La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón
30 de junio de 2014
La preparación aislada de pulmón perfundido con sangre hace que sea posible visualizar las redes de microvasos en la superficie del pulmón. A continuación se describe un método para cuantificar la permeabilidad de la microvasculatura individuales en pulmones aislados utilizando imágenes de fluorescencia en tiempo real.
El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la permeabilidad en vasos microscópicos individuales de pulmones de rata aislados mediante un método basado en fluorescencia. Esto se logra primero aislando los pulmones de rata y perfundiéndolos con sangre autóloga. El segundo paso del procedimiento consiste en insertar un microcatéter en la aurícula izquierda en una pequeña región del pulmón para infundir dextrina marcada con flora cuatro.
Luego, mientras se infunde la dextrina marcada, se recopilan imágenes de los microvasos pulmonares. El paso final consiste en cuantificar la permeabilidad de microvasos individuales a partir de las imágenes, utilizando software. En última instancia, los resultados pueden mostrar el grado de permeabilidad de los microvasos pulmonares bajo diferentes condiciones, como tras el tratamiento con LPS.
La doctora Kava Kasami, investigadora postdoctoral de mi laboratorio, demostrará este procedimiento. Comience realizando una traqueotomía en una rata macho bajo un plano anestésico quirúrgico confirmado. Utilice una cánula traqueal PE 90 y fíjela con suturas. A continuación, infunda el corazón con 100 a 200 unidades de heparina utilizando una aguja tipo mariposa de calibre 21.
Espere un minuto y luego exangüe la sangre. Recoja la sangre y colóquela aparte con suero salino. Llene dos cánulas hechas de tubo de tigón de tres milímetros de diámetro, de cuatro centímetros de largo y ensanchadas en un extremo.
Ahora realice una toracotomía. Haga una incisión apenas lo suficientemente grande para la cánula en el ventrículo derecho e introduzca suavemente la embocadura ensanchada de una cánula hacia la arteria pulmonar. Sujete la cánula con puntos de sutura.
Utilice la misma técnica para insertar la otra cánula en el ápice del ventrículo izquierdo hacia la aurícula izquierda. Fíjela con cinta umbilical de dos milímetros de ancho. Ahora retire los tejidos conectivos que obstaculizan y extraiga el corazón y el vaso grandes juntos con las cánulas.
Trasládelos a una placa de Petri con la superficie diafragmática del pulmón hacia arriba y las tres cánulas alineadas. Mueva el preparado diseccionado a una plataforma ajustable equipada con tubos de tigón número 18 conectados a transductores de presión que sirven como tubos de entrada y salida. Ahora mezcle la muestra de sangre con un volumen igual de solución de albúmina al 5 %.
Agregue esta mezcla al depósito de carga. Inicie la bomba a 14 mililitros por minuto. Asegúrese de que el tubo no tenga burbujas de aire.
En la preparación, conecte la arteria pulmonar al tubo de entrada del pulmón y la cánula auricular izquierda al tubo de salida. Verifique cuidadosamente que no haya aire en los tubos y compruebe también que la derivación esté abierta.
Conecte la cánula traqueal a un tercer transductor de presión. Infle los pulmones a través de la cánula traqueal con oxígeno al 30 %. Mantenga los pulmones a una presión de cinco centímetros de agua.
Ahora sujete la derivación y encienda la bomba a 14 mililitros por minuto. Para iniciar la perfusión pulmonar durante la perfusión, ajuste la bomba para mantener la presión pulmonar en aproximadamente 10 centímetros de agua y mantener la presión auricular izquierda en tres centímetros de agua. Comience preparando el pulmón infundido con sangre.
Primero, construya un catéter de infusión a partir de un segmento de 40 centímetros de tubo PE 10 insertado en un segmento de 30 centímetros de tubo PE 90. Conecte el otro extremo del tubo PE 10 a una aguja de calibre 30 unida a una jeringa de un cc. Lleve el extremo del tubo conectado al pulmón por encima del preparado y fije el catéter de infusión a este.
Dirija el catéter de infusión hacia la aurícula izquierda y luego hacia el pulmón hasta que encuentre resistencia. La fuerza excesiva lesionará el pulmón. La incisión adecuada del microcatéter es fundamental, ya que cualquier daño al pulmón causado por el microcatéter reducirá el éxito del protocolo.
A continuación, llene la jeringa con solución de Ringer y conéctela a una bomba. Infunda lentamente la solución a una velocidad de 10 microlitros por minuto. Poco a poco, el sitio de infusión se volverá pálido en comparación con el resto del pulmón, manteniendo la superficie pulmonar húmeda, excepto en el sitio de infusión.
Ahora, para visualizar el pulmón, cree una ventana de observación sujetando una arandela de goma a un cubreobjetos de 22 milímetros. Utilice grasa para llave de paso para fijar la arandela de goma a un portatubos. Luego, coloque la ventana sobre el sitio de infusión.
Complete el montaje colocando un objetivo de 20x sobre el cubreobjetos y enfoque en el pulmón. No se espera ninguna distorsión visual. Ahora infunda el pulmón con una solución de su elección.
En este ejemplo, tras la solución salina, se infunde un mililitro de dextrina conjugada con ZI en el pulmón mediante una bomba de jeringa durante un periodo de 60 minutos. Utilizando el software de imagen, registre una imagen por minuto durante la infusión de una hora y continúe la adquisición durante el paso subsiguiente de lavado durante 10 minutos más. Después de infundir la dextrina Fitz, elimínela infundiendo solución de Ringer para pulmón durante al menos otros 10 minutos a la misma velocidad de flujo. Posteriormente, al analizar las imágenes adquiridas, determine la intensidad máxima de fluorescencia en la región de interés durante la infusión de la dextrina Fitz.
Luego, registre la intensidad máxima de fluorescencia de la fluorescencia residual tras el lavado de 10 minutos. Los cambios en la permeabilidad vascular se investigaron mediante la infusión de dextrina fitzy tras el tratamiento con lipopolisacárido bacteriano, ya que este es un modelo ampliamente utilizado de una LI. La fluorescencia residual de fit e fue baja en los microvasos tratados con Ringer, pero alta en aquellos tratados con LPS. Además, en comparación con la infusión de Ringer, la infusión de LPS provocó una reducción significativa en el índice de permeabilidad, lo que sugiere un aumento global en la permeabilidad en todos los vasos dentro del campo de la imagen.
Además, en comparación con la infusión de Ringer, la infusión de LPS provocó una reducción significativa en el índice de permeabilidad, lo que sugiere un aumento global en la permeabilidad en todos los vasos dentro del campo de la imagen. Después de ver este video, se deberá tener una buena comprensión de cómo preparar pulmones aislados de aves, insertar una microcánula en la cola izquierda y definir la permeabilidad a nivel microscópico.
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Descripción general
Este artículo describe un método para cuantificar la permeabilidad de microvasos individuales en pulmones aislados de rata mediante imágenes de fluorescencia en tiempo real. La preparación del pulmón perfundido con sangre aislado permite la visualización de redes de microvasos en la superficie pulmonar.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología vascular
- Imagen de fluorescencia
Antecedentes
- Comprender la permeabilidad de los microvasos es fundamental para estudiar la función pulmonar.
- Los preparados pulmonares aislados proporcionan un entorno controlado para experimentación.
- La imagen por fluorescencia permite la observación en tiempo real de la dinámica de los microvasos.
- Estudios previos han demostrado el impacto de diversos tratamientos sobre la permeabilidad vascular.
Objetivo del estudio
- Cuantificar la permeabilidad en microvasos individuales de pulmones de rata aislados.
- Utilizar un método basado en fluorescencia para mediciones precisas.
- Evaluar los efectos de condiciones como el tratamiento con LPS sobre la permeabilidad de los microvasos.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de pulmones de rata y perfusión con sangre autóloga.
- Inserción de un microcatéter en la aurícula izquierda dentro del pulmón.
- Infusión de dextrina marcada con fluoresceína en los microvasos.
- Recolección de imágenes durante el proceso de infusión para su análisis.
Resultados principales
- Se logró la cuantificación de la permeabilidad en microvasos individuales.
- Los resultados indicaron grados variables de permeabilidad bajo diferentes condiciones experimentales.
- La imagen de fluorescencia proporcionó una visualización clara de las redes de microvasos.
- Los datos respaldan una mayor investigación sobre los efectos de los tratamientos en los microvasos pulmonares.
Conclusiones
- El método cuantifica eficazmente la permeabilidad de microvasos en pulmones aislados.
- La imagen en tiempo real es una herramienta valiosa para la investigación vascular.
- Los hallazgos contribuyen a comprender las respuestas vasculares pulmonares frente a diversos estímulos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la cuantificación directa de los cambios en la permeabilidad en microvasos pulmonares individuales bajo condiciones inflamatorias, proporcionando una comprensión mecanicista de las vías de fuga vascular. Al combinar la perfusión pulmonar aislada con imágenes de fluorescencia en tiempo real, apoya la validación de dianas en modelos de inflamación pulmonar y facilita la evaluación preclínica de candidatos protectores de la barrera. Este enfoque reduce la dependencia del procesamiento de tejidos en puntos finales, acelerando la adquisición de datos para decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Mide en tiempo real la fuga de líquido a través de segmentos venulares y capilares para investigar hipótesis terapéuticas en la inflamación vascular.
- Valor operativo: Permite la comparación paralela de las respuestas de permeabilidad entre lechos vasculares dentro de la misma preparación pulmonar.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de intensidad de fluorescencia para evaluar los efectos del compuesto sobre la permeabilidad de microvasos.
- Valor operativo: Estandariza las condiciones de perfusión e imagen para cribado vascular reproducible y de alto contenido.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona los cambios de permeabilidad inducidos por LPS con mecanismos relevantes para la enfermedad en lesión pulmonar aguda.
- Valor operativo: Apoya la modelización de respuesta a la dosis y la correlación farmacocinética-farmacodinámica en estudios preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta las pruebas de eficacia preclínica, particularmente para moduladores vasculares pulmonares.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante la cuantificación de la función de barrera vascular en respuesta a estímulos inflamatorios.
- Tamizaje: Proporciona salidas cuantificables y listas para ensayos para evaluar los efectos de compuestos sobre la permeabilidad de un solo vaso.
- Análisis: Ofrece cálculos del índice de permeabilidad a partir de imágenes de lapso de tiempo para permitir el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta las respuestas microvasculares con modelos preclínicos de lesión pulmonar mediante desafío con LPS.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar la permeabilidad vascular en múltiples clases de compuestos y modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las vías de fuga vascular mediante una resolución directa a nivel de un solo vaso.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de infusión con microcatéter y de obtención de imágenes para lograr reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar señales cuantitativas tempranas de seguridad vascular.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en sus efectos sobre el sistema vascular pulmonar.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía de roedores, canulación vascular y microscopía de fluorescencia.
- Depende de sistemas de perfusión regulados por presión e infraestructura para imágenes intravital.
- Necesita la estandarización de tasas de infusión, concentraciones de fluoróforos y protocolos de lavado entre diferentes equipos.
- La adaptación a otras especies o modelos de enfermedad puede requerir la validación de parámetros de perfusión y accesibilidad vascular.
- Las limitaciones prácticas incluyen la complejidad técnica del posicionamiento de microcatéteres y el posible trauma pulmonar derivado de la canulación.
