Name: De un solo paso de purificación de proteínas etiquetadas-Twin-Strep y sus complejos de Strep-Tactin resina reticulado con Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Aprende a purificar proteínas con etiqueta Twin-Strep y sus complejos usando resina de Strep-Tactin reticulada con BS3. Este método mejora el rendimiento y pureza para análisis por espectrometría de masas.

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Agradecemos el apoyo técnico de Sini Miettinen, Minna Pöllänen y Taru Rautavesi. Agradecemos Helka Nurkkala para proporcionar células HEK 293 que expresan de etiquetado doble Strep GFP y Pekka Evijärvi para el suministro de equipos de grabación de sonido. Este trabajo fue financiado por la Academia de Finlandia, conceder los números 138329, 134684 y 258978.

1. La reticulación de Strep-Tactin polimetacrilato de resina con Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) <ol><li> Equilibrar un microtubo sellado que contiene 2 mg de BS3 agente de reticulación a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: BS3 es una sustancia peligrosa. Utilice guantes y gafas protectoras. </li><li> Resina de polimetacrilato Resuspender Strep-Tactin (suspensión al 50% en 100 mM de Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM; NaCl 150 mM) mediante una breve agitación vigorosa y transferir inmediatamente 600 l de la suspensión a una columna de centrifugación usando una punta de pipeta con la extremo cortado. </li><li> Centrifugar a 1500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Desechar el flujo a través y añadir 450 l de tampón fosfato salino (PBS) a la columna. </li><li> Repita el paso anterior 2 veces más para reemplazar completamente el tampón Tris con PBS y dejar la resina en 430 l de PBS, ajustada a pH 8,0 después de la última centrifugación. </li><li> Perfore el papel aluminio de la microtubo con BS3 con una punta de pipeta que contiene 1001; l de agua ultrapura. Disuelva el polvo en agua BS3 pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y añadir inmediatamente 20 l de la solución a la columna de centrifugación. La concentración final de BS3 en la reacción de reticulación es de ~ 1,2 mM. </li><li> Girar la columna durante 30 min a temperatura ambiente. Compruebe que la resina se mezcla adecuadamente con la solución de BS3. </li><li> Para interrumpir la reacción, añadir 6 l de 3M Tris-HCl, pH 7,5 y girar la columna durante otros 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a 1500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Desechar el flujo a través y resuspender la resina reticulada en 450 l de solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST). Repetir la centrifugación y etapas de lavado dos veces más. En el último paso, resuspender la resina en 450 l de TBS. </li><li> Transferir la suspensión de resina a un tubo nuevo usando una punta de pipeta con el extremo cortado. Resuspender la resina que queda en la columna con otros 450 l de TBS y transferir al mismo tubo. Repita ªe último paso una vez más para asegurar la transferencia máxima de la resina de la columna al tubo. </li><li> Deje que el tubo de reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente y ajustar el volumen a 600 l, eliminando el exceso de TBS. La resina está lista para su uso inmediato (recomendado) o se puede almacenar a 4 ° C, sin congelar. </li></ol> 2. Unión de la proteína cebo etiquetados-Twin-Strep y Associated Complejos para el reticulado Strep-Tactin Polimetacrilato Resina <ol><li> Centrifugar 1 ml de la muestra de proteína cebo en tampón de unión a 17000 xg durante 10 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. </li><li> Para minimizar la unión de proteínas biotiniladas endógenos a la resina de Strep-Tactin, añadir avidina a una concentración final de 100 mg / ml y girar durante 15 minutos a 4 ° C. <ol><li> Si la resina reticulada de la etapa 1.10 ha sido almacenado durante un período prolongado de tiempo a 4 ° C, recoger la resina por centrifugación a 400 xg FOR 1 min a 4 ° C, descartar el sobrenadante y lavar la resina con 1 ml de TBST. Repetir la centrifugación y etapas de lavado dos veces más, primero con TBST y después con TBS. Centrifugar el tubo a 400 xg durante 1 min a 4 ° C y ajustar hasta el volumen original mediante la eliminación de exceso de TBS. </li></ol></li><li> Resuspender la resina Strep-Tactin reticulado mediante agitación. Inmediatamente después, añadir 50 l de la suspensión de resina al tubo que contiene la muestra de proteína cebo usando una punta de pipeta de corte y girar durante otros 30 min a 4 ° C. </li><li> Mientras espera, establecer termomezclador a 55 ° C y precalentar 500 l de tampón de elución para el uso en el paso 3.1. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar la resina en un aparato rotatorio durante 5 min a 4 ° C con 1 ml de pre-refrigerada tampón de lavado # 1. Repetir la centrifugación y etapas de lavado tres veces. En el último paso, resuspender la resina en 250 l de tampón de lavado # 2. </li><li> Tr<html> ansfer la suspensión de resina a una columna de giro fresco. Resuspender la resina que queda en el tubo en otros 250 l de tampón de lavado # 2 y transferir a la misma columna. </li><li> Se centrifuga a 400 g durante 3 min a 4 ° C, desechar el flujo a través y la transferencia de la columna a un tubo ml delfines nariz 2 fresco. Proceda inmediatamente a la etapa de elución a continuación. </li></ol> 3. La elución de los complejos de proteínas específicas <ol><li> Añadir 150 l de tampón de elución precalentado desde el paso 2.4 a la columna de centrifugación. </li><li> Incubar en termomezclador durante 5 min a 55 ° C, agitando a 1400 rpm. </li><li> Centrifugar a 1500 xg durante 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Deseche la columna y almacenar las proteínas diana purificadas a ≤ -20 ° C. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598"><tbody><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tampón fosfato salino (PBS) </td></tr>0 &quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Na 2 HPO 4 </td><td style="width:299px;"> 10 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> KH 2 PO 4 </td><td style="width:299px;"> 2 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 137 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> KCl </td><td style="width:299px;"> 2,7 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> pH ajustado a 7,4 a menos que se indique lo contrario (de pH 8,0 en la sección 1.4) </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Solución salina tamponada con Tris (TBS) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 7,4 </td><td style="width:299px;"> 50 mM </td></tr><tr height="20"><td hei<html> ght = estilo &quot;20&quot; = &quot;altura: 20px; ancho: 299px;&quot;&gt; NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tris amortiguada salina con Tween 20 (TBST) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 7,4 </td><td style="width:299px;"> 50 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> De Tween 20 </td><td style="width:299px;"> 0,1% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> El tampón de unión </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td>x &quot;&gt; 550 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaF </td><td style="width:299px;"> 5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0,5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Glicerol </td><td style="width:299px;"> 10% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0,1 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tampón de lavado # 1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 500 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaF </<html> td&gt; <td style="width:299px;"> 5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0,4 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Igepal CA-630 </td><td style="width:299px;"> 0,2% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Glicerol </td><td style="width:299px;"> 5% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0,1 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tampón de lavado # 2 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mM </td></tr><tr height="20">2 &quot;height =&quot; &quot;style =&quot; 20 altura: 20px; ancho: 597px; &quot;&gt; Tampón de elución </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:299px;"> SDS </td><td style="width:299px;"> 1% (w / v) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tampones utilizados en el presente estudio.

<ol><li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li>
<li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li>
<li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li>
<li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li>
<li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li>
<li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+biochemical+characterization%2C+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li>
<li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+from+an+affinity+column%3A+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li>
<li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li>
<li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li>
<li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li>
<li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63(2011).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45(2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo anterior se puede utilizar para purificar cualquier proteína cebo de etiquetado de doble Strep de interés y sus complejos asociados en cualquier tampón adecuado que no contiene biotina o desnaturalizantes fuertes. En la versión actual del protocolo, de unión y lavado se llevan a cabo bajo condiciones relativamente estrictas en presencia de altas concentraciones de sal y detergente no iónico. Aunque esto da como resultado en menos de fondo, los complejos de proteínas frágiles pueden disociarse bajo estas con...

En los últimos años, la tecnología Strep-tag ha sido ampliamente utilizado en muchas áreas de la investigación biomédica, incluida la proteómica y la biología estructural. Esta tecnología de purificación de proteínas, que se basa en la fusión de proteínas recombinantes a un péptido Strep-tag corto, ha madurado con el advenimiento de matrices de afinidad que llevan Strep-Tactin, una variante modificada genéticamente de la estreptavidina con la mejora de la capacidad de unión al péptido. 1, 2 Las proteínas de fusión que contienen dos copias de Strep-tag II, designado twin-Strep-tag o SIII-tag, muestran una mayor afinidad por matrices Strep-Tactin que las que contienen sólo un único Strep-tag, asegurando la purificación más eficiente de las proteínas recombinantes y sus parejas de unión asociados. Sin embargo, la mayor afinidad de las proteínas marcadas con doble Strep a Strep-Tactin también tiene su lado negativo. Elución competitiva de estas proteínas con el exceso de biotina puede ser incompleta, lo que lleva a la disminución de la producción de proteína objetivo. Una mmineral eficiente alternativa es elución con SDS, pero conduce a contaminación de la muestra no deseado con Strep-Tactin liberado de la resina, por lo que el ensayo incompatible con el análisis proteómico. Este trabajo presenta una técnica para superar esta limitación por primera estabilizar el tetrámero unido a resina de Strep-Tactin por entrecruzamiento químico y luego utilizando SDS para eluir proteínas etiquetadas-twin-Strep y sus complejos asociados de la resina reticulada resultante. Por lo tanto, suficiente rendimiento de proteína se puede lograr sin contaminación de la muestra con Strep-Tactin, permitiendo de este modo su posterior análisis por espectrometría de masas. El método es adecuado para la purificación de cualquier proteína de fusión recombinante con una SIII-tag expuesto a la superficie 3 o twin-Strep-tag (secuencia de aminoácidos WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK y SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectivamente). La proteína puede ser de origen animal, vegetal o bacteriana y puede ser aislado a partir de ya sea total de célulaslisado o fracción enriquecida orgánulo. Como un ejemplo, se describe aquí la purificación de una proteína-SIII etiquetado VPg-Pro de la patata de virus A (PVA) 4 de la fracción nuclear de plantas de Nicotiana benthamiana infectadas por el PVA. La fracción nuclear se aisló tal como se describe anteriormente 5, con las siguientes modificaciones: las células no fueron tratados con formaldehído, butirato de sodio fue sustituido en todos los tampones con fluoruro de sodio 5 mM, inhibidor de proteasa completo fue sustituido con PMSF, Triton X-100 en la extracción de concentración tampón # 2 se redujo a 0,3% (v / v) y el sedimento nuclear obtenido por centrifugación a través de colchón de sacarosa (tampón de extracción # 3) se resuspendió en 1,45 ml de tampón de unión enfriado previamente y se hace girar durante 1,5 horas a 4 ° C. El extracto nuclear resultante que contiene la proteína cebo-etiquetados SIII y complejos asociados (muestra cebo de proteína) se procesó de acuerdo con el protocolo descrito a continuación (véase la sección 2).

<table><tbody><tr><td>Bis(sulfosuccinimidilo) suberado (BS3), formato sin pesar, 8 x 2 mg</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>21585</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com ATENCIÓN: Sustancia peligrosa. Causa irritación grave de las vías respiratorias, la piel y los ojos. Use guantes protectores y protección para los ojos.</a></td></tr><tr><td>Resina Strep-Tactin MacroPrep (50% de suspensión)</td><td>IBA</td><td>2-1505</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr><tr><td>Filtro de tubo de centrífuga Spin-X, membrana de acetato de celulosa, tamaño de poro 0.45 &mu; m, no estéril</td><td>Costar (Corning)</td><td>8163</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Tubos nariz de delfín</td><td>Costar (Corning)</td><td>3213</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Avidin&nbsp;</td><td>IBA</td><td>2-0204</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr></tbody></table>

de un solo paso de purificación de proteínas etiquetadas-twin-strep y sus complejos de strep-tactin resina reticulado con bis (sulfosuccinimidil) suberato (bs3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

La purificación por afinidad de proteínas de fusión Strep-etiquetados en resinas que llevan una estreptavidina de ingeniería (Strep-Tactin) se ha convertido en un método ampliamente utilizado para el aislamiento de complejos de proteínas en condiciones fisiológicas. Las proteínas de fusión que contienen dos copias de Strep-tag II, designado doble-Strep-tag o SIII-etiqueta, tienen la ventaja de una mayor afinidad por Strep-Tactin en comparación con los que contienen sólo un único marcador Strep, permitiendo de este modo la purificación de proteínas más eficiente. Sin embargo, esta ventaja se ve compensada por el hecho de que la elución de las proteínas marcadas con doble Strep con biotina puede ser incompleta, lo que lleva a la recuperación baja en proteínas. La recuperación se puede mejorar drásticamente mediante el uso de elución desnaturalizante con dodecil sulfato de sodio (SDS), pero esto conduce a la contaminación de la muestra con Strep-Tactin liberado de la resina, por lo que el ensayo incompatible con el análisis proteómico de aguas abajo. Para superar esta limitación, se ha desarrollado un método por el cual tetrámero acoplado a la resina de Strep-Tactinprimero se estabiliza mediante la reticulación covalente con bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) y la resina reticulada resultante se utiliza a continuación para purificar los complejos de proteína diana en una única etapa de purificación por lotes. Elución eficiente con SDS asegura una buena recuperación de proteína, mientras que la ausencia de contaminación de Strep-Tactin permite el análisis de proteínas aguas abajo por espectrometría de masas. Como una prueba de concepto, se describe aquí un protocolo para la purificación de la proteína viral SIII etiquetada VPg-Pro a partir de núcleos de N. infectados por el virus benthamiana plantas utilizando la resina de polimetacrilato de Strep-Tactin reticulado con BS3. El mismo protocolo se puede utilizar para purificar cualquier proteína marcada-Strep-gemelo de interés y caracterizar sus parejas de unión fisiológicos.

El procedimiento de purificación se ilustra esquemáticamente en la Figura 1, junto con una representación de los problemas asociados con otros métodos de purificación existentes. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1. Representación esquemática del procedimiento de purificación. El flujo de trabajo incluye la estabilización de Strep-Ta...

Se describe un método para la purificación eficiente de proteínas de fusión doble-Strep-etiquetados y sus complejos específicos sobre estreptavidina modificada (Strep-Tactin) de resina covalentemente reticulado con bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). El método tiene las ventajas de velocidad rápida, buena recuperación proteína diana y alta pureza, y es compatible con el análisis posterior por espectrometría de masas.

De un solo paso de purificación de proteínas etiquetadas-Twin-Strep y sus complejos de Strep-Tactin resina reticulado con Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Hola, soy Christina McKennan de la Universidad de Helsinki, Finlandia. Uno de los desafíos en la caracterización de un complejo proteico particular consiste en determinar su composición molecular. Esto requiere el desarrollo de métodos para aislar y purificar el complejo de su entorno celular.El área de investigación en microbios es la interacción entre virus vegetales y sus huéspedes, por lo tanto estamos interesados en los diversos complejos de proteínas nucleares virales que se forman durante la infección. En el pasado, hemos estudiado con éxito estos complejos utilizando la purificación basada en afinidad al ducto en nuestras manos. El ducto de doble strep resultó ser uno de los mejores ductos.Sin embargo, hemos observado ciertas limitaciones en su uso, una de ellas siendo el bajo rendimiento, por lo que deseamos mejorar este método. Hola, mi nombre es Mata y les guiaré a través del protocolo experimental. Pero primero, permítanme darles una visión general del método.Utilizamos perlas macro prep de estreptavidina para purificar complejos específicos entre proteínas marcadas con doble etiqueta estrept y sus socios de unión fisiológicos. El tetrámero marcado con etiqueta estrept

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Un novedoso y de alta eficiencia de dos pasos de cromatografía de afinidad protocolo ha sido desarrollado y es descrito en detalle. El método se basa en una etiqueta pequeña con dos purificación afinidades inherentes y es aplicable a una amplia gama de proteínas diana con diferentes propiedades.

Purificación de proteínas ortogonales Facilitado por un marcador de afinidad biespecíficos pequeños

Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Fuente: Murata, T., et al. Purificación de una proteína de alta masa molecular en Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra un procedimiento paso a paso para la purificación de una proteína marcada con polihistidina secretada por Streptococcus mutans.

Un procedimiento para la purificación de una proteína marcada con polihistidina de Streptococcus mutans

Este video muestra la purificación por afinidad en tándem, una técnica para purificar complejos de proteínas de células eucariotas para estudiar la interacción proteína-proteína. El complejo contiene dos proteínas marcadas con diferentes etiquetas de epítopos. Tras la purificación del complejo utilizando dos resinas con afinidad por las dos marcas diferentes de forma secuencial, la presencia de ambas proteínas en el eluido confirma la interacción entre ambas.

Ensayo de purificación de afinidad en tándem para estudiar las interacciones proteína-proteína

El método de Purificación por Afinidad en Tándem (TAP) se ha utilizado ampliamente para aislar complejos nativos de extractos celulares, principalmente eucariotas, para proteómica. Aquí, presentamos un protocolo de método TAP optimizado para la purificación de complejos nativos para estudios estructurales.

Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Describimos aquí un novedoso, robusto y eficiente método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para la expresión, aislamiento y caracterización de complejos de proteínas de células eucariotas. Este protocolo podría utilizarse para la caracterización bioquímica de complejos discretos, así como para la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función.

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

Aquí se describe un método simple para la purificación de un producto genético en Streptococcus mutans. Esta técnica puede ser ventajosa en la purificación de proteínas, especialmente proteínas de membrana y proteínas de alta masa molecular, y se puede utilizar con varias otras especies bacterianas.

Purificación de una proteína de masa molecular alta en Streptococcus mutans

La reconstitución in vitro de proteínas citoesqueléticas es una herramienta vital para comprender las propiedades funcionales básicas de estas proteínas. El presente artículo describe un protocolo para purificar y evaluar la calidad de los complejos de septina recombinantes, que desempeñan un papel central en la división y migración celular.

Purificación y control de calidad de complejos de septina recombinante para la reconstitución libre de células

Aprende a purificar proteínas con etiqueta Twin-Strep y sus complejos usando resina de Strep-Tactin reticulada con BS3. Este método mejora el rendimiento y pureza para análisis por espectrometría de masas.

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