experimental. Pero primero, permítanme darles una visión general del método.

Utilizamos perlas macro prep de estreptavidina para purificar complejos específicos entre proteínas marcadas con doble etiqueta estrept y sus socios de unión fisiológicos. El tetrámero marcado con etiqueta estrept aparece en verde, la proteína marcada con doble etiqueta estrept en azul, su socio de unión en naranja y dos copias de la etiqueta estrept en rojo.

Las proteínas no unidas representadas como miedos de gracia se eliminan mediante lavados en el enfoque canónico. Los complejos unidos se eluyen competitivamente con biotina mostrada en rosa. Sin embargo, al utilizar este enfoque, observamos una elución incompleta de los complejos unidos, con solo una fracción desprendiéndose exitosamente de las perlas de estreptavidina.

Esto da como resultado una baja recuperación de la proteína diana. Para complicar cualquier análisis posterior, la recuperación de la proteína diana puede mejorarse mediante la elución desnaturalizante con S-D-S-S-D-S. Se forman células Miss alrededor de la proteína señal doble con etiqueta twin strep desnaturalizada.

Su pareja de unión y alrededor de los monómeros disociados de estreptactina. La contaminación resultante de la muestra con estreptactina liberada es inaceptable si la muestra debe analizarse posteriormente mediante espectrometría de masas. Para superar el problema de contaminación de la muestra, desarrollamos un método mediante el cual el tetrámero de estreptacina se estabiliza primero mediante entrecruzamiento químico.

La resina reticulada resultante se utiliza para purificar la proteína cebo y su pareja de unión; la elución de la muestra con SDS garantiza una alta recuperación de proteína, mientras que la reticulación química de la resina asegura la elución de la proteína cebo marcada con strept y su pareja de unión en ausencia de contaminación de la muestra con strept liberado. Equilibre un tubo micro sellado sin salida. Conteniendo dos miligramos de agente reticulante BS tres a temperatura ambiente.

Prepare un puntero de pipeta para la transferencia de resina cortando el extremo del puntero para reutilizarlo. Reuspenda la resina strep tact y macro prep mediante agitación breve y vigorosa, y transfiera inmediatamente 600 microlitros de la suspensión a una columna centrífuga CoStar SpinX. Centrifugue a 4.000 RPM durante 30 segundos. A temperatura ambiente, agregue 450 microlitros de solución salina tamponada con fosfato. El propósito de este paso es reemplazar la trisamina primaria con fosfato no reactivo.

Deseche el flujo pasante. Mezcle el contenido invirtiendo el tubo varias veces. Repita las etapas de centrifugación y lavado dos veces y deje la resina en 430 microlitros de P-B-S-P-H ocho.

Después de la última centrifugación, perfore la lámina de aluminio del microtubo no way con la punta de una pipeta que contiene 100 microlitros de agua milli Q. Disuelva el polvo de BS three en agua pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Una vez que el BS three esté completamente disuelto, agregue inmediatamente 20 microlitros de la solución a la columna spin X. Asegúrese de que los contenidos se mezclen adecuadamente.

Gire la columna durante 30 minutos a temperatura ambiente, asegurándose de que la resina se mezcle adecuadamente con la solución de BS tres. Para detener la reacción, agregue seis microlitros de triss tres molar ajustado a pH 7,5 con ácido clorhídrico. Gire la columna otros 15 minutos a temperatura ambiente y centrifugue a 4.000 RPM durante 30 segundos.

A temperatura ambiente, reuspenda la resina reticulada en 450 microlitros de solución salina tamponada con tris con tween 20 y deseche el flujo que atraviesa. Repita las etapas de centrifugación y lavado otras dos veces. En el último paso, resuspenda la resina en 450 microlitros de TBS. Transfiera la suspensión de resina a un tubo nuevo, resuspenda la resina que queda en la columna con otros 450 microlitros de TBS y transfiera al mismo tubo.

Repita el último paso una vez más para asegurar la transferencia máxima de la resina desde la columna al tubo. Deje reposar el tubo con la suspensión de resina durante 10 minutos a temperatura ambiente y ajuste el volumen a 600 microlitros. Al eliminar el exceso de TBS, la resina queda lista para su uso inmediato o puede almacenarse a cuatro grados Celsius sin congelación.

Este método es adecuado para la purificación de cualquier proteína de fusión marcada con doble etiqueta Strep y sus complejos asociados. La proteína puede ser de origen animal, vegetal o bacteriano, y puede aislarse bien del lisado celular total o de una fracción organular enriquecida. En este ejemplo, aislamos una proteína con doble etiqueta Strep, VPG Pro del virus A de la papa, a partir de la fracción nuclear de plantas infectadas con el virus, comenzando por centrifugar un mililitro de la muestra de la proteína cebo en tampón de unión a 13.000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo para minimizar la unión de proteínas biotiniladas endógenas al strep tact y a la resina. Añada avadon hasta una concentración final de 100 microgramos por mililitro, asegurándose de que los componentes se mezclen completamente. Incube en rotación durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.

Re-suspender la resina reticulada mediante vortex y, utilizando una punta de pipeta tipo copa, añadir inmediatamente 50 microlitros de la suspensión de resina al tubo que contiene la muestra de proteína cebo. Rotar durante otros 30 minutos a cuatro grados Celsius mientras se espera. Ajustar el mezclador térmico a 55 grados Celsius y precalentar 500 microlitros de tampón de elución para su uso en el paso de elución; centrifugar a 2000 RPM durante un minuto a cuatro grados Celsius.

Deseche el sobrenadante y lave la resina con un mililitro de tampón de lavado previamente enfriado. Paso uno, rote durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Repita los pasos de centrifugación y lavado tres veces en el último paso.

Re-suspender la resina en 250 microlitros de tampón de lavado número dos y transferir la suspensión de resina a una columna spinx nueva. Re-suspender la resina que queda en el tubo en otros 250 microlitros de tampón de lavado número dos y transferirla a la misma columna. Centrifugar a 2000 RPM durante tres minutos a cuatro grados Celsius. Transferir la columna a un tubo dolphin nose de dos mililitros nuevo y desechar el flujo atravesante.

Proceda inmediatamente al siguiente paso de elución. Añada 150 microlitros de tampón de elución precalentado a la columna spinx. Incube la solución en el mezclador térmico durante cinco minutos a 55 grados Celsius, agitando a 1400 RPM, luego centrifugue a 4.000 RPM durante un minuto a temperatura ambiente y deseche la columna.

Las proteínas diana purificadas ya están listas para un análisis adicional y se pueden almacenar por debajo de menos 20 grados Celsius. La imagen demuestra que la elución de proteínas a partir de la resina strept actin macro prep con biotina es incompleta en comparación con la elución con SDS. La diferencia en las intensidades de señal del inmunotransferencia refleja distintos rendimientos proteicos obtenidos con las dos técnicas de elución. Aunque la elución con SDS es mucho más eficiente que la elución con biotina, provoca contaminación de la muestra con strept actin liberada.

La imagen muestra un gel teñido con plata de las EIT de SDS procedentes de la resina Strept actin Macro prep. Obsérvese la presencia de strept actin liberada en la banda izquierda, pero su ausencia en la banda derecha. La muestra de la izquierda se eluyó a partir de la resina no entrecruzada, y la muestra de la derecha, a partir de la resina entrecruzada con BS tres. En base a estos resultados, concluimos que el entrecruzamiento con BS tres evita la liberación de strept actin a partir de la resina durante la elución con SDS.

En este ejemplo, utilizamos resina Strept actin macro prep entrecruzada con BS tres para purificar la proteína cebo VPG PRO y sus proteínas asociadas. Se sometió una alícuota de la muestra purificada a análisis por espectrometría de masas para la identificación de proteínas. La ausencia de una banda específica en el control negativo confirma la especificidad del ensayo de inmovilización.

La banda inferior corresponde a la proteína cebo VPG PRO y la banda superior a su pareja de unión NIB replicada identificada mediante espectrometría de masas. Hola, acabamos de mostrarle cómo el entrecruzamiento químico puede utilizarse para superar las limitaciones asociadas con Dena y la ilusión de la resina strep tact. Además de la purificación de complejos proteína-proteína, el método también puede usarse para purificar complejos proteicos con ácidos nucleicos, incluidos aquellos entrecruzados inversamente con formaldehído.

Finalmente, el método puede utilizarse para purificar proteínas de membrana strep tech. Solubilizadas con detergentes. Se necesitan detergentes para mantener estas proteínas hidrofóbicas en solución.

Sin embargo, su presencia puede provocar contaminación de la muestra con la liberación de strep tane. Incluso cuando se utiliza una evolución suave de biotina, consideramos que la reticulación de la resina podría proporcionar una solución al problema de contaminación de la muestra. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos. Vale.