Name: Análisis automatizado de Dinámica Ca 2 + Las señales en secuencias de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Aprende a analizar la actividad de calcio endotelial en arterias coronarias de cerdo mediante análisis automatizado de ROI. Este método mejora la velocidad, precisión y reduce el sesgo del usuario en señales de Ca²⁺.

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Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones HL-085 887, HL-092992, S10RR027535 y MOP-93676.

1. Disección de Buques e Imagen <ol><li> Tejido de cosecha de cerdos juveniles nacionales como se describe en Martens et al 27. Coloque ventrículos derecho porcina cosechadas en un polidimetilsiloxano (PDMS) plato de disección de fondo que contiene tamponada con HEPES solución salina fisiológica (PSS). <ol><li> Con la ayuda de un estereomicroscopio, diseccionar y retirar un segmento de la arteria descendente anterior izquierda coronaria (~ 8 mm de longitud, 0,5 mm de diámetro) del tejido circundante utilizando fórceps y tijeras de primavera mediante la eliminación de la segmento de vaso de las capas de tejido cardiaco de los alrededores. NOTA: Tenga cuidado de no perforar la pared del vaso. </li><li> Coloque un bloque de PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) en el plato de disección, y el uso de una aguja para fijarlo a la parte inferior. Cortar un alambre de tungsteno de aproximadamente 40 m de diámetro en doce ~ segmentos de longitud 0,3 cm, formando microalfileres, y colocarlos en el plato. Con unas pinzas, sujete un extremo del segmento del vaso al bloque con una MICROPIn. </li><li> Inserte con cuidado las pequeñas tijeras de primavera en la luz del vaso, y cortar longitudinalmente en un lado de la embarcación para abrirlo por completo. Oriente el segmento de vaso abierto con el endotelio hacia arriba. </li><li> Utilice los microalfileres restantes para asegurar las fronteras del segmento de vaso abierto para bloquear de manera que el recipiente forma un rectángulo plano. NOTA: Micropin tapas deben estar dobladas a 90 ° y se insertan hasta que quede nivelado con la superficie del bloque. Se debe tener cuidado para estirar la preparación buque sin estirar demasiado; anchura final debe ser ~ 1,5 x el ancho de partida sin estirar. </li><li> Preparar un volumen pequeño (~ 1 ml) de Fluo-4 AM solución de carga mediante la mezcla de Fluo-4 a.m. (10 mM) disuelto en DMSO con plurónico (0,03%) en un tamponada con HEPES PSS (que contiene en mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 de MgCl, 10 HEPES, 10 glucosa), e insertar todo el bloque en la solución de carga durante aproximadamente 40 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Después de cargar, lavar el bloque en tampón HEPESPSS durante 5-10 min. </li><li> Monte el bloque a 50-100 micras espaciadores de espesor en una cámara inferior cubre objetos que contiene tamponada con HEPES PSS. NOTA: Los clavos metálicos se pueden utilizar como separadores y asegurar el segmento de vaso esté hacia abajo y no tocar los espaciadores. </li><li> Coloque la cámara en el escenario de un microscopio invertido equipado para imagen confocal, y se centran en la capa de células endoteliales. </li><li> Secuencias de imágenes de lapso de tiempo de captura de fluorescencia relativa basal durante ~ 3 min a 20 aumentos y una velocidad de ~ 8 fotogramas por segundo utilizando la imagen confocal software de secuencia de adquisición. </li><li> Después de ~ 3 min de grabación de fluorescencia basal, reemplazar tamponada con HEPES solución de PSS con el mismo volumen (~ 1 ml) de la sustancia P (100 pM) disuelto en tampón HEPES PSS, y récord para un addtional 3 min. </li></ol></li></ol> 2. Análisis Automatizado <ol><li> Render secuencia (s) imagen de la actividad de calcio fluorescente del software de adquisición confocal como 8 bits, grayscale &#39;. tif&#39; archivos de formato sin información de escala. </li><li> Abrir ImageJ, haga clic en &quot;abierto&quot; en el menú archivo y seleccionar la secuencia de imágenes apropiado en la ventana del explorador para ver la secuencia (s) imagen en ImageJ. </li><li> Determinar un diámetro ROI apropiada mediante el uso de la herramienta de ROI rectangular para estimar los límites superior e inferior de la propagación espacial de la actividad dentro de la secuencia (s) de imagen. NOTA: El diámetro rectangular media es una buena opción para diámetro ROI. </li><li> Cree una nueva carpeta en el disco duro del ordenador, y agregar la secuencia (s) imagen en el directorio de la carpeta. </li><li> En ImageJ, haga clic en la ventana de &#39;plugins&#39;, a continuación, haga clic en &#39;LC_Pro&#39; para iniciar el análisis. </li><li> Introduzca el valor de retorno de la inversión de diámetro y seleccione el valor umbral del filtro (ya sea 0.05 o 0.01). </li><li> Haga clic en la casilla de verificación &#39;tratamiento contra las drogas&#39; y escriba los valores de los puntos de tiempo se añadió el fármaco inmediatamente antes y después (en segundos). </li><li> Haga clic en &#39;ok&#39;, yentrar en el directorio de secuencias de imágenes en la ventana del explorador de archivos. </li></ol> 3. Salida gráfica <ol><li> Descargar R versión 3.0.2 de <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> Abra la versión de 32 bits de R. </li><li> Haga clic en &quot;Archivo&quot;, luego &quot;guión abierto &#39;y seleccione el script de R&#39; traceplot.R &#39;para la generación de informes de experimentación gráfica. </li><li> Instale la calibración, y los paquetes gplots seleccionando &quot;paquetes&quot;, &quot;instalar paquetes&quot;, y la selección de los paquetes appropirate. </li><li> Haga clic en &#39;Archivo&#39; y luego &#39;cambio de directorio &quot;de comandos, y el uso de la ventana del explorador para seleccionar el directorio que corresponde a la salida análisis LC_Pro. </li><li> Haga clic en la ventana de guión y luego el &#39;run all&#39; comando para ejecutar el script. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Descifrando complejos Ca 2 + señales a nivel celular y pluricelular requerirá enfoques experimentales y analíticos rigurosos. Aquí, un enfoque se describe en el cual las secuencias de imagen confocal resueltos de Ca 2 + dependientes de fluorescencia se someten a un análisis automatizado que identifica y cuantifica Ca 2 + señales estadísticamente relevantes dentro de campos celulares intactas en el caso concreto que se presentan, un segmento de la arteria se aisló de corazón de cerdo, con...

Ca 2 + es un segundo mensajero ubicua molécula de señalización y citosólica de Ca 2 + niveles están muy regulados. Intracelular de Ca 2 + señales son complejas e incluyen transitorios aislados, oscilaciones y ondas que se propagan 1-4. Control espacial y temporal de Ca 2 + se cree que subyacen especificidad señal fisiológica, y por lo tanto el análisis de Ca 2 + patrones de señales es de gran interés para los investigadores en múltiples campos 5. Colorantes Ca 2 + indicador como Fluo-4 y Fura-2 se emplean comúnmente para medir Ca 2 + señales intracelulares con microscopía de fluorescencia 5-12. Por lo general, temporales Ca 2 + señales se evalúan los cambios dependientes del tiempo en medio de fluorescencia dentro de un área definida por el usuario, o región de interés (ROI) 5,6,13 - 16. Actualmente, el análisis ROI manual es a la vez tiempo y mano de obra enintensivo, ya que requiere que los usuarios identifiquen muchas regiones de interés y realizar cálculos repetitivos 17-19. Estas técnicas también pueden estar sujetos a considerables errores de los usuarios, incluida la introducción de modos de señal artificiales y la exclusión de las señales difusas 18,20 baja amplitud o. Algoritmos automatizados de detección de ROI se han aplicado anteriormente usando una variedad de métodos estadísticos para determinar la colocación óptima retorno de la inversión, pero por lo general se han limitado al análisis de exploración de línea o pseudo-line imágenes de exploración, lo que restringe el análisis a una sola dimensión espacial en el tiempo 17, 19-22. Además, muchos algoritmos existentes no son suficientes para abarcar la diversidad de Ca 2 + de liberación eventos que van desde, transientes periódicos localizados a las ondas que se propagan a 23,24. Evaluación integral de Ca 2 + señales fisiológicas a menudo se complica aún más por la presencia de Artif imagen significativaacto que confunde señal a ruido de la discriminación en muchos sistemas experimentales. Anteriormente, una solución algoritmo de detección de ROI automatizado para Ca 2 + señal de detección de transitorios, implementado como un plug-in para el software ImageJ NIH (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD), fue desarrollado y validado 25,26. Este algoritmo, llamado LC_Pro, fue diseñado para identificar y analizar los ROIs que abarca Ca 2 + transitorios de señal en secuencias de imágenes de lapso de tiempo de dos dimensiones. Aquí se proporciona un protocolo experimental práctico y demostración representativa de una aplicación del algoritmo en el endotelio de la arteria coronaria porcina, con post-procesamiento adicional utilizando el código abierto estadística software de procesamiento de R para generar una salida gráfica utilizable.

<table><tbody><tr><td>Plato de disección</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td><td>kit de elastómero, debe moldearse en platos</td></tr><tr><td>HEPES-buffered PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>ácido Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>Pinzas</td><td>Herramientas de Ciencia Fina #</td> <td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de tungsteno</td><td>Inst Svcs Científico</td> <td># 406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Tecnología de la vida.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Tech.</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>Alfileres metálicos</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td></td><td></td> inferior de vidrio <td>cubierta</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de disco</td> giratorio diseñado a medida <td>Software Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">descargar en: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>LC_Pro plugin para imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">descargar en: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">descargar en: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot script</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">descargar en: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

análisis automatizado de dinámica ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; las señales en secuencias de imágenes

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracelular de Ca 2 + señales se estudian comúnmente con colorantes fluorescentes Ca 2 + indicadores y técnicas de microscopía. Sin embargo, el análisis cuantitativo de Ca 2 + de datos de formación de imágenes es mucho tiempo y sujetos a sesgo. Algoritmos de análisis de señales automatizadas basadas en región de interés (ROI) de detección han sido implementados para las mediciones de barrido línea unidimensional, pero no hay ningún algoritmo actual que integra la identificación optimizado y el análisis de rendimiento de la inversión en secuencias de imágenes bidimensionales. Aquí se describe un algoritmo para la rápida adquisición y el análisis de rendimiento de la inversión en secuencias de imágenes. Utiliza elipses ajustan a las señales filtradas de ruido con el fin de determinar la colocación óptima retorno de la inversión, y calcula Ca 2 + parámetros de la señal de amplitud, duración y amplitud espacial. Este algoritmo fue implementado como un plugin disponible gratuitamente para ImageJ (NIH) de software. Junto con guiones escritos para el análisis de código abierto de software de procesamiento estadístico R,este enfoque proporciona una tubería de alta capacidad para llevar a cabo el análisis estadístico rápida de la producción experimental. Los autores sugieren que el uso de este protocolo de análisis dará lugar a una caracterización más completa y no sesgada de fisiológica Ca 2 + señalización.

Un algoritmo personalizado, LC_Pro, fue desarrollado e implementado con el fin de realizar el análisis automatizado de Ca 2 + en la dinámica de las secuencias de imagen confocal. Como se muestra en la Figura 1, el algoritmo utiliza los módulos de procesamiento secuencial que A) detectar y yacimientos de huellas de dinámica Ca 2 + cambiar encima estadística (p &lt;0,01) el ruido, B) definir regiones de interés (ROI) de forma automática en los centros del sitio activo, y C) el cálcul...

Aquí una novela región de interés protocolo de análisis basado en la clasificación de las elipses de mejor ajuste asignados a las regiones de la señal positiva dentro de secuencias de imágenes lapso de tiempo de dos dimensiones se demuestra. Este algoritmo puede permitir a los investigadores a analizar exhaustivamente las señales + Ca 2 fisiológicas con intervención mínima del usuario y el sesgo.

Análisis automatizado de Dinámica Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en secuencias de imágenes

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

El objetivo general del siguiente experimento es analizar la actividad del calcio endotelial en arterias coronarias de cerdo mediante el análisis automatizado de regiones de interés (ROI). Esto se logra mediante la disección y apertura de arterias coronarias de cerdo para medir la actividad del calcio endotelial como segundo paso. Se realiza un análisis automatizado de ROI sobre las mediciones de calcio adquiridas, lo que da como resultado una salida resumida de la actividad del calcio.A continuación, se ejecutan secuencias de comandos de software sobre la salida para analizar estadísticamente y representar gráficamente los resultados del análisis de la actividad de calcio. Se obtienen resultados que muestran los parámetros transitorios de la señal de calcio basados en el análisis automatizado de ROI y el procesamiento estadístico. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el análisis manual de ROI, es que el análisis automatizado es más rápido, más exhaustivo y menos propenso a errores del usuario. En este procedimiento, coloque los ventrículos derechos de cerdo recolectados en el platillo de disección A-P-D-M-S con fondo que contiene montones de solución salina fisiológica tamponada.Bajo el microscopio estereoscópico, retire un segmento de la arteria coronaria descendente anterior izquierda separándolo de las capas de tejido cardíaco circundantes. Tenga cuidado de no perforar la pared del vaso. A continuación, coloque el bloque de PDMS en el recipiente de disección y utilice una aguja para fijarlo al fondo.Agregue tampón a la placa. Luego, corte un alambre de tungsteno de aproximadamente 40 micrones de diámetro en 12 segmentos de 0,3 centímetros de longitud para formar micropernos y colóquelos en la placa. Utilice la pinza para fijar un extremo del segmento del vaso al bloque con un microperno.Inserte cuidadosamente las tijeras pequeñas de resorte dentro de la luz del vaso y corte longitudinalmente por un lado del vaso para abrirlo completamente. A continuación, oriente el segmento vascular abierto con el endotelio hacia arriba. Utilice los microalfileres restantes para fijar los bordes del segmento vascular abierto al bloque, de modo que el vaso forme un rectángulo plano.Luego, prepare un mililitro de solución de carga fluoh 4:00 AM. Coloque todo el bloque en la solución de carga durante aproximadamente 40 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Después de la carga, lave el bloque con PSS tamponado durante cinco a 10 minutos. Posteriormente, monte el bloque sobre espaciadores de 50 a 100 micrones de grosor en una cámara con fondo de cubreobjetos que contenga PSS tamponado.Coloque la cámara sobre la platina de un microscopio invertido equipado para imágenes confocales y enfoque la capa de células endoteliales utilizando un software de adquisición de secuencias confocales para capturar secuencias de imágenes de tiempo con la fluorescencia relativa basal durante tres minutos con un aumento de 20x y una velocidad de cuadro de ocho cuadros por segundo. Tras tres minutos de registro de la fluorescencia basal, reemplace la solución PSS tamponada con HEPES por el mismo volumen de solución de sustancia P a 100 picomolares disuelta en PSS tamponada con HEPES y registre durante tres minutos adicionales. En este procedimiento, convierta la secuencia de imágenes de la actividad fluorescente de calcio procedente del software de adquisición confocal en un archivo en formato TIFF de escala de grises de ocho bits sin información de escala.Luego, abra ImageJ. Haga clic en Abrir en el menú Archivo y seleccione la secuencia de imágenes adecuada en la ventana del explorador. Para visualizar la secuencia de imágenes en ImageJ, determine una ROI apropiada utilizando la herramienta de ROI rectangular para estimar los límites superior e inferior de la dispersión espacial de la actividad dentro de la secuencia de imágenes. A continuación, cree una nueva carpeta en el disco duro del ordenador y agregue la secuencia de imágenes al directorio de la carpeta.En Image J, haga clic en la ventana de complementos. Luego haga clic en lc pro. Para comenzar el análisis, ingrese el valor del diámetro de la ROI y seleccione el valor del umbral de filtro después de la palabra.Haga clic en la casilla de verificación del tratamiento con fármacos e ingrese los valores de los puntos temporales inmediatamente antes y después de que se agregó el fármaco. Luego, haga clic en aceptar e ingrese el directorio de la secuencia de imágenes en la ventana del explorador de archivos. En este paso, descargue la versión 3.0 0.2 de R e instálela.Luego abra la versión de 32 bits de R. A continuación, haga clic en Archivo. Después abra el script y seleccione el script de trazado de trazas RR para generar informes experimentales gráficos. Instale los paquetes calibrate y gpls seleccionando Paquetes.Instale los paquetes y seleccione los paquetes adecuados posteriormente. Haga clic en archivo, luego en el comando cambiar directorio y utilice la ventana del explorador para seleccionar el directorio que corresponde a la salida del análisis de lc pro. A continuación, haga clic en la ventana del script y luego en el comando ejecutar todo para ejecutar el script aquí.Las imágenes de lapso de tiempo de una secuencia de imágenes de entrada con un intervalo de muestreo basal seguido de un intervalo de muestreo estimulado por la sustancia P se muestran en secuencias de imágenes de escala de grises. Las mejores lisis para los intervalos basal y estimulado fueron generadas mediante lc Pro, y aquí se muestran las curvas de intensidad escaladas en función del tiempo obtenidas de cada ROI posicionada automáticamente. Los histogramas del pico de amplitud, duración a la mitad del máximo y dispersión espacial máxima para ambos eventos, control y estimulados con la sustancia P, provenientes de un experimento representativo, fueron generados. Se utilizó R para el procesamiento gráfico de la salida de lc Pro.Notablemente, la estimulación con la sustancia P aumentó el número de eventos y provocó un desplazamiento significativo hacia la derecha en la mediana de la amplitud y la duración, según un test de Mann-Whitney U. Al realizar este procedimiento, es importante recordar minimizar los artefactos de imagen debidos al movimiento del plano focal o a ajustes incorrectos del contraste, ya que esto podría afectar en gran medida los resultados del análisis.

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