Name: La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprenda a cuantificar la permeabilidad de microvasos individuales en pulmones aislados de rata mediante imagen de fluorescencia en tiempo real. Este método permite estudiar respuestas vasculares pulmonares a diferentes estímulos experimentales.

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Los estudios fueron apoyados por NIH HL75503 de KP.

Todos los experimentos realizados en animales fueron aprobadas por el Comité de la Universidad de Tennessee Health Science Center Institucional Cuidado de Animales y el uso. 1. Tubo para Preparados perfusión del pulmón de la rata <ol><li> Preparar un sistema de tubos con tubos de Tygon (# 18) para la perfusión de la sangre como se muestra en la Figura 1. Conectar transductores de presión (P23XL) y colocar el tubo en la platina del microscopio. </li><li> Ajuste la temperatura del baño de agua a 37 ° C. </li><li> Conectar la entrada y la salida de pulmón temporalmente con tubo de Tygon. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51552/51552fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Tubos de perfusión de sangre. El esquema muestra la configuración de la tubería usada para hacer circular la sangre a través de la preparación de pulmón aislado. También se indican los componentes asociados a través del cual la tubería is enrutado. Un esquema del corazón y de pulmón se incluye para mostrar sitios de conexión entre el tubo y la arteria pulmonar (AP), y fibrilación (LA) de la cánula (líneas azules discontinuas) a la izquierda. 2. Preparación de los pulmones de ratas aislados <ol><li> Anestesie ratas (ratas Sprague-Dawley macho; 250-300 g) con ketamina (80-100 mg / kg) y con xilazina (5-10 mg / kg). Después de asegurarse de un plano quirúrgico de anestesia, colocar el animal en posición supina. </li><li> Realizar la traqueostomía, inserte una cánula traqueal (PE-90) y asegure con sutura quirúrgica. </li><li> Infundir heparina (100-200 U) en el corazón por punción cardíaca (21 G aguja de mariposa), espere 60 segundos y la sangre Exsanguinate (~ 12 a 15 ml de sangre). </li><li> Prepare dos cánulas (tubos Tygon, 3 mm de diámetro; 4 cm de largo; acampanados en un extremo) y rellenar con solución salina. </li><li> Lleve a cabo una toracotomía. Hacer una incisión (3 mm) en el ventrículo derecho y deslice el extremo acampanado de una cánula en la incisión hacia la pulmonararteria. Asegure cánula de la arteria pulmonar con suturas quirúrgicas. </li><li> Una incisión (3 mm) de la punta del ventrículo izquierdo y deslice el extremo acampanado de la segunda cánula dentro de la incisión. Guía de la cánula en la aurícula izquierda. Asegure cánula en el ventrículo izquierdo con una cinta umbilical (2 mm de ancho). </li><li> Diseccionar cualquier tejido conectivo, y quitar el pulmón y el corazón junto con las cánulas adjuntas. Coloca los pulmones y el corazón en una placa de Petri. Vuelva a colocar el pulmón para que la superficie diafragmática es en la parte superior. Las tres cánulas deben enfrentar la misma dirección. </li><li> Colocar la preparación de pulmón en un escenario que puede ser manipulado en las direcciones XY. Cualquier etapa que viene con un microscopio se puede modificar para mantener el tubo o una etapa a medida construido, si es necesario. </li></ol> 3. Perfusión sanguínea de los pulmones de ratas aisladas <ol><li> Mezclar la sangre se desangraron con una albúmina volumen igual (5%) y añadir la solución al depósito. Arranque la bomba peristáltica y establecer el flujo de rcomió a 14 ml / min. Deje que la sangre para llenar el tubo. </li><li> Con la derivación abierta, retire el conector de entrada-salida de pulmón temporal. Fije la arteria pulmonar y la cánula de la aurícula izquierda a la entrada y la salida de pulmón, respectivamente. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la tubería. </li><li> Conectar la cánula traqueal a un tercer transductor de presión (P23XL). Inflar los pulmones con un 30% de oxígeno a través de la cánula traqueal y mantener la presión en 5 cm H 2 O. </li><li> Cierre la derivación con una pinza para comenzar la perfusión pulmonar. Mantener la arteria pulmonar y la presión de la aurícula izquierda a ~ 10 y 3 cm H 2 O, respectivamente. </li></ol> 4. Preparación de pulmón para microvascular Infusión <ol><li> Elevar el extremo posterior del tubo de extensión para el catéter por encima del nivel del pulmón y seguro. </li><li> Preparar un catéter de infusión mediante la inserción de unos 30 cm de un tubo PE10 40 cm de largo en una tubería PE90 ~ 30 cm de largo. Conectar el extremo expuesto de la tubería PE10 a una aguja (30 g) arecapitulativos a una jeringa (1 cc). </li><li> Insertar la combinación de catéter en el extremo posterior elevada de la tubería de extensión. Guía de la combinación de catéter a través de la aurícula izquierda y en el pulmón hasta que encuentre resistencia. A continuación, empuje el catéter PE10 sola vez en el pulmón hasta que encuentre resistencia. Tenga en cuenta que la aplicación de una fuerza excesiva al insertar el catéter lesionar el pulmón. </li><li> Llene la jeringa de 1 cc con solución de Ringer y adherirse a una bomba de jeringa. Ajuste la velocidad de infusión a 10 l / min. </li><li> Lugar de la perfusión se convertirá en pálida en comparación con el resto del pulmón. </li><li> Humedezca el pulmón con solución salina y cubra el pulmón con una envoltura de plástico con un agujero lo suficientemente grande como para dejar el lugar de la infusión al descubierto. </li><li> Hisopo un poco de grasa llave de paso en la parte inferior de una junta tórica (por encargo) y colocar un cubreobjetos de vidrio (# 1,5, 22 mm de diámetro) en la parte inferior de la junta tórica. Coloque suavemente la junta tórica con el cubreobjetos sobre el lugar de la infusión. Fije la junta tórica con una hol tubo de ensayo estándarder. La combinación cubreobjetos / junta tórica no distorsiona las estructuras alveolares por debajo de ella, como se informó recientemente 15. </li><li> Coloque un objetivo (20X) de un microscopio de fluorescencia por encima de la junta tórica y se centran en la superficie del pulmón. </li></ol> 5. Imaging fluorescente dextrano tránsito por Microvasos <ol><li> Preparar el microscopio para fluorescencia FITC imágenes. </li><li> Seleccionar una región a ser fotografiado y adquirir imágenes a la velocidad de 1/minuto usando el software de adquisición de imágenes. </li><li> Comience la infusión de FITC-dextrano 20 kD (0,5 mg / ml) usando la bomba de jeringa. La fluorescencia en los vasos sanguíneos se incrementará gradualmente y alcanzar un máximo. Continuar la infusión durante 60 min. </li><li> Luego cambiar a la infusión de Ringer para lavar fluorescencia luminal. Mantener la infusión durante más de 10 min. Continuar la adquisición de imágenes en 1/min durante el lavado-off. </li></ol> 6. Análisis de Imágenes <ol><li> Abra el archivo de adquisición de imágenes. </li><li> Coloque las regionesde interés sobre los microvasos dentro del marco de la imagen. </li><li> Reproducir el archivo de imagen cuadro por cuadro y registrar la intensidad de fluorescencia en cada región de interés para todos los fotogramas. </li><li> Trazar el cambio en la intensidad de fluorescencia para cada región de interés como una función de tiempo. </li><li> Cuantificar la máxima intensidad de fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia residual después de 10 min de washoff. </li><li> Calcular la relación de máxima a la intensidad de fluorescencia residual en cada región de interés para obtener el índice de permeabilidad para los microvasos asociados con esa región de interés. </li></ol>

<ol><li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li>
<li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li>
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<li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li>
<li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+Respir+Environ+Exerc+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li>
<li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice%3A+comparison+with+125I-albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li>
<li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy%2C+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li>
<li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li>
<li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li>
<li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li>
<li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2%2B-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li>
<li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li>
<li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li>
<li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+1985%22%5BJournal%5D)">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li>
<li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La preparación de pulmón perfundido con sangre aislado junto con imágenes en tiempo real proporciona una herramienta sencilla para la determinación de cambios de permeabilidad en los microvasos pulmonares individuales. Hemos aplicado este método para definir los cambios de permeabilidad en respuesta a la infusión de LPS. Nuestros datos sugieren claramente que la infusión de LPS provocó un aumento de la permeabilidad microvascular. Además, los datos también indican que los cambios de permeabilidad inducidos por LPS fuero...

Aumento de la permeabilidad microvascular en los pulmones conduce al desarrollo de edema alveolar y el intercambio de gases en peligro y es una característica importante de la lesión pulmonar aguda (ALI) 1-3. Por lo tanto, las estimaciones de la permeabilidad vascular son importantes para definir el grado de la lesión pulmonar y la eficacia de las intervenciones terapéuticas propuestas. Análisis gravimétrico, tales como la relación húmedo a seco de pulmón libre de sangre y microvascular coeficiente de filtración se utilizan ampliamente métodos para estimar 4,5 permeabilidad. Otros métodos incluyen la cuantificación de la retención de sondas radioactivas o fluorescentes en el tejido pulmonar 6-8. Sin embargo, los métodos anteriores requieren un procesamiento postexperiment de muestras de tejido pulmonar hacia la aclaración de los datos de permeabilidad. Además, dado que un animal puede ser utilizado para un solo protocolo de tratamiento, puede ser necesario el número de animales grandes para un estudio completo. Una característica común de los métodos anteriores es que determinan la permeabilidad vascular media paratodos los vasos sanguíneos dentro de la muestra de tejido. Sin embargo, está bien establecido que los micro y macro vasos pulmonares son fenotípicamente diferentes 9. Por lo tanto, las respuestas de permeabilidad pueden ser heterogéneos entre los diversos segmentos de los vasos, así 9,10. Por lo tanto, la cuantificación de la permeabilidad media de todos los vasos pulmonares en una muestra de tejido puede no reflejar adecuadamente esta heterogeneidad. En la preparación aislada de pulmón perfundido con sangre, los vasos sanguíneos en la superficie del pulmón pueden ser visualizados por un microscopio vertical 4,11,12. Esto permite que las respuestas que caracterizan en los vasos individuales y por lo tanto, abordar cualquier heterogeneidad en las respuestas 13. Además, mediante la utilización de imágenes de fluorescencia de microvasos, ensayos de fluorescencia basado se pueden incorporar. Además, un microcatéter de la aurícula izquierda se puede utilizar para suministrar agentes y sondas de fluorescencia en los vasos sanguíneos 11,14. El microcatéter limita la entrega a una región de pulmón pequeño, por lo tanto exposando sólo los vasos sanguíneos dentro de la región a los agentes infundidos y fluoróforos. Esto permite que múltiples regiones pequeñas dentro del mismo pulmón a ser utilizados para experimentos separados, que conduce a una reducción global de animales necesarios para un estudio. Imágenes en tiempo real permite la captura de cambios dinámicos en la vascular y la fluorescencia extravascular de microvasos individuales de la preparación de pulmón aislado. Por lo tanto, para cada uno de los microvasos dentro de un campo de imagen, cambios en la fluorescencia durante la infusión de fluoróforos y washoff se pueden grabar, y se cuantificaron fuera de línea 14. El uso de valores de máxima y residual fluorescencia vascular, un índice de permeabilidad para cada uno de los microvasos dentro del campo de la imagen puede ser determinada. Para determinar los cambios de permeabilidad en respuesta a los agentes inflamatorios o perjudiciales, el agente deseado puede administrarse primero y luego el índice de permeabilidad determinada. Además, el campo de imagen se puede ajustar en cualquier lugar dentro de la región de pulmón infundido por elmicrocatéter, permitiendo así un alto grado de flexibilidad en la selección de la red vascular deseada. Por lo tanto, la preparación de pulmón aislado perfundido con sangre en tándem con formación de imágenes en tiempo real proporciona un modelo experimental atractiva para cuantificar la permeabilidad en microvasos pulmonares individuales.

<table><tbody><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>#18</td></tr><tr><td>Transductor</td><td>de Presión Data Sciences International</td><td>P23XL</td><td>Necesidad cantidad 3</td></tr><tr><td>Aguja de Mariposa</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td>450081 21 G</td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex L/S</td><td></td></tr><tr><td>PE-90</td><td>Tubo Becton Dickinson</td><td>427421</td><td>30 cm necesarios</td></tr><tr><td>Tubo de PE-10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td>40 cm necesarios</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS8000</td><td></td></tr><tr>Junta<td>tórica</td><td>Hecho a medida con un orificio de 20 mm de diámetro y un mango para asegurar la junta tórica al soporte</td>Microscopio de fluorescencia vertical Olympus America BX61WI Software de adquisición de <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> imágenes Dispositivos moleculares Metamorph <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextrano 20KD</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>0,5 mg/ml (Se puede seleccionar un dextrano de diferente tamaño molecular, si los experimentos de ensayo indican su idoneidad en función de los valores del índice de permeabilidad calculados)&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipopolisacárido</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Serotipo 0111:B4</td></tr></tbody></table>

la cuantificación individual microvessel permeabilidad en aislado de rata blood-perfundido preparación de pulmón

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

La preparación aislada de pulmón perfundido con sangre es ampliamente utilizado para visualizar y definir la señalización en los microvasos individuales. Mediante el acoplamiento de esta preparación con imágenes en tiempo real, se hace factible para determinar los cambios de permeabilidad en los microvasos pulmonares individuales. Aquí se describe los pasos para aislar a los pulmones de ratas y perfundir con sangre autóloga. A continuación, se describe los pasos para infundir fluoróforos o agentes a través de un micro-catéter en una región de pulmón pequeño. El uso de estos procedimientos descritos, se determinó la permeabilidad aumenta en microvasos pulmonares de rata en respuesta a inyecciones de lipopolisacárido bacteriano. Los datos revelaron que el lipopolisacárido aumentó fuga de líquido a través de ambos segmentos venulares y microvasos capilares. Por lo tanto, este método hace posible la comparación de las respuestas de permeabilidad entre los segmentos vasculares y por lo tanto, definir cualquier heterogeneidad en la respuesta. Mientras que los métodos comúnmente utilizados para definir la permeabilidad pulmonar requieren postprocesado de muestras de tejido de los pulmones, eluso de imágenes en tiempo real evita este requisito como se desprende de la presente método. Por lo tanto, la preparación de pulmón aislado combinado con imágenes en tiempo real, ofrece varias ventajas sobre los métodos tradicionales para determinar la permeabilidad microvascular pulmonar, sin embargo, es un método sencillo de desarrollar y poner en práctica.

Una preparación de pulmón perfundido con sangre aislado conectado al tubo de perfusión y el equipo relacionado se muestra en la Figura 2. Para fines de demostración, se utilizó una rata Sprague Dawley, aunque los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar con cualquier especie de rata. Infusiones través de un microcatéter de la aurícula izquierda sólo llegan a una pequeña región del pulmón. La región infundido puede ser identificado por la decoloración inducida por infusión...

La preparación aislada de pulmón perfundido con sangre hace que sea posible visualizar las redes de microvasos en la superficie del pulmón. A continuación se describe un método para cuantificar la permeabilidad de la microvasculatura individuales en pulmones aislados utilizando imágenes de fluorescencia en tiempo real.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la permeabilidad en vasos microscópicos individuales de pulmones de rata aislados mediante un método basado en fluorescencia. Esto se logra primero aislando los pulmones de rata y perfundiéndolos con sangre autóloga. El segundo paso del procedimiento consiste en insertar un microcatéter en la aurícula izquierda en una pequeña región del pulmón para infundir dextrina marcada con flora cuatro.Luego, mientras se infunde la dextrina marcada, se recopilan imágenes de los microvasos pulmonares. El paso final consiste en cuantificar la permeabilidad de microvasos individuales a partir de las imágenes, utilizando software. En última instancia, los resultados pueden mostrar el grado de permeabilidad de los microvasos pulmonares bajo diferentes condiciones, como tras el tratamiento con LPS.La doctora Kava Kasami, investigadora postdoctoral de mi laboratorio, demostrará este procedimiento. Comience realizando una traqueotomía en una rata macho bajo un plano anestésico quirúrgico confirmado. Utilice una cánula traqueal PE 90 y fíjela con suturas. A continuación, infunda el corazón con 100 a 200 unidades de heparina utilizando una aguja tipo mariposa de calibre 21.Espere un minuto y luego exangüe la sangre. Recoja la sangre y colóquela aparte con suero salino. Llene dos cánulas hechas de tubo de tigón de tres milímetros de diámetro, de cuatro centímetros de largo y ensanchadas en un extremo.Ahora realice una toracotomía. Haga una incisión apenas lo suficientemente grande para la cánula en el ventrículo derecho e introduzca suavemente la embocadura ensanchada de una cánula hacia la arteria pulmonar. Sujete la cánula con puntos de sutura.Utilice la misma técnica para insertar la otra cánula en el ápice del ventrículo izquierdo hacia la aurícula izquierda. Fíjela con cinta umbilical de dos milímetros de ancho. Ahora retire los tejidos conectivos que obstaculizan y extraiga el corazón y el vaso grandes juntos con las cánulas.Trasládelos a una placa de Petri con la superficie diafragmática del pulmón hacia arriba y las tres cánulas alineadas. Mueva el preparado diseccionado a una plataforma ajustable equipada con tubos de tigón número 18 conectados a transductores de presión que sirven como tubos de entrada y salida. Ahora mezcle la muestra de sangre con un volumen igual de solución de albúmina al 5 %.Agregue esta mezcla al depósito de carga. Inicie la bomba a 14 mililitros por minuto. Asegúrese de que el tubo no tenga burbujas de aire.En la preparación, conecte la arteria pulmonar al tubo de entrada del pulmón y la cánula auricular izquierda al tubo de salida. Verifique cuidadosamente que no haya aire en los tubos y compruebe también que la derivación esté abierta.Conecte la cánula traqueal a un tercer transductor de presión. Infle los pulmones a través de la cánula traqueal con oxígeno al 30 %. Mantenga los pulmones a una presión de cinco centímetros de agua.Ahora sujete la derivación y encienda la bomba a 14 mililitros por minuto. Para iniciar la perfusión pulmonar durante la perfusión, ajuste la bomba para mantener la presión pulmonar en aproximadamente 10 centímetros de agua y mantener la presión auricular izquierda en tres centímetros de agua. Comience preparando el pulmón infundido con sangre.Primero, construya un catéter de infusión a partir de un segmento de 40 centímetros de tubo PE 10 insertado en un segmento de 30 centímetros de tubo PE 90. Conecte el otro extremo del tubo PE 10 a una aguja de calibre 30 unida a una jeringa de un cc. Lleve el extremo del tubo conectado al pulmón por encima del preparado y fije el catéter de infusión a este.Dirija el catéter de infusión hacia la aurícula izquierda y luego hacia el pulmón hasta que encuentre resistencia. La fuerza excesiva lesionará el pulmón. La incisión adecuada del microcatéter es fundamental, ya que cualquier daño al pulmón causado por el microcatéter reducirá el éxito del protocolo.A continuación, llene la jeringa con solución de Ringer y conéctela a una bomba. Infunda lentamente la solución a una velocidad de 10 microlitros por minuto. Poco a poco, el sitio de infusión se volverá pálido en comparación con el resto del pulmón, manteniendo la superficie pulmonar húmeda, excepto en el sitio de infusión.Ahora, para visualizar el pulmón, cree una ventana de observación sujetando una arandela de goma a un cubreobjetos de 22 milímetros. Utilice grasa para llave de paso para fijar la arandela de goma a un portatubos. Luego, coloque la ventana sobre el sitio de infusión.Complete el montaje colocando un objetivo de 20x sobre el cubreobjetos y enfoque en el pulmón. No se espera ninguna distorsión visual. Ahora infunda el pulmón con una solución de su elección.En este ejemplo, tras la solución salina, se infunde un mililitro de dextrina conjugada con ZI en el pulmón mediante una bomba de jeringa durante un periodo de 60 minutos. Utilizando el software de imagen, registre una imagen por minuto durante la infusión de una hora y continúe la adquisición durante el paso subsiguiente de lavado durante 10 minutos más. Después de infundir la dextrina Fitz, elimínela infundiendo solución de Ringer para pulmón durante al menos otros 10 minutos a la misma velocidad de flujo. Posteriormente, al analizar las imágenes adquiridas, determine la intensidad máxima de fluorescencia en la región de interés durante la infusión de la dextrina Fitz.Luego, registre la intensidad máxima de fluorescencia de la fluorescencia residual tras el lavado de 10 minutos. Los cambios en la permeabilidad vascular se investigaron mediante la infusión de dextrina fitzy tras el tratamiento con lipopolisacárido bacteriano, ya que este es un modelo ampliamente utilizado de una LI. La fluorescencia residual de fit e fue baja en los microvasos tratados con Ringer, pero alta en aquellos tratados con LPS. Además, en comparación con la infusión de Ringer, la infusión de LPS provocó una reducción significativa en el índice de permeabilidad, lo que sugiere un aumento global en la permeabilidad en todos los vasos dentro del campo de la imagen.Además, en comparación con la infusión de Ringer, la infusión de LPS provocó una reducción significativa en el índice de permeabilidad, lo que sugiere un aumento global en la permeabilidad en todos los vasos dentro del campo de la imagen. Después de ver este video, se deberá tener una buena comprensión de cómo preparar pulmones aislados de aves, insertar una microcánula en la cola izquierda y definir la permeabilidad a nivel microscópico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El protocolo siguiente se describe el proceso de aislamiento, ventilación e instrumentación de los pulmones del ratón para medir constante o pulsátil vascular pulmonar de presión-flujo relaciones con el fin de cuantificar los efectos del flujo sanguíneo, el flujo de aire, los cambios en las vías respiratorias y los cambios vasculares en la poscarga del ventrículo derecho.

Caracterización de los aislados y ventilados, y pulmón de ratón instrumentado perfundidos con flujo pulsátil

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Ensayo de prueba de permeabilidad Vasos Sanguíneos

La vasoconstricción pulmonar hipóxica (HPV) es un fenómeno fisiológico importante por el cual en la perfusión alveolar del pulmón de la hipoxia es emparejada a la ventilación. El segmento vascular principal que contribuye al HPV es la arteria intra-acinar. Aquí, describimos nuestro protocolo para el análisis del VPH de vasos pulmonares murinos con diámetros de 20-100 μm.

Análisis Videomorfométrico De La Vasoconstricción Pulmonar Hipóxica De Las Arterias Intrapulmonares Usando Cortes Murinos De Precisión Pulmonar Slices

El objetivo del presente estudio fue validar la reproducibilidad de un modelo de acreditación in vitro que implica una rata singénico co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. La monocapa de células endoteliales presentan alta y baja permeabilidad TEER LY. La expresión de proteínas TJ específicos, se evaluaron las respuestas funcionales a la inflamación y la funcionalidad de los transportadores y los receptores.

Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

Se presenta un método para medir la velocidad del flujo sanguíneo microcirculatorio en metástasis de cáncer pulmonar de la superficie pleural en ratas de forma automatizada, utilizando microscopía intravital pulmonar a tórax cerrado. Este modelo tiene potencial para ser utilizado como una herramienta generalizada para realizar investigaciones fisiológicas sobre metástasis pulmonares en roedores.

Medición Automatizada de la microcirculación de la sangre Velocidad del caudal en metástasis pulmonar de ratas

Ex-Vivo perfusión pulmonar (EVLP) ha permitido el trasplante de pulmón en los seres humanos para ser más fácilmente disponible, permitiendo la capacidad de evaluar los órganos y ampliar el grupo de donantes. Aquí se describe el desarrollo de un programa EVLP rata y mejoras que permitan un modelo reproducible para una futura expansión.

Método de aislados<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión pulmonar en un modelo de rata: Lecciones Aprendidas de Desarrollo de un Programa EVLP Rata

La técnica de Landis modificada permite la medición emparejada de la conductividad hidráulica de microvasos individuales en el mesenterio de ratas normales y modificadas genéticamente en condiciones de control y prueba utilizando técnicas de microperfusión. Proporciona un método conveniente para evaluar los mecanismos que regulan la permeabilidad de los microvasos y el intercambio transvascular en condiciones fisiológicas.

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Este manuscrito describe en vitro protocolos video microscopia para evaluar la función vascular en las arterias de resistencia cerebral de rata. El manuscrito también describe técnicas para evaluar la densidad de microvessel con fluorescencia marcada perfusión lectinas y tejido mediante flujometría Doppler láser.

Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas

La preparación aislada del pulmón de conejo es una herramienta estándar de oro en la investigación pulmonar. Esta publicación tiene como objetivo describir la técnica desarrollada para el estudio de los mecanismos fisiológicos y patológicos involucrados en la reactividad de las vías respiratorias, la preservación pulmonar y la investigación preclínica en trasplante pulmonar y edema pulmonar.

Sistema de perfusión pulmonar aislada en el modelo de conejo

Aquí, describimos un protocolo simple y económico para realizar una cuantificación no sesgada de la densidad microvascular pulmonar para tejido pulmonar de ratones enteros utilizando la tinción única de Isolectin B4.

Cuantificación de la densidad microvascular pulmonar en ratones a través de los lóbulos

Aprenda a cuantificar la permeabilidad de microvasos individuales en pulmones aislados de rata mediante imagen de fluorescencia en tiempo real. Este método permite estudiar respuestas vasculares pulmonares a diferentes estímulos experimentales.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

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