Name: qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a detectar ADN de citomegalovirus en biopsias gastrointestinales mediante qPCR. Este método sensible mejora el diagnóstico en muestras con resultados equívocos por tinción convencional.

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Reconocemos Amy Thomasson por su ayuda en la preparación de este manuscrito, y Fredrik Skarstedt y Ryan Christy por sus esfuerzos en la preparación de las figuras.

Con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional, se realizó una búsqueda en la base de datos de laboratorio electrónico para identificar fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) bloques que representan los casos de infección por citomegalovirus (CMV) en gastrointestinal (GI) biopsias diagnosticadas por histopatología (hematoxilina y eosina (H &amp; E) y / o inmunohistoquímica (IHC)). 1. Procesamiento de tejido de FFPE GI biopsia de tejido <ol><li> Recoger FFPE GI bloques de tejido de biopsia para el citomegalovirus (CMV) reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Estos bloques se almacenan a temperatura ambiente. </li><li> Tubos Pre-label 1,7 ml de microcentrífuga con número de identificación único de la cuadra. </li><li> Bloquee el volante microtomo. </li><li> Asiente el bloque de tejido en la abrazadera de cassette. </li><li> Utilizando una cuchilla nueva sin usar, alinee el bloque al ángulo cuchillo en el microtomo. </li><li> Ajuste el micrótomo para cortar 10 micras de espesor secciones. </li><li> Desbloquear ªe volante y avanzar el bloque hacia la hoja. </li><li> Cortar 5 secciones del bloque a intervalos de espesor 10 micras, permitiendo que cada corte a rodar en un rollo de tejido. Asegúrese de que cada rollo contiene una representación adecuada de los tejidos de biopsia deseados. </li><li> Bloquee el volante microtomo. </li><li> Con unas pinzas, colocar todos los 5 rollos de tejido en el tubo de centrífuga de pre-marcado, teniendo cuidado de sólo manipular el desplazamiento por la parafina con el fin de reducir el potencial de contaminación cruzada. Coloque la tapa en el tubo y colocarlo de nuevo en el estante. </li><li> Retire el bloque de tejido del microtomo. </li><li> Retire y deseche la hoja. </li><li> Descontaminar las superficies o utensilios que puedan haber estado en contacto con el tejido anterior. </li><li> Coloque una hoja nueva sin usar en el soporte de la cuchilla. </li><li> Repetir los pasos 1.4 a 1.14 para cada bloque adicional para ser procesado. Los tubos de microcentrífuga que contenían los rollos de tejido se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta que el time de la extracción de ADN. </li></ol> 2. Extracción de ADN de Rollos de FFPE GI biopsia de tejido NOTA: Este protocolo es una adaptación del prospecto del kit FFPE tejido de ADN de extracción (PRECAUCIÓN: consulte la Hoja de Seguridad (MSDS)). <ol><li> Añadir 1 ml de xileno (PRECAUCIÓN: Consulte la MSDS) para cada tubo de microcentrífuga muestra. Cierre la tapa y agitar vigorosamente durante 10 segundos. </li><li> Proceder a la extracción de ADN específicamente indicado en el prospecto del producto del fabricante con las siguientes modificaciones. </li><li> En primer lugar añadir 6 l de la de control interno (IC) a cada tubo de microcentrífuga. <ol><li> Después de la ATL / proteinasa K de incubación de lisis a 56 º C durante 1 h, se incuba a 99 ° C durante 30 min, en lugar de 90 ° C durante 1 hora. </li><li> Durante el paso final de elución de ADN, abrir con cuidado la tapa de la columna de purificación de ADN y aplicar 50 l de DNasa / RNasa libre de agua destilada en el centro de la membrana, en lugar de Buffer ATE. NOTA: Consulte el prospecto del envase para el almacenamiento y preparación de reactivos apropiada. ADN debe ser extraído de los 5 rollos FFPE. Realizar todos los pasos de centrifugación a temperatura ambiente (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR para CMV <ol><li> Reacción en Cadena de la Polimerasa Procedimiento (PCR) <ol><li> Generar una hoja de cálculo Excel de PCR para el ensayo de ejecución CMV. Esta hoja de cálculo Excel calcula la cantidad total de cada reactivo necesario para constituir la mezcla principal con Mg. Se multiplica la cantidad de cada reactivo necesario por muestra (enumerados a continuación) veces el número de muestras y controles más uno (para compensar la pérdida debido a la pipeteo). <ol><li> Incluir los siguientes reactivos en cada reacción de PCR en la cantidad que se indican: Reactivo0; Cantidad por la muestra Mix master LC CMV viales 12,5 l Mg solución amarillo vial 2,5 l Volumen total 15,0 l </li></ol></li><li> Incluir en cada ensayo, ejecute un agua o ningún control de destino (NTC), control negativo, control positivo bajo, un alto control positivo, y, o bien QS3 o QS4, y todas las muestras de pacientes. Los capilares deben establecerse en este orden. </li><li> Obtener el bloque de enfriamiento específica para el instrumento de PCR en tiempo real que se almacena a 4 ° C. Colocar los tubos capilares apropiados en el bloque de refrigeración. No toque la superficie de los tubos capilares. Siempre use guantes al manipular los capilares. </li><li> Configure todas las reacciones en cadena de la polimerasa en una campana limpia no contaminada con la producción de amplificaciónts. <ol><li> Retire el número correcto de los viales principales del kit de PCR para probar todas las muestras de los pacientes, además de 5 controles. Deje los viales principales, solución de Mg y PCR grado descongelamiento en agua en el bloque de refrigeración. Cada vial principal contiene suficientes reactivos para 12 pruebas. </li><li> Agite suavemente los viales principales y rápido hacerlos girar en la centrífuga a la máxima velocidad. </li><li> Combine el contenido de cada vial principal en un vial y agite suavemente de nuevo. </li><li> Combine la mezcla maestra y la solución de Mg en las cantidades indicadas en la hoja de PCR en un tubo de microcentrífuga estéril individual. </li><li> Mezclar suavemente y alícuota de 15 l de mezcla maestra con Mg en cada tubo capilar, excepto el capilar en la posición 5, que es para el estándar de cuantificación (QS). </li></ol></li><li> Mueva el bloque de refrigeración que contienen los tubos capilares y maestro de la mezcla con Mg de la campana limpia a una campana de procesamiento. </li><li> Añadir 2 l de control interno (CI) a los restantes 30 l de mastermezclar con Mg. Mezclar suavemente y alícuota de 15 l en el capilar en la posición 5 (posición para el QS). </li><li> De pipeta 10 l de agua, control de ADN, o ADN de la muestra en el tubo capilar apropiado. Tape los tubos capilares utilizando la herramienta de nivelación. </li><li> Tome de refrigeración de bloque / muestras al instrumento de PCR en tiempo real. </li></ol></li><li> Programar el tiempo real de instrumentos PCR (véase la Tabla 1) </li><li> La amplificación y la detección realizada en el instrumento de PCR en tiempo real <ol><li> Inicie sesión en el ordenador </li><li> Doble clic en el icono de instrumento e iniciar sesión en el software. </li><li> Encienda el instrumento de PCR en tiempo real </li><li> Haga clic en &quot;CMV / EBV&quot; en la pantalla frontal. </li><li> Siga las instrucciones del asistente de macro. </li><li> Seleccione la casilla para ejecutar una auto-prueba cuando lo solicite el software. Un auto-prueba debe realizarse una vez al día el instrumento está en uso. </li><li> Nombre de la carrera. </li><li> Ajuste el recuento de muestras ubicado en el lef superiort esquina de la página a la suma de los controles y los pacientes incluidos en el período previo e introduzca el número de identificación de cada muestra. </li><li> Haga clic en la pestaña &quot;Abs Quant&quot;. </li><li> En &quot;Tipo de muestra&quot;, asigne el tipo de muestra adecuado para el estándar. </li><li> Escriba las concentraciones esperadas para el estándar de cuantificación (QS). </li><li> Retire los tubos capilares del bloque refrigerador y colocarlos en la posición correspondiente en el carrusel (refrigeración del bloque de la muestra # 1 debe colocarse en la posición # 1 en el carrusel, etc.) </li><li> Coloque el carrusel en centrifugar y pulse inicio del instrumento. </li><li> Abra centrífuga y quitar el carrusel. </li><li> Coloque el carrusel en el instrumento de PCR en tiempo real. Cierre la tapa. </li><li> Pulse el botón &quot;Ejecutar&quot;. </li><li> El instrumento de PCR en tiempo real comprobará cada posición para una muestra. No te alejes del instrumento hasta que este control se ha completado, espetodo si uno de los capilares no es en el carrusel. El instrumento en cuenta esto y preguntar si la carrera se va a continuar. Conteste sí antes de salir. </li><li> Una vez que el plazo se haya completado, cierre el informe que se ha generado. </li><li> Haga clic en &quot;Absolute cuantificación&quot;. </li><li> Haga clic en la flecha situada junto a Color de Compensación. </li><li> Haga clic en &quot;Seleccionar color de Compensación&quot; en el cuadro desplegable. </li><li> Elija el archivo de compensación de color más actual para aplicar a la carrera. </li><li> Haga clic en Aceptar cuando la caja se abre. </li><li> Haga clic en la flecha de la curva estándar. </li><li> Seleccione &quot;uso externo&quot; en el menú desplegable. </li><li> Seleccione el archivo de curva estándar externa más reciente, haga clic en Aceptar. </li><li> Mire cada curva en el menú absoluta cuantificación para garantizar que las curvas están presentes y no la línea plana, si se asigna una concentración. La cuantificación absoluta para el 705/Back 530 se analiza de forma automática. </li></ol></li><li> QuControl alidad <ol><li> Generar una nueva curva estándar cada vez que se recibe un nuevo número de lote de reactivos, o cada seis meses, lo que es más frecuente. </li><li> Añadir 10 l de cada norma a la mezcla principal con Mg. Tenga en cuenta las normas que se incluyen con el kit como el ADN extraído previamente. </li><li> Añadir 1 l de control interno para cada estándar a la mezcla principal con Mg usado en la generación de la curva estándar con el fin de asegurar la cuantificación exacta. No agregue IC a la mezcla principal con Mg para el Control Template No (NTC). </li><li> Preparar una NTC y tres repeticiones de cuantificación Normas QS 4, 3, 2, 1, y una dilución 1:10 de QS4 para la ejecución para generar la curva estándar, con un total de 16 puntos de datos. </li><li> Seleccione &quot;reproduce las directrices&quot; en el menú desplegable para las normas repetidas </li><li> Elija el canal ninguno 530/back y encienda la compensación de color cuando se analiza la carrera, </li><li> En &quot;Curva Estándar (En ejecución)&quot;, seleccione &quot;guardar como exinterno &quot;y el nombre de la curva. Introduzca el comentario &quot;aplicado como curva estándar&quot; al guardar. </li><li> Representa gráficamente los resultados. El coeficiente de linealidad resultante debe ser ≥ 0,81. </li><li> Para tiradas diarias, incluya una copia de QS3 o QS4 como control en la carrera. La curva de corriente estándar externo se puede importar a la carrera durante la fase de análisis. </li><li> Ejecutar controles: sin control de ADN, control negativo, bajos, y controles positivos altos. Carga viral esperado se determina y se ajusta para cada proveedor y número de lote. </li><li> Añadir un IC a cada muestra y control durante la extracción de ADN. </li><li> Si cualquiera de los controles caen fuera de rango, registre los resultados inaceptables y referir el ensayo para la solución de problemas. </li></ol></li><li> Frecuencia de los controles <ol><li> Incluir en cada carrera: a NTC, positivo alto, y el nivel de control negativo, positivo bajo,. </li></ol></li></ol> NOTA: Los límites aceptables para los controles. Sin picos se deben observard para el sin plantilla (NTC) y controles negativos. Los picos deben estar presentes en el canal 530 y una carga viral esperados son determinados y ajustados para cada proveedor y el número de lote de los controles positivos bajos y altos.

<ol><li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHodinka%2C+RL+%22Manual+of+Clnical+Microbiology%22">Manual of Clnical Microbiology</a>. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).</li>
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<li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection%3A+prognostic+implications+for+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Muchos métodos de laboratorio están disponibles para el diagnóstico de la infección por citomegalovirus (CMV), incluyendo serología, el cultivo viral, los ensayos moleculares de viremia, la histología de las biopsias, y, como se ha demostrado recientemente, ensayos moleculares de fijado en formol (FFPE) biopsia incluido en parafina 5,6 tejido. Serología, una vez a la base del diagnóstico, sólo identifica fiablemente la exposición y no se correlaciona bien con la infección aguda por citomegalovirus 7.</su...

Interpretación de la infección por citomegalovirus (CMV) en muestras clínicas es críticamente importante. CMV es un miembro de la subfamilia Betaherpesvirinae de herpesvirus. Al igual que otros virus de herpes, CMV tiene la capacidad de establecer una infección persistente o latente que se caracteriza por una falta de replicación viral activa 1. La reactivación del virus puede producirse en momentos de estrés o de otro tipo de inmunosupresión, lo que lleva a la replicación viral activa caracterizada por la liberación de viriones, que puede estar acompañado de manifestaciones de la enfermedad 2-4. Gastrointestinal (GI) los síntomas de la enfermedad por CMV con frecuencia incluyen dolor abdominal y / o heces con sangre 1. El diagnóstico de CMV gastroenteritis por histología utiliza hematoxilina y eosina (H &amp; E) para identificar inclusiones virales de CMV. En los casos en que es alto pero no se observan inclusiones obvias sospecha clínica, inmunohistoquímica (IHC) se utiliza con frecuencia como un método de prueba adjunto. Sin embargo, IHCtambién puede verse obstaculizada por los patrones raros no aparecen clásicos de tinción celular (ambiguas), lo que hace difícil la interpretación (Figura 2) 5. Se trató de utilizar ADN extraído de fijado con formalina, embebido en parafina (FFPE) tejido de la biopsia GI y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para detectar CMV en biopsias GI. Esta técnica ha demostrado ser valiosa en la detección de CMV en biopsias GI, y es particularmente útil en los casos de tinción IHC equívocos 5,6. También, qPCR también se ha demostrado que se correlaciona bien con los datos de prueba de CMV clínico adicional cuando está disponible 6. El uso de qPCR para detectar CMV puede llevar a un diagnóstico precoz y el tratamiento en los casos en que la sospecha clínica para el CMV es alta, pero H &amp; E y CMV IHC son negativos.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml Tubos de microfuga Costar</td><td></td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas dentadas</td><td>Servicios de microscopía electrónica</td><td>62086-1S</td><td>Micro pinzas MF-1</td></tr><tr><td>Centrífugas de sobremesa (microfugas)</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: X3P</td><td>1 galón</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: ET108</td><td>96-100% </td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td> CMV LC PCR Supplement Kit Qiagen 1031873 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga LightCycler</td><td>Roche</td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Bloque de enfriamiento</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10800058001</tr><tr><td>Herramienta de taponado LightCycler</td><td>Roche</td><td>3357317</td><td></td></tr><tr><td>Kit de compensación de color</td><td>Roche 2158850</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &mu; l Capilares</td><td>Roche</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas</td><td>Sakura</td><td>Fisher Scientific: 4689</td><td>Accu-Edge de perfil bajo</td></tr></tbody></table>

qpcr es un método sensible y rápido para la detección de adn de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Es crucial para identificar la infección por citomegalovirus (CMV) en el tracto gastrointestinal (GI) de los pacientes inmunodeprimidos, dado su mayor riesgo de desarrollar una infección grave. Muchos métodos de laboratorio para la detección de la infección por CMV se han desarrollado, incluyendo serología, el cultivo viral y métodos moleculares. A menudo, estos métodos reflejan afectación sistémica por CMV y no identifican específicamente la participación del tejido local. Por lo tanto, la detección de la infección por CMV en el tracto gastrointestinal se realiza con frecuencia por la histología tradicional de tejido de la biopsia. La tinción con hematoxilina y eosina (H &amp; E) en conjunción con técnicas de inmunohistoquímica (IHC) se han mantenido los pilares de examinar estas biopsias. H &amp; E e IHC veces resultan en (dudosos) patrones de tinción atípicos, lo que hace difícil la interpretación. Se demostró que la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para CMV con éxito se puede realizar en fijado en formol, tejido de biopsia incrustado en parafina (FFPE) de muyalta sensibilidad y especificidad. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo llevar a cabo las pruebas de qPCR para la detección de CMV en tejido de biopsia FFPE en un laboratorio clínico. Este método es probable que sea de gran beneficio para los pacientes en los casos de la aparición de manchas por CMV en biopsias GI.

Un total de 228 bloques de tejido fueron probados por reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR), que se compone de 91 citomegalovirus (CMV) casos positivos sobre la base de la histología e inmunohistoquímica positiva (IHC), 18 con equívoca CMV IHC, y 79 controles negativos. Como se ilustra en la Figura 2, los casos de CMV positivos se han demostrado inclusiones típicas de CMV virales (A) y / o tinción IHC positivo (B). Casos dudosos se han demostrado patrones...

Este protocolo describe la detección por qPCR de citomegalovirus en tejido de biopsia fijado en formol e incluido en parafina, que es rápido, sensible, específico y útil para interpretar patrones equívocos de tinción de hematoxilina y eosina o inmunohistoquímicos.

qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

El objetivo general del siguiente procedimiento es aumentar la sensibilidad para detectar el ADN del virus citomegalia en biopsias gastrointestinales, particularmente en biopsias que presentan resultados dudosos con los métodos convencionales de tinción. Esto se logra primero cortando y recolectando secciones de tejido de biopsia gastrointestinal incluido en parafina y fijado en formalina. A continuación, se extrae el ADN de las secciones de tejido para su amplificación.Los cebadores específicos amplifican selectivamente cualquier ADN viral del citomegalovirus. Cuando los métodos convencionales utilizados en tejido de biopsia gastrointestinal muestran resultados equívocos, este método sensible puede detectar el ADN viral del citomegalovirus. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos del campo, como la hematina, el andin y la inmunohistoquímica, es que este método no requiere la interpretación de patrones de tinción no clásicos. En la diapositiva que muestra el corte de tejido de biopsia gastrointestinal estará Zainab van Horn, una histotecnóloga del laboratorio, quien demostrará la extracción de ácidos nucleicos, así como el montaje de la R-T-P-C-R en el laboratorio.Rebecca Jocelyn para este protocolo. Tenga listos bloques de tejido de biopsia gastrointestinal en FFPE colocados sobre hielo triturado. Primero, etiquete un tubo microcentrífugo para cada bloque de muestra con el número de identificación del bloque de tejido en el microtomo.Asegúrese de que la rueda manual esté bloqueada y coloque el bloque de tejido en la abrazadera del casete. Asegúrese de utilizar una cuchilla nueva para evitar la contaminación cruzada entre muestras. Es fundamental que utilice una cuchilla sin usar para su primera muestra.Cambie a otra cuchilla entre cada muestra y descontamine el micrótomo entre muestras. A continuación, alinee el bloque con el ángulo del cuchillo y ajuste el grosor de la sección a 10 micrones. Ahora desbloquee la rueda manual y avance el bloque hacia la cuchilla.Corte cinco secciones del bloque a intervalos de 10 micrones, permitiendo que cada sección se enrolle en un rulo de tejido. Asegúrese de que cada rulo contenga una representación adecuada del tejido de biopsia deseado. Una vez cortados los cinco rulos, bloquee la rueda manual.Al transferir los cinco cortes al tubo de centrífuga etiquetado, asegúrese de que la pinza toque únicamente la parafina y no el tejido de forma inmediata. Tape el tubo y luego retire el bloque del sujetador del casete para recoger cortes de la siguiente muestra. Primero, retire y deseche la hoja.Y antes de colocar una cuchilla nueva y sin usar, descontamine todas las superficies que pudieron haber tenido contacto con la muestra anterior. Hasta que las muestras sean procesadas más adelante, pueden almacenarse a temperatura ambiente. El siguiente protocolo se adaptó del kit de extracción de ADN de tejido FFPE.Asegúrese de consultar la hoja de datos de seguridad del material antes de continuar. Comience agregando un mililitro de xileno en cada tubo de muestra y luego vortexe vigorosamente durante 10 segundos. A continuación, siga las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones.Primero, agregue seis microlitros del control interno a cada tubo. Segundo, siga la incubación de lisis con proteinasa K A TL a 56 grados Celsius durante una hora. Incube las muestras a 99 grados Celsius durante 30 minutos en lugar de a 90 grados Celsius durante una hora.En tercer lugar, al completar el paso de elución, en lugar de tampón TE, aplique cuidadosamente 50 microlitros de agua destilada libre de ADN y ARN en el centro de la membrana de la columna de elución. Por último, todos los pasos de centrifugación deben realizarse a temperatura ambiente. Prepare las reacciones en una cabina limpia que no tenga contaminantes de productos de amplificación del kit.Retire suficientes viales maestros y solución de magnesio para las muestras más cinco controles. Cada vial maestro contiene suficiente reactivo para 12 pruebas. Después de descongelar, vortexee los viales maestros y centrifúguelos brevemente a velocidad máxima.A continuación, siguiendo la hoja de trabajo de PCR, combine la solución de magnesio y la mezcla maestra. Mezcle suavemente las soluciones por pipeteo y colóquelas en el bloque de enfriamiento. Añada 15 microlitros de la mezcla a las capilares de ensayo en el bloque de enfriamiento, excepto en la posición cinco.Este capilar se reserva para el estándar de cuantificación. Transfiera el bloque de enfriamiento que contiene los capilares y la mezcla maestra con magnesio desde la cabina limpia a una cabina de procesamiento separada. Añada aquí dos microlitros del control interno a los 30 microlitros restantes de la mezcla maestra.Mezcle la solución pipeteando arriba y abajo, y transfiera 15 microlitros de esta mezcla al capilar en la posición cinco. Luego, agregue 10 microlitros de ADN control de agua o ADN de muestra en el lugar correspondiente. Una vez cargado, tape los capilares con la herramienta de sellado en la centrífuga de capilares.Transfiera los capilares desde el bloque de enfriamiento a la posición correspondiente en el soporte del carrusel. Luego cargue el carrusel en la centrífuga y ejecute el ciclo después de la centrifugación. Transfiera el carrusel al equipo de PCR en tiempo real y realice la reacción más adelante durante el análisis.Visualice los datos utilizando cuantificación absoluta para asegurar que esté disponible una curva para realizar cuantificaciones, con un total de 228. Los bloques de tejido fueron analizados mediante QPCR 91. Los bloques correspondieron a casos positivos para CMV según la histología y la inmunohistoquímica positiva.Dieciocho bloques presentaron un resultado dudoso en C-M-V-I-H-C. Los otros 79 fueron controles negativos. Se demostraron los casos positivos para CMV.Inclusiones virales típicas de CMV y tinción positiva por IHC, o al menos uno de los dos. Los casos dudosos mostraron patrones de tinción no clásicos raros, mientras que los controles negativos no mostraron histología sospechosa ni tinción por IHC de los 91 tejidos positivos para CMV 88. Resultaron positivos por QPCR de los 71 controles negativos, uno resultó positivo para CMV por QPCR.A. Se proporciona en el protocolo escrito una discusión sobre las biopsias con tinción C-M-V-I-H-C equívoca. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la extracción de ADN a partir de tejido de biopsia gastrointestinal fijado en formalina e incluido en parafina, y posteriormente la detección del ADN del virus citomegalico mediante PCR en tiempo real.

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Vamos a demostrar la configuración y el análisis de pre-microRNA-96 y las matrices de QPCR utilizando un robot, así como con la mano con una pipeta de Thermo Scientific multicanal Matrix.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

En este vídeo, las células infectadas con viriones MCPyV fueron sometidas a una reacción en cadena de hibridación in situ para detectar genomas específicos de MCPyV. Además, la técnica de ADN-HCR se combinó con FISH para visualizar el ADN MCPyV en células de piel humana infectadas.

HCR-DNA FISH: Una técnica de hibridación fluorescente in situ para detectar ADN viral en células infectadas

Provided es un protocolo para desarrollar un ensayo de amplificación de polimerasa recombinasa en tiempo real para cuantificar la concentración inicial de muestras de ADN utilizando un termociclador o un microscopio y calentador de etapa. También se describe el desarrollo de un control positivo interno. Se proporcionan scripts para procesar datos de fluorescencia sin procesar en tiempo real.

Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

Los cromosomas de diseño del proyecto Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, se pueden distinguir de sus homólogos nativos utilizando un ensayo de genotipado basado en PCR llamado PCRTagging, que tiene un punto final de presencia/ausencia. Aquí describimos un método de detección de PCR en tiempo real de alto rendimiento para el genotipado de PCRTag.

Análisis qPCRTag - Un alto rendimiento, Tiempo real ensayo PCR para Sc2.0 Genotipado

El objetivo de este video es demostrar cómo llevar a cabo la extracción de ADN automatizado de parafina embebido (FFPE) referencia las líneas celulares estándar fijado en formol y gotita digital de PCR (ddPCR) análisis para detectar mutaciones raras en un entorno clínico. La detección de mutaciones en muestras de FFPE demuestra la utilidad clínica de ddPCR en muestras FFPE.

El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina

El manuscrito describe un ensayo PCR digital basado en el chip para detectar una variante rara de transcripción CDH1 (CDH1a) en congelado normal y los tejidos del tumor obtenidos de pacientes con cáncer gástrico.

Detección de una variante rara transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico congelado por PCR Digital basado en el Chip

Análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real combinado con transcripción inversa (RT-qPCR) ha sido ampliamente utilizado para medir el nivel de infecciones por virus ARN. Aquí presentamos un ensayo de RT-qPCR directo, que no requiere un paso de purificación de RNA, desarrollado para la cuantificación de varios virus de RNA, incluyendo el virus del dengue.

Medición de ARN del Virus del Dengue en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Los marcadores epigenéticos se utilizan para la subtipificación de glóbulos blancos (CMB) mediante la cuantificación de los patrones de metilación del ADN. Este protocolo presenta un método de reacción en cadena de la polimerasa de gotas múltiples (mdPCR) utilizando un dispositivo microfluídico basado en elastómero termoplástico (TPE) para la generación de gotas que permite la cuantificación objetivo precisa y múltiplex específica de metilación de los recuentos diferenciales del CMB.

Metilización Específica Multiplex Droplet PCR usando el Dispositivo Generador de Gotas de Polímero para Diagnóstico Hematológico

Identificación de los mecanismos que subyacen a daño muscular es crucial. Aquí se presenta la técnica histológica para la preparación de parafina y las secciones congeladas de los músculos torácicos Drosophila. Esto permite el análisis de la morfología del músculo y la localización de las proteínas y otros componentes de la célula muscular.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

Aprende a detectar ADN de citomegalovirus en biopsias gastrointestinales mediante qPCR. Este método sensible mejora el diagnóstico en muestras con resultados equívocos por tinción convencional.

qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina (Video) | JoVE Journal

qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina

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