La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la permeabilidad en microvasos individuales de pulmones de rata aislados utilizando un método basado en fluorescencia. Esto se logra primero aislando los pulmones de las ratas y perfundiéndolos con sangre autóloga. El segundo paso del procedimiento es insertar un microcatéter auricular izquierdo en una pequeña región del pulmón para infundir dextrina marcada con cuatro floras.

Luego, mientras se infunde la dextrina marcada, se recogen imágenes de los microvasos pulmonares. El paso final es cuantificar la permeabilidad de los microvasos individuales a partir de las imágenes mediante un software. En última instancia, los resultados pueden mostrar el grado de permeabilidad de los microvasos pulmonares en diferentes condiciones, como después del tratamiento con LPS.

La demostración de este procedimiento estará a cargo del Dr. Kava Kasami, un becario postdoctoral de mi laboratorio Begin, realizando una traqueotomía en una rata macho en un plano quirúrgico confirmado de anestesia. Utilice una cánula traqueal de PE 90 y asegúrela con suturas. A continuación, infunda el corazón de 100 a 200 unidades de heparina con una aguja de mariposa de calibre 21.

Espere un minuto y luego exanguine la sangre. Recoge la sangre y déjala a un lado con solución salina. Llene dos cánulas hechas de tubo de tigón de tres milímetros de cuatro centímetros de largo y ensanchadas en un extremo.

Ahora realice una toracotomía. Haga una incisión lo suficientemente grande para que la cánula penetre en el ventrículo derecho y deslícela en la abrazadera ensanchada de una cánula hacia la arteria pulmonar. Asegure la cánula con suturas.

Use la misma técnica para insertar la otra cánula en el ápice del ventrículo izquierdo hacia la aurícula izquierda. Asegúralo con cinta umbilical de dos milímetros de ancho. Ahora retire los tejidos conectivos que lo impiden y retire el largo y el corazón junto con las cánulas.

Transfiéralos a una placa de Petri con la superficie diafragmática del pulmón hacia arriba y las tres cánulas alineadas. Mueva la preparación diseccionada a una etapa ajustable equipada con un tubo de tigón número 18 conectado a transductores de presión que sirven como tubos de entrada y salida. Ahora mezcle la recolección de sangre con un volumen igual de solución de albúmina al 5%.

Agregue esta mezcla al depósito de carga. Encienda la bomba a 14 mililitros por minuto. Asegúrese de que el tubo no tenga burbujas de aire.

En la preparación. Conecte la arteria pulmonar al tubo de entrada del pulmón y la cánula auricular izquierda al tubo de salida. Verifique que no haya aire en el tubo y también verifique que la derivación esté abierta.

Conecte la cánula traqueal a un tercer transductor de presión. Inflar los pulmones a través de la cánula traqueal con un 30% de oxígeno. Mantenga los pulmones a cinco centímetros de presión de agua.

Ahora sujete la derivación y encienda la bomba a 14 mililitros por minuto. Para iniciar la perfusión pulmonar durante la perfusión, ajuste la bomba para mantener la presión pulmonar a unos 10 centímetros de agua y mantener la presión de la aurícula izquierda a tres centímetros de agua. Comience con la preparación del pulmón infundido con sangre.

Primero, construya un catéter de infusión a partir de un tubo de PE 10 de 40 centímetros de longitud insertado en un tubo de PE 90 de 30 centímetros de longitud. Conecte el otro extremo del tubo de PE 10 a una aguja de calibre 30 conectada a una jeringa de un cc. Lleve el extremo del tubo conectado al pulmón por encima de la preparación y conecte el catéter de infusión a él.

Guíe el catéter de infusión a la aurícula izquierda y luego al pulmón hasta que encuentre resistencia. Una fuerza excesiva dañará el pulmón. La incisión adecuada del microcatéter es fundamental, ya que cualquier daño al pulmón por el microcatéter reducirá el éxito del protocolo.

A continuación, llene la jeringa con timbres y conéctela a una bomba. Infundir lentamente la solución a una velocidad de 10 microlitros por minuto. Gradualmente, el sitio de infusión se volverá pálido en comparación con el resto del pulmón para mantener la superficie pulmonar húmeda rápidamente en plástico, con la excepción del sitio de infusión.

Ahora, para visualizar el pulmón, cree una ventana de visualización colocando una junta tórica en un cubreobjetos de 22 milímetros. Con grasa para llaves de paso, asegure la junta tórica a un soporte para tubos de ensayo. A continuación, coloque la ventana sobre el lugar de infusión.

Completa la configuración balanceando un objetivo de 20 aumentos sobre el cubreobjetos y enfocándote en el pulmón. No se espera distorsión visual. Ahora infunda el pulmón con una solución de su elección.

En este ejemplo, después de la solución salina, se infunde un mililitro de dextrina conjugada ZI en el pulmón a través de la bomba de jeringa en el transcurso de 60 minutos. Con el uso del software de diagnóstico por imágenes, registre una imagen por minuto durante la infusión de una hora y continúe grabando durante el lavado posterior. Paso durante 10 minutos más. Después de infundir la dextrina Fitz, lávela infundiendo la solución pulmonar del timbre durante al menos otros 10 minutos al mismo flujo. Más tarde. Al analizar las imágenes adquiridas, marque la intensidad máxima de fluorescencia en la región de interés durante la infusión de ajuste.

A continuación, marque la intensidad máxima de fluorescencia de la fluorescencia residual después del lavado de 10 minutos. Los cambios en la permeabilidad vascular se investigaron utilizando la infusión de dextrina fitzy después del tratamiento con lipopolisacárido bacteriano, ya que este es un modelo ampliamente utilizado de un LI. La fluorescencia residual de ajuste e fue baja en los microvasos tratados con ringers, pero alta en los tratados con LPS. Además, en comparación con la infusión de timbre, la infusión de LPS causó una reducción significativa en el índice de permeabilidad, lo que sugiere un aumento global de la permeabilidad en todos los vasos dentro del campo de imagen.

Además, en comparación con la infusión de timbre, la infusión de LPS causó una reducción significativa en el índice de permeabilidad, lo que sugiere un aumento global de la permeabilidad en todos los vasos dentro del campo de imagen. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar pulmones profilácticos de aves aisladas, insertar un microcatéter de cola izquierda y definir la permeabilidad en micro.