Un paso más allá de BRET: Fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE)
23 de mayo de 2014
La ampliación de la base y la aplicabilidad de la fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) mediante encuestas a los principios pertinentes y demostrar su compatibilidad con una gran variedad de fluoróforos y condiciones de anticuerpos dirigidos.
El objetivo general del siguiente experimento es demostrar la simplicidad del combustible y observar la generación de fotones rojos debida a eventos de emisión por excitación radiativa. Esto se logra combinando bacterias bioluminiscentes y nanopartículas luminiscentes para la producción de combustible. A continuación, se utiliza un lector de placas de bioluminiscencia para observar los fotones rojos resultantes que surgen del combustible; los resultados obtenidos muestran que se puede producir una cantidad considerable de fotones rojos cuando las bacterias bioluminiscentes y los puntos cuánticos se mantienen en la misma disolución.
Basado en el aumento observado en el flujo de fotones rojos, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la cuestionar el paradigma de la transferencia de entrada residencial NCE o Brett. Eso a menudo se reporta en la literatura a partir de colonias individuales. En placas de cultivo estándar, inicie cultivos nocturnos de bacterias luminiscentes.
Aquí, Vibrio Fisher Eye se utilizaron el día del experimento. Inicie subcultivos frescos y permita que progresen hasta alcanzar una densidad óptica o DO a 600 nanómetros de uno a 1,5. Utilice bacterias en estados de crecimiento similares, en los cuales producen señales intensas, para obtener resultados comparables.
Combine alícuotas de 100 microlitros de cada una con cinco microlitros del marcador fluorescente, QD 7 0 5 o solución salina fisiológica. Luego agregue la mezcla a 895 microlitros de solución salina fisiológica y a cubetas espectroscópicas estándar. Coloque las cubetas llenas en un imagenador de bioluminiscencia de animales completos y realice las mediciones con los conjuntos de filtros apropiados.
Aquí se utilizó el filtro de emisión de 710 a 730 nanómetros para realizar el combustible a diferentes distancias. Llene dos cubetas fotométricas de volumen reducido con 50 microlitros de QD 7 0 5 o con 97,2 microlitros de microesferas de poliestireno no fluorescentes de 48 nanómetros, en un volumen total de un mililitro de solución salina fisiológica. Esto garantiza un área superficial sólida similar por volumen total entre las dos entidades.
Prepare una fuente de luz qve encapsulando una tercera qve con cinta negra estándar u otro material opaco capaz de bloquear la luz. Prepare cuidadosamente dos ventanas ópticas idénticas en lados opuestos del vete. Añada un alícuota de un mililitro de Vibrio fii u otra cultura proveniente de un subcultivo fresco al vete de la fuente de luz y cúbralo con un material opaco como papel negro para reducir cualquier contaminación lumínica.
A continuación, coloque las cubetas previamente llenas directamente a cualquier lado de la fuente de luz vete en el dispositivo de imagen. Visualice los tres Q vets bajo los filtros de emisión apropiados, como los filtros de luz total y de emisión de 710 a 730 nanómetros, con tiempos de exposición de 10, 30 y 30 segundos, respectivamente. Adquiera una imagen de fluorescencia con excitación de 450 a 480 nanómetros y emisión de 710 a 730 nanómetros para validar la ubicación del QD 7 0 5.
Reposicione ambos Q vets externos a distancias equivalentes más grandes respecto al Q Vet Central. Luego, visualice y adquiera una imagen de fluorescencia antes de repetir este proceso nuevamente hasta alcanzar una distancia final cara a cara de tres centímetros. Llene dos cubetas de volumen reducido con soluciones de un mililitro que contengan, en una de ellas, un fluoro cuatro o una nanopartícula fluorescente de interés, y en la otra, solución salina fisiológica con nanopartículas no fluorescentes como control negativo.
Agregue una alícuota de un mililitro de Vibrio FII fresco u otras bacterias luminiscentes a un vial opacado con dos ventanas ópticas físicamente iguales situadas en lados opuestos; cubra el vial con una sustancia opaca, como un trozo de papel negro, a una distancia corta pero igual. Coloque los dos cubetas de volumen reducido a ambos lados del vial Q opacado y visualice con los filtros adecuados; aquí se utilizó una distancia de 0,7 centímetros. Repita el procedimiento con la otra fuerza de piso del qd 7 0 5 sobre las bacterias.
Se observa un aumento considerable en el número de fotones rojos en comparación con las bacterias solamente. El combustible de control puede ocurrir a largas distancias en ausencia de cualquier absorbedor. Esta dependencia de la distancia puede caracterizarse mediante la ley del inverso del cuadrado.
Para fuentes puntuales. La orientación de los flavonoides hacia la membrana bacteriana parece tener poco o ningún efecto sobre la cantidad total de señal de combustible generada. En este contexto, el combustible dirigido se mantiene incluso después de varios pasos de lavado.
Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo reconstituir combustible bajo múltiples modalidades como un medio para generar fotones rojos a partir de eventos de emisión por excitación radiativa.
Resumen
Este estudio explora la técnica de Fluorescencia mediante Excitación no Ligada a la Luminiscencia (FUEL), demostrando su compatibilidad con diversos fluoróforos y condiciones dirigidas por anticuerpos. El experimento muestra la generación de fotones rojos mediante la interacción de bacterias bioluminiscentes y nanopartículas luminiscentes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Técnicas de fluorescencia
- Bioluminiscencia
- Interacciones de nanopartículas
Antecedentes
- FUEL es una técnica de fluorescencia novedosa.
- Utiliza bacterias bioluminiscentes para la generación de fotones.
- La compatibilidad con diversos fluoróforos es fundamental para su aplicación.
- Comprender la generación de fotones puede tener un impacto en la investigación de fluorescencia.
Objetivo del estudio
- Mostrar la simplicidad de la técnica FUEL.
- Observar la generación de fotones rojos a partir de interacciones bioluminiscentes.
- Evaluar las implicaciones de FUEL en los paradigmas de fluorescencia existentes.
Métodos Utilizados
- Combinación de bacterias bioluminiscentes y nanopartículas luminiscentes.
- Uso de un lector de placas de bioluminiscencia para la medición de fotones.
- Preparación de soluciones con distancias variables para la observación de fotones.
- Visualización mediante filtros de emisión específicos para validar los resultados.
Resultados principales
- Se observó una producción sustancial de fotones rojos.
- Se caracterizó la dependencia de la generación de fotones con respecto a la distancia.
- Dirigir fluoróforos a las membranas bacterianas mostró un efecto mínimo sobre la señal.
- FUEL puede funcionar eficazmente a largas distancias sin absorbentes.
Conclusiones
- FUEL es una técnica prometedora para aplicaciones de fluorescencia.
- Desafía los paradigmas existentes en la investigación de fluorescencia.
- Una mayor exploración de FUEL puede mejorar los estudios de bioluminiscencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
FUEL amplía la distancia de trabajo de la excitación basada en luminiscencia más allá de los límites a escala nanométrica del BRET, permitiendo la generación de señales en rangos de micrómetros a centímetros sin necesidad de absorbentes. Esta capacidad cubre una brecha espacial crítica en la imagen molecular, apoyando aplicaciones en las que fallan los métodos tradicionales de transferencia de energía. Para la I+D en biofármacos, FUEL ofrece un enfoque escalable y compatible con etiquetas para explorar interacciones biológicas en estructuras celulares o tisulares más grandes, mejorando la validación de dianas en sistemas complejos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de interacciones moleculares a distancias inaccesibles para la BRET, apoyando la validación de dianas en contextos de biomarcadores escasos o difusos.
- Valor operativo: Utiliza una mezcla sencilla de fuentes bioluminiscentes y fluoróforos, reduciendo la complejidad del ensayo y permitiendo compatibilidad con alto rendimiento.
- Valor predictivo: Proporciona lecturas cuantitativas de fotones rojos que se correlacionan con la proximidad de las sondas, facilitando la identificación de compuestos iniciales y la reducción de riesgos mecanicistas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Compatible con diversos fluoróforos y nanopartículas, lo que permite un diseño de ensayo flexible para diversas clases de dianas.
- Valor operativo: La generación de señal persiste tras los pasos de lavado, lo que favorece una detección reproducible en muestras heterogéneas.
- Preparación del ensayo: Funciona en solución salina fisiológica estándar sin necesidad de tampones personalizados, facilitando su integración en plataformas de cribado existentes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la obtención de imágenes de muestras completas a distancias prolongadas, lo que facilita la extrapolación desde modelos in vitro hasta modelos in vivo.
- Alineamiento de Biomarcadores: FUEL dirigido por anticuerpos mantiene la señal tras la unión, permitiendo monitorear el acoplamiento específico al blanco en escalas espaciales más amplias.
- Mitigación de Riesgos: La señal dependiente de la distancia sigue la ley del cuadrado inverso, proporcionando un marco cuantitativo predecible para la comparación entre estudios.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
FUEL se integra en el continuo de descubrimiento desde la detección inicial de interacción con el blanco hasta la validación preclínica, especialmente en casos donde se requiere resolución espacial más allá de la proximidad molecular.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la localización de dianas y la formación de complejos en entornos celulares donde las sondas podrían no estar en contacto directo.
- Tamizaje: Permite la estandarización de ensayos mediante una señal de salida ajustable por distancia, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios.
- Análisis: Genera un flujo cuantificable de fotones rojos medible mediante imágenes de bioluminiscencia estándar, posibilitando el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traductiva: Conecta eventos de unión in vitro con la detección de señales a nivel tisular, apoyando la validación de biomarcadores en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Requiere únicamente una fuente bioluminiscente y un fluoróforo, lo que la convierte en una capacidad portátil y de bajo costo aplicable en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Amplía el rango espacial de los ensayos basados en luminiscencia, reduciendo los falsos negativos en objetivos de baja abundancia o distribuidos de forma difusa.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de conjugación molecular precisa o proximidad estrecha, simplificando la preparación de reactivos y reduciendo la variabilidad.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en las decisiones de avance o interrupción al permitir la detección de objetivos que escapan a los ensayos basados en BRET debido a limitaciones de distancia.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar una validación ortogonal del acoplamiento al objetivo en matrices biológicas complejas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere acceso a cultivos bacterianos bioluminiscentes o sistemas luminiscentes modificados genéticamente.
- Depende de equipos estándar de imagen de bioluminiscencia con filtros de emisión adecuados desplazados hacia el rojo (por ejemplo, 710–730 nm).
- Necesita optimización de la concentración de la sonda y de la intensidad de la fuente para evitar la saturación de la señal a distancias cortas.
- Debe tener en cuenta la ley de cuadrado inverso en la decadencia al interpretar la intensidad de la señal a diferentes distancias.
- Está limitado por la luminiscencia de fondo en muestras autofluorescentes o que dispersan la luz, lo que requiere controles adecuados.
