Name: Aip1p Dinámica se alteran por la R256H Mutación de actina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende a visualizar la dinámica de Aip1p en levaduras con actina mutante R256H mediante microscopía de fluorescencia por reflexión interna total. Este método permite estudiar cómo las mutaciones en actina alteran la función citoesquelética.

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Los autores agradecen a Peter Rubenstein útil para el debate y el asesoramiento técnico y David Pellman para el clon PB1996 originales. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación March of Dimes y la financiación del paseo para los niños.

1. La clonación en el plásmido PB1996 <ol><li> Crear y activar los cebadores de ADN de una compañía de fabricación de oligonucleótidos que flanquean la secuencia diana y contiene sitios de restricción únicos en el plásmido parental seleccionado. NOTA: En este caso, los cebadores fueron diseñados para amplificar los pares de bases 400 en el extremo 5 &#39;de la secuencia AIP1. El sitio de restricción XhoI fue incorporado en el cebador de aproximadamente 20 pares de bases antes de la secuencia AIP1, y XmaI se incluyó aproximadamente 20 pb después de la secuencia AIP1 objetivo. El plásmido utilizado para la clonación fue PB1996, que contiene una etiqueta 3XGFP para la fluorescencia, un gen para la selección URA cepa de levadura, y un gen de resistencia a ampicilina para la selección bacteriana. </li><li> Se purificó el ADN genómico a partir de una cepa haploide Ura-levadura. Nota: Consulte la Figura 1 para ver un diagrama del proceso de clonación. </li><li> Ejecutar una reacción de PCR estándar usando los dos cebadores y el ADN genómico de levadura para amplificar el gen Aip1p con los sitios de restricción en cualquiera de los dos esd. Se digiere el producto de PCR y el plásmido PB1996 con las enzimas de restricción en reacciones separadas por fabricante protocolos recomendados. En este caso XmaI y XhoI se utilizaron con el tampón adjunto a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Ejecutar un gel de electroforesis de agarosa al 0,8% para separar los fragmentos de ADN digeridos. En un pozo, cargar una escalera de masas de baja del ADN y, en pocillos separados, cargar toda la reacción de cada digestión. Correr el gel a 100 voltios durante aproximadamente 1 hora, hasta que el frente del colorante está cerca del final del gel. Visualizar el gel bajo una luz UV y purificar el segmento que corresponde al segmento de proteína y el plásmido cortado. </li><li> Se liga el segmento AIP1 digerido y el plásmido PB1996. Transformar el producto en células DH5a utilizando protocolos del fabricante (10 l de ADN con 100 células mu l para 30 min en hielo, choque térmico a 42 ° C durante 2 min, crecer en medio SOC durante 2 horas a 37 ° C) y la placa en placas de cultivo que incluyen el antibiótico para la selección, en este caso de LB +Placas Amp. Seleccionar y hacer crecer una colonia en cultivo líquido. Se purifica el plásmido de nuevo diseño. </li></ol> 2. Mutante Generación cepa de levadura <ol><li> Usar una cepa de levadura haploide en la que el alelo de actina ha sido borrada para construir una cepa de levadura mutante. Nota: En este caso, la cepa parental fue un generoso regalo del Dr. Peter Rubenstein (Universidad de Iowa) y la construcción fue descrito por Cook y otros 20 Esta cepa carece del gen de actina cromosómica y contiene un plásmido que codifica levadura de tipo salvaje. actina y uracilo. </li><li> Utilice el plásmido que codifica pRS levadura de tipo salvaje actina con un Trp + selección como el plásmido de base para la mutagénesis 21. </li><li> Lleve a cabo la mutagénesis dirigida en el plásmido pRS para diseñar la mutación sin sentido en la actina. <ol><li> Para la mutación R256H en la actina, que el cebador 5 &#39;ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3&#39; para cambiar la Arg 256 a su 256. Ejecutar una mutagénesis estándarReacción de PCR con el plásmido de la etapa 2.2. </li><li> Transformar el plásmido actina mutante de la PCR en células DH5a. Aislar el plásmido de ADN y la secuencia del gen de actina para verificar la mutación. </li></ol></li><li> Transformar el plásmido que codifica actina levadura mutante en la cepa de levadura haploides a partir del paso 2.1. </li><li> Cultivar las células transformadas sobre placas de Trp-para seleccionar para la levadura que contiene el Trp + que contiene el plásmido de levadura mutante actina. </li><li> Seleccionar las células que carecen de la plásmido original que codifica tipo silvestre actina y uracilo (descrito en el punto 2.1) por sub-cultivo de células de los Trp placas sobre placas que contienen 5-fluoroorótico ácido (5-FOA). 5-FOA se convierte a la forma tóxica, 5-fluoruracilo, en yeas cepas que expresan el gen URA3 funcional. Las células que crecen después de la selección por pasos contendrán sólo el plásmido mutante actina. </li><li> Se purificó el ADN plasmídico a partir de la nueva cepa de levadura. Secuenciar el plásmido para garantizar el gen actina mutante está presente. Utilizar este sentrenar en estudios posteriores. Este proceso se esquematiza en la Figura 2. </li></ol> 3. Transformar el plásmido en células de levadura <ol><li> Se digiere el plásmido Aip1p-GFP con una enzima de restricción para permitir la integración en el cromosoma de la levadura. NOTA: El sitio de restricción debe estar fuera del bloque de secuencia que contiene la etiqueta fluorescente, gen de interés, y marcador de selección. En este caso, utilice 1 l de enzima de restricción HpaI con 8 l de ADN y 1 l de 10x tampón acompaña durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Cultura S. células cerevisiae (de la Etapa 2.5) que son incapaces de sintetizar uracilo (URA-deformación) durante la noche en 5 ml en medio YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, y 2% de dextrosa) en una rueda a 30 º C. Centrifugar 1 ml de las células durante 5 min a 1000 x g. </li><li> Haga mezcla PLACA. Hacer 10XTE mediante la adición de 5 ml de Tris 1 M pH 7,5 y 2 ml de 250 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 43 ml de ddH 2 O. Añade 00,204 g de acetato de litio a 20 ml de 1XTE, a continuación, 8 g de polietilenglicol (PEG) (MW ~ 3300) y esterilizar filtro. </li><li> Decantar el sobrenadante de las células centrifugadas en el paso 3.2 y resuspender las células en el líquido restante. Para las células en suspensión, añadir 2 l de ADN portador testículos de salmón 10 mg / ml. Añadir 10 l de la ADN plásmido digerido del paso 3.1 y vórtice. Añadir 0,5 ml de la placa y el vórtice. Añadir 20 l de DTT 1 M y agitar. </li><li> Incubar la mezcla durante 6-8 horas a 25 ° C. Choque térmico de las células en un baño de agua a 42 ° C durante 10 min. La placa 100 l de células de la parte inferior del tubo de microcentrífuga de donde se han establecido a cabo sobre una placa-Ura. Se incuba a 30 ° C durante 2-3 días o hasta que se formen colonias. </li><li> Seleccione colonias individuales y consecutivas fuera sobre una placa de Ura. NOTA: Estas células contienen el plásmido con el gen AIP1-GFP y Ura integrado en el cromosoma, permitiendo el crecimiento. Estas células serán luego utilizados en microscópicapy. </li></ol> 4. Visualización del Movimiento Proteína Aip1p mediante la reflexión interna total de fluorescencia Microscopía <ol><li> Haga crecer un cultivo de las células de levadura con el incorporado Aip1p-GFP en YPD durante la noche en una rueda a 30 ° C. Subcultura 1 ml del cultivo durante la noche en 9 ml de Ura-medios de comunicación. Cultivar las células de un 3-4 h adicionales en un agitador a 30 ° C para asegurar que están en fase de crecimiento logarítmico. </li><li> Añadir 3 l de células a un portaobjetos de microscopio de vidrio y añadir un cubreobjetos. Permita que las células se asienten en el portaobjetos durante 5 minutos. Colocar el portaobjetos en el soporte de la placa de la platina. </li><li> Observar la proteína Aip1p-GFP con un total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopio (488 nm) utilizando un aceite de inmersión 100X TIRF objetivo y una cámara CCD digital. El uso de software SlideBook 5.0, obtener imágenes durante 20 segundos a una velocidad de 5 fotogramas / segundo (frames individuales de imágenes obtenidas se presentan en la Figura 2A). <ol><li> Para centrarse en la cells, software open SlideBook 5.0 y haga clic en el botón de enfoque Ventana en la barra de herramientas para acceder a los controles de enfoque. Seleccione la ficha Ámbito y seleccione el objetivo 100X-TIRF. Encender la lámpara y deslice la barra de la lámpara y el 15%. Cambie el ajuste de Bin para 2 x 2. Cambie el filtro de campo claro. </li><li> En el microscopio, use el dial de enfoque fino para que las células en el foco como se ve en la pantalla del ordenador. </li><li> Uso de los controles dentro de la ventana de enfoque, apagar la lámpara, cambie el filtro para vivir, y haga clic en el botón TIRFM. </li><li> En el iluminador TIRFM conectado al puerto lado derecho del microscopio, gire la emisión láser en On. </li><li> Seleccione la pestaña de corriente dentro de la ventana de enfoque, seleccione la casilla junto a Start Recording y luego haga clic en el botón de campo claro. </li><li> En el iluminador TIRFM, gire el micrómetro para ajustar el ángulo de incidencia del láser. Esto se utiliza para optimizar la emisión de fluorescencia de los focos AIP1-GFP y minimizar la fluorescencia de fondo de lacélulas y diapositivas. </li><li> Cuando aparezca la imagen deseada, pulse Iniciar. Después de 20 segundos, pulse Detener. Guarde las imágenes. En la ficha Archivo en la barra de menú principal, seleccione Guardar como y escriba Slide la ubicación del archivo y el nombre. </li></ol></li><li> Utilice el software ImageJ para analizar las imágenes. Utilice el plugin macro &quot;Rastreador Manual&quot; para rastrear el movimiento y el ritmo de los focos Aip1p fluorescente. Cambie el parámetro de intervalo de tiempo de 0,2 seg. <ol><li> Uso de la selección de pista complemento, seleccionar y realizar un seguimiento de una proteína fluorescente individual a través de siete y cincuenta y seis marcos conectivos. Utilice el comando pista final y la velocidad del movimiento de la proteína entre cada fotograma se mostrará en una ventana de resultados. </li><li> Determinar la tasa media entre cada fotograma utilizando una hoja de cálculo de Microsoft Excel. Utilice los valores para calcular la velocidad media del movimiento Aip1p para cada cepa de células de interés. NOTA: Un gráfico de dispersión de la velocidad de movimiento Aip1p y la velocidad no lineal promedio se muestra en la Figure 2B. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una estrategia eficaz para visualizar la dinámica del citoesqueleto y la utilidad en las investigaciones sobre mutaciones patógenas se ha descrito aquí. Modalidades avanzadas de imagen han creado nuevas oportunidades para comprender el movimiento intracelular de proteínas cerca de la membrana celular. Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) es una técnica sensible para los estudios funcionales en las células vivas. TIRF utiliza un láser de excitación en ángulo que crea un campo evanescente debido ...

La actina es la proteína dominante que comprende el citoesqueleto y participa en los procesos celulares críticos incluyendo la división celular, el movimiento de orgánulos, la motilidad celular, la contracción, y la señalización. Durante la última década, las mutaciones causantes de la enfermedad en la actina se han descubierto en cada una de las seis isoformas de actina humanos que conducen a una serie de trastornos, desde miopatías a la enfermedad arterial coronaria 1-7. Los procesos por los que las mutaciones de actina conducen a la enfermedad siguen se han dilucidado. El modelo de levadura sigue siendo el estándar de oro para estudiar los efectos bioquímicos de mutaciones en función de la actina debido a las ventajas de la isoforma única esencial actina, la tratabilidad genética y de alta conservación de secuencia de actina y la función. Los estudios demuestran que las mutaciones de actina individuales conducen a disfunciones específicas moleculares con efectos negativos dominantes 8. Por ejemplo, las mutaciones que causan la sordera en actina no muscular γ que afectan al resto de Lys-118 alteran la regulación porla proteína de unión actina Arp2 / 3 9. Los estudios emplean con frecuencia los análisis in vitro de la proteína: proteína interacciones. Las investigaciones sobre el efecto de la actina mutaciones en biología celular y, en particular, la localización de proteínas de unión de actina en la célula son limitados. Los estudios sobre el citoesqueleto de la levadura en vivo convencionalmente se basan en imágenes de las células fijas de un microscopio de fluorescencia invertido 10. Estos experimentos proporcionan datos fundamentales acerca de la morfología del citoesqueleto de actina. Las investigaciones han incorporado desde tres dimensiones de imagen confocal para visualizar la compleja red del citoesqueleto 11, 12. Esta formación de imágenes permite la cuantificación de la abundancia y la ubicación relativa de los parches de actina y filamentos. La tomografía de electrones sección delgada se ha utilizado para la imagen de la morfología de las redes densas filamentosos relativos a las estructuras subcelulares conservados 13. S celulares Crowdedpasos con una pequeña sección transversal se pueden examinar con gran detalle con esta técnica. Los estudios de imagen se han extendido a las células vivas mediante microscopía fluorescente lapso de tiempo. Cuando blanqueo foto y la fluorescencia de fondo pueden ser moderados, imagen de lapso de tiempo permite que las investigaciones sobre la dinámica de las proteínas del citoesqueleto y la respuesta a las condiciones ambientales 11, 14. Por separado, la visualización de la dinámica de los filamentos de actina in vitro se hizo avanzar por la introducción del total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía. En comparación con la microscopía de campo ancho, TIRF tiene la ventaja de la disminución de la fluorescencia de fondo y mejorar el contraste para supervisar filamentos individuales 15, 16. Con estas cualidades, la microscopía TIRF ha sido adaptado por los biólogos celulares para controlar las estructuras celulares en la membrana plasmática 17, 18. Eventos celulares, incluyendo los cambios en el citoesqueleto, puedevisualizar en tiempo real con una baja fototoxicidad, contraste máximo y el mínimo de fluorescencia de fondo 19. Para comprender mejor el efecto de las mutaciones de actina a la circulación, la localización y el volumen de negocios de proteínas del citoesqueleto de la célula, la microscopía TIRF y la proteína de etiquetado se utilizaron. En la presente memoria, se describen métodos para estudiar los efectos de una mutación clínicamente relevante en la actina en la dinámica del citoesqueleto en Saccharomyces cerevisiae. Específicamente, la localización y el movimiento de la proteína de unión a actina, Aip1p, se visualizaron y cuantificaron en células que expresan la mutación R256H en actina. Estas técnicas se complementan en los estudios bioquímicos in vitro y permiten una mayor comprensión de las interacciones de proteínas y funciones.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>rpi</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Amresco</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Change-IT Mutación múltiple Kit de mutación dirigida</td> dirigida <td>al sitio USB Corporation 4166059</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB B7204S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN, monocatenario de testículos de salmón</td><td>Sigma</td><td>9007-49-2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>93302</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td>¡Advertencia! Irritación dañina</td></tr><tr><td>Kit de ADN fúngico/bacteriano</td><td>Symo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>HpaI</td><td>NEB</td><td>R0105S</td> Acetato de <td></td></tr><tr><td>litio</td><td>AlfaAesar</td><td>6108-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de baja masa de ADN</td><td>Invitrogen</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>NE Buffer #4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>12532-016</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Cualquier kit funcionará</td></tr><tr><td>Kit de Ligadura Rápida</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>rpi</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel y sistema de limpieza de PCR</td><td>Promega</td><td>1/6/2015</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>YPD medios</td><td>LabExpress</td><td>3011-URA</td><td></td></tr> <tr><td>Media</td><td>LabExpress</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>PCR Machine</td><td>Invitrogen 4359659</td><td></td><td>Cualquier máquina de PCR funcionará</td></tr><tr><td>Microscopio TIRF</td><td>Olympus IX81</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu Cámara ORCA-R</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aip1p dinámica se alteran por la r256h mutación de actina

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Las mutaciones en actina causar una variedad de enfermedades humanas debido a los cambios moleculares específicos que a menudo alteran la función del citoesqueleto. En este estudio, las imágenes de marcado con fluorescencia proteínas utilizando fluorescencia interna total (TIRF) microscopía se utiliza para visualizar y cuantificar los cambios en la dinámica del citoesqueleto. Microscopía TIRF y el uso de etiquetas fluorescentes también permite para la cuantificación de los cambios en la dinámica del citoesqueleto causadas por mutaciones en actina. Usando esta técnica, la cuantificación de la función del citoesqueleto en células vivas complementa valiosamente en estudios in vitro de función de la proteína. Como un ejemplo, las mutaciones de sentido erróneo que afectan a la actina residuo R256 se han identificado en tres isoformas de actina humanos sugieren que este aminoácido desempeña un papel importante en la regulación de las interacciones. Los efectos de la mutación R256H actina en los movimientos del citoesqueleto se estudiaron utilizando el modelo de levadura. La proteína, AIP1, que se conoce para ayudar a la cofilina en despolimerización de la actina, eraetiquetados con la proteína fluorescente verde (GFP) en el extremo N-terminal y seguimiento in vivo utilizando microscopía TIRF. La velocidad de movimiento Aip1p en tanto de tipo salvaje y cepas mutantes se cuantificó. En células que expresan actina mutante R256H, Aip1p de movimiento está restringida y la tasa de movimiento es casi la mitad de la velocidad medida en las células de tipo salvaje (0,88 ± 0,30 m / seg en células R256H en comparación con 1,60 ± 0,42 m / seg en células de tipo salvaje, p &lt;0,005).

Un método para la imagen se presenta la dinámica de las proteínas del citoesqueleto en la célula. La proteína de unión a la actina, Aip1p, fue etiquetado con GFP. El diseño para el plásmido que codifica el producto etiquetado se muestra en la Figura 1. El plásmido se transformó en las células de levadura. Expresión de la Aip1p marcado con fluorescencia permite la visualización del comportamiento de la proteína en la célula. Aip1p normalmente se localiza en los parches de actina en los sitios de la endoc...

Mutaciones que causan enfermedades en actina pueden alterar la función del citoesqueleto. La dinámica del citoesqueleto son cuantificados a través de imágenes de las proteínas marcadas con fluorescencia utilizando microscopía de fluorescencia total interna. Como un ejemplo, la proteína del citoesqueleto, Aip1p, ha alterado la localización y el movimiento en las células que expresan la isoforma de actina mutante, R256H.

Aip1p Dinámica se alteran por la R256H Mutación de actina

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar el movimiento de la proteína de unión a la actina en levaduras que expresan una isoforma mutante de actina. Esto se logra primero mediante la elaboración de un plásmido y la clonación del gen de la proteína que interactúa con la actina, una o una P IP, marcado con una proteína fluorescente verde tres veces repetida Fluor cuatro. El segundo paso consiste en generar una cepa de levadura que exprese únicamente actina de tipo silvestre o mutante.A continuación, se transforma el plásmido GFP marcado A IP one P en la cepa salvaje o mutante de levadura. El paso final consiste en obtener imágenes y analizar el movimiento de A IP one P marcado en células de levadura salvajes y mutantes. En última instancia, reflexión interna total.Se utiliza microscopía de fluorescencia o microscopía de césped para demostrar que la A IP una P se mueve más lentamente en levaduras que expresan la actina mutante R 2 56 H en comparación con la actina de tipo salvaje. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del citoesqueleto, como los movimientos temporales relativos de las proteínas que se unen entre sí. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando descubrí que, a diferencia de la cepa de tipo salvaje, la eliminación de la A IP una P en la cepa de levadura mutante era letal.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía confocal es el contraste mejorado y la mayor velocidad de adquisición de imágenes. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades para optimizar los ajustes del microscopio para su experimento particular debido al gran número de ajustes posibles y a la naturaleza subjetiva de la calidad de la imagen. Comience este protocolo con la generación del plásmido A IP one PGFP y la cepa de levadura mutante según se indica en el protocolo escrito, y digiera el plásmido con una enzima de restricción para permitir su integración en el cromosoma de la levadura.Las células S-C-V-C-A preparadas que no pueden sintetizar uracilo se incuban durante la noche en cinco mililitros de medio YPD en un agitador a 30 grados Celsius. Centrifugar un mililitro de las células durante cinco minutos a 1000 veces g. A continuación, preparar la mezcla para la placa según se indica en el protocolo del texto, filtrar el sobrenadante de las células para esterilizarlo y resuspender las células en el líquido restante hasta obtener una suspensión celular.Añada dos microlitros de ADN de testículo de salmón portador al 10 miligramos por mililitro. Luego añada 10 microlitros del plásmido digerido, ADN y vortexe antes de añadir 0,5 mililitros de placa y volver a vortexar. Finalmente, añada 20 microlitros de DI tres etol uno molar y vortexe.Después de incubar la mezcla durante seis a ocho horas a 25 grados Celsius, aplique una descarga térmica a las células en un baño de agua a 42 grados Celsius durante 10 minutos. Siembre 100 microlitros de las células desde el fondo del tubo de microcentrífuga, donde se han sedimentado, en una placa sin U.Incubar a 30 grados Celsius durante dos a tres días o hasta que se formen colonias. Seleccionar colonias individuales y sembrarlas en un medio sin .ATE. Para prepararse para microscopía, estas células contienen el plásmido con el A IP uno GFP y Urogen integrado en el cromosoma.Cultive una colonia de células de levadura con el A IP uno PGFP incorporado en YPD durante la noche en una rueda a 30 grados Celsius. Pase a subcultivo un mililitro de la colonia nocturna en nueve mililitros de medio menos Euro. Cultive las células durante tres a cuatro horas adicionales en agitador a 30 grados Celsius para asegurar que se encuentren en fase de crecimiento logarítmico.A continuación, agregue tres microlitros de células a un portaobjetos de vidrio y coloque un cubreobjetos. Deje que las células sedimenten sobre el portaobjetos durante cinco minutos. Antes de colocar el portaobjetos en el soporte de la platina, observe la proteína A IP one PGFP con un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total o microscopio TIRF, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100 x TIRF y una cámara digital CCD.Para enfocar las células, abra el software Slide Book 5.0 y haga clic en el botón de ventana de enfoque en la barra de herramientas. Para acceder a los controles de enfoque, seleccione la pestaña de microscopio y elija el objetivo de 100x turf. Encienda la lámpara y deslice la barra de la lámpara al 15 %. Cambie la configuración de bin a dos por dos y cambie el filtro a campo claro en el microscopio.Utilice el enfoque fino para enfocar las células tal como se observa en la pantalla del ordenador. Mediante los controles dentro de la ventana de enfoque, apague la lámpara, cambie el filtro a modo vivo y haga clic en el botón T-I-R-F-M en el iluminador T-I-R-F-M conectado al puerto lateral derecho del microscopio. Encienda la emisión del láser y seleccione la pestaña de flujo dentro de la ventana de enfoque.Marque la casilla junto a comenzar la grabación y luego haga clic en el botón de campo brillante en el iluminador TIR FM. Gire el micrómetro para ajustar el ángulo de incidencia del láser. Esto se utiliza para optimizar la emisión fluorescente de los focos A IP uno GFP y minimizar la fluorescencia de fondo procedente de las células y la preparación cuando se muestra la imagen deseada.Pulse el botón de inicio. Obtenga imágenes durante 20 segundos a una velocidad de cinco cuadros por segundo. Después de 20 segundos, pulse el botón de detención.Guarde las imágenes bajo la pestaña archivo en la barra de menú principal. Seleccione guardar diapositiva como e ingrese el archivo, la ubicación y el nombre. A continuación, utilice el software Image J.Para analizar las imágenes, utilice el complemento macro denominado localizador manual para rastrear el movimiento y la velocidad de los focos fluorescentes de A IP one P. Cambie el parámetro de intervalo de tiempo a 0,2 segundos. Mediante la opción agregar selección de trayectoria, seleccione y rastree una proteína fluorescente individual a través de cuatro a ocho cuadros consecutivos.Utilice el comando de seguimiento N y la velocidad del movimiento de la proteína entre cada cuadro se mostrará en una ventana de resultados. Determine la velocidad media entre cada cuadro utilizando una hoja de cálculo de Microsoft Excel.Utilice los valores para calcular la velocidad promedio del movimiento de A IP uno P, o de cada cepa celular de interés, para cuantificar el movimiento de A IP uno P. Se rastrearon más de 50 focos fluorescentes de A IP uno P en más de 10 células. Se muestran resultados representativos del movimiento de A IP uno P en células de tipo salvaje, como se esperaba.La a IP una P marcada con fluorescencia se mueve rápidamente a través de la célula y luego desaparece en células que expresan el Actina mutante R 2 56 H. La a IP una P presenta menos movimiento en comparación con células de tipo silvestre. El seguimiento de la a IP una P se realiza mediante Image J para mapear cuantitativamente el movimiento de la proteína.Una A IP uno P se desplaza a través de la célula en la cepa de tipo salvaje, pero se mueve únicamente en una región restringida. En la cepa mutante de actina, se calculó la velocidad promedio para cada área fluorescente de A IP uno P. En células de tipo salvaje, la velocidad media del movimiento de la A IP uno P es de 1,60 ± 0,42 micrones por segundo. Las células que expresan la actina mutante R 2 56 H, conocida por presentar una morfología anormal del citoesqueleto de actina, presentan un fenotipo alterado de A IP uno P en la cepa mutante.Un movimiento de A IP uno P está restringido y es más lento. La velocidad promedio del movimiento de A IP uno P es de 0,88 ± 0,30 micrómetros por segundo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de proteínas del citoesqueleto utilizando microscopía turf.Al utilizar este procedimiento, es importante recordar no dejar que las células se sequen ni se decoloren por la luz.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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