En Vitro agregación ensayos usando hiperfosforilada proteína tau

El objetivo general de este procedimiento es monitorear y comparar la cinética de agregación de especies de proteína tau no modificadas e hiperfosforiladas. Esto se logra generando primero proteína tau no modificada e hiperfosforilada por el sistema de catalizador asistido por cremalleras. El segundo paso es configurar los ensayos de agregación para que sean adecuados para cualquiera de los dos instrumentos diferentes.

El proceso de agregación de tau se controla mediante la fluorescencia de dos tio diferentes. La flavina muere, la de la flavina S y la de la flavina T. El paso final es trazar y comparar las curvas de agregación. En última instancia, los cambios cinéticos de la fluorescencia de la tioflavina de la unión a las especies de TA agregadas se utilizan para mostrar el aumento dependiente de la hiperfosforilación de la fibrilación de tau in vitro.

Hola. Bienvenido a nuestro artículo JOV. Ensayos de agregación in vitro con proteína hiperfosfo-tau. Mi nombre es Minko, y los experimentos se llevarán a cabo y se demostrarán de manera incidental.

Y para este protocolo, un búfer de agregación razonablemente fresco realizado en el último mes. Justo antes de su uso, agregue DIO tres etol a un milimolar, también se requiere un té de Theo Flavin filtrado o una solución madre de S. Solución madre Hein, almacenable a menos 20 grados centígrados y proteína de toalla almacenada a menos 80 grados centígrados.

Tire de la toalla sobre hielo, luego ajuste su concentración usando el tampón de agregación según sea necesario para obtener consistencia. Gire la toalla con tampón de agregación y 20,800 G durante 10 minutos de cuatro grados centígrados. Ahora transfiera el supinato a otro tubo y manténgalo en hielo hasta que sea el momento de ensamblar la reacción de agregación.

Configure la mezcla de agregación en micro tubos centri de 1,5 mililitros. Según la tabla, 100 microlitros son suficientes para una alícuota de reactivos. Calcule el volumen total en función del número de reacciones y auméntelo en un 10 % para tener en cuenta los errores de pipeteo.

La pimienta puede ser reemplazada por ácido raónico o tampón de agregación si es necesario. Mezclar las reacciones por inversión y trasladarlas a 37 grados centígrados sin vegetación. Después de cada 24 horas, reponga las reacciones con un milimolar suplementario de DTT para garantizar un entorno reductor para medir la fluorescencia.

Caliente el fluorímetro Spectra durante unos 10 minutos. Esto mejorará la consistencia de las mediciones en el software de la computadora. Seleccione el modo de visualización en tiempo real que se encuentra en el centro de control de instrumentos.

Establezca la longitud de onda de excitación en 450 nanómetros con la rendija en dos nanómetros y establezca la longitud de onda de emisión en 510 nanómetros con la rendija de cinco nanómetros. Luego regrese al centro de control del instrumento y elija el análisis de longitud de onda constante. Presione la tecla agregar en el marco superior para agregar un conjunto de longitudes de onda.

Establezca los parámetros de adquisición del error estándar en uno y los ensayos máximos en tres. A continuación, haga clic en Agregar. A continuación, haga clic en ir para abrir la ventana de visualización de datos.

Ahora, en la ventana de visualización de datos, haga clic en iniciar acto para abrir el cuadro de diálogo de nueva muestra y elija desconocido para el tipo de muestra. A continuación, prepare las reacciones para tomar medidas por cada 100 microlitros a 98. Microlitros de tampón de agregación, y dos microlitros de tres milimolares de flavina S o T pipetear la mezcla varias veces para asegurar una buena mezcla.

Transfiera los 200 microlitros de una mezcla a un FA de tres qve y cárguelo en su posición. Después de retirar la solución del vete, enjuáguela tres veces con agua destilada y séquela en una corriente de aire. Este ensayo incluye el colorante fluorescente en la reacción del aion, lo que permite mediciones continuas y se realiza mejor con un lector automático de placas de pocillo mate.

Un parámetro regular para también funciona está limitado por la velocidad de operación manual. Coloque la mezcla de agregación en una placa negra opaca de 96 pocillos. Con 360 microlitros de volumen de pocillo, 200 microlitros son suficientes para cada medición de punto de tiempo.

Mezcle bien cada reacción con el pipeteo. Incubar la placa de 96 pocillos a 37 grados centígrados y cada 24 horas añadir un milimolar suplementario de DTT para garantizar un entorno reductor en cada punto de tiempo. Para una medición, encienda el lector de microplacas multimodo y el ordenador con al menos 10 minutos de antelación en el software del ordenador.

Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados y seleccione el modo de intensidad de fluorescencia. Luego establezca la longitud de onda de excitación en 450 nanómetros y la longitud de onda de emisión en cinco y 10 nanómetros. Inserte la placa de 96 pocillos en el cajón y presione la tecla de lectura.

Después de tomar medidas, devuelva inmediatamente la placa a la incubadora antes de analizar los datos, el ensayo de modo continuo se puede realizar utilizando un espectrofotómetro compacto para este ensayo. Coloque la mezcla de agregación en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. 200 reacciones de microlitros son suficientes para medir un punto de tiempo.

Invierte los tubos para mezclar. Configure las reacciones a 37 grados centígrados o temperatura ambiente y agregue un milimolar suplementario de DTT cada 24 horas para tomar mediciones. Configure el urómetro y el software como se hizo para el ensayo terminal sin troquel.

Transfiera toda la mezcla a un veterinario y colóquela en el portamuestras en el compartimiento de muestras y cierre la tapa. Haga clic en ejecutar para recopilar los datos de fluorescencia en los intervalos de tiempo adecuados. Si este intervalo es corto, como 30 o 60 segundos, está bien dejar el Q vet en la máquina entre mediciones hasta que se alcance el último punto de tiempo.

Regrese la reacción de la veta a su tubo de muestra y devuelva el tubo a la incubadora cuando se haya completado. Inclinar el vete como se indicó anteriormente usando tau recombinante y P tal. Se establecieron dos protocolos diferentes para comparar la cinética de agregación de tau y p tal, aprovechando la fuerte emisión fluorescente de la flavina t y s al unirse a los agregados de proteínas amiloides, incluyendo tau y p tal, con o sin el colorante fluorescente.

En la reacción de agregación, hubo un aumento consistente de la agregación de tau por hiperfosforilación. Por lo general, la liga T y p tal aumentan rápidamente dentro de los primeros 30 minutos antes de una desaceleración significativa, incluida la de flavina. T en las reacciones de agregación causan un retraso significativo en la tasa de agregación.

Tanto Theof Flavian s como t se acercaron a una meseta después de reaccionar durante 160 minutos. Por otro lado, la bioflavina no causó una desaceleración apreciable de la agregación. Siguiendo este procedimiento, el sistema nervioso central adicional a las isoformas u otras proteínas propensas a la agregación en la neurodegeneración, como en la neurodegeneración, se puede realizar utilizando el ensayo para comprender la contribución de la proteinización en la patogénesis después de su desarrollo.

Esta técnica de preparación de una proteína PA superior de hiperfosfato forma para la investigación en el campo, numerosas enfermedades para explorar nuestras terapias y desarrollo de fármacos.