Name: Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprende a realizar un screening de siRNA dirigido para identificar reguladores del sistema ubiquitina en la respuesta a hipoxia mediada por HIF1A en células de mamífero. Este método optimizado es más rápido y económico que los screenings de genoma completo.

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Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) y el Instituto Escocés de Señalización Celular (ahora parte de la fosforilación de la proteína MRC y la unidad Ubiquitylation).

1. Fase de Desarrollo de Ensayos Nota: antes de iniciar la pantalla de siRNA, una etapa de desarrollo de ensayos es fundamental establecer parámetros importantes para el cribado con el reportero línea celular. Es esencial invertir esfuerzo importante en esta etapa, ya que será la base del futuro éxito de la pantalla. <ol><li> Para caracterizar la hipoxia-capacidad de respuesta de U20S-HRE reportero línea celular, creciendo 2 x 75 cm 2 frascos de células U20S-HRE a 80-90% de confluencia en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS. </li><li> Aspirar los medios de comunicación de un matraz de células, se lava dos veces con 10 ml de PBS y separar las células mediante la adición de 2 ml de solución de tripsina-EDTA 0,05% e incubando a 37 ° C durante 5 min. Resuspender las células en 8 ml de DMEM 10% de SFB y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión celular homogénea. </li><li> Pipetear 20 l de la suspensión a una cámara de recuento de células, por duplicado, e inserte la cámara en un cou células automatizadonter. Haga clic en &quot;Mostrar Imagen&quot; en el software del contador de células y asegurar que las células están en foco. Haga clic en &quot;Cuenta&quot; y tome nota de la densidad celular. Repita esto para el otro duplicado y calcular la densidad celular promedio. Diluir las células con DMEM 10% de FBS a una concentración de 60.000 células / ml. </li><li> Con una pipeta multicanal, añadir 100 ml (6.000 células) de las células diluidas a los mismos tres columnas (por ejemplo A5-H5, H6-A6 y A7-H7) de 5 placas de 96 pocillos de ensayo de paredes blancas estériles, y la transferencia a un humidificado 37 ° C incubadora a 5% de CO 2 durante la noche. Nota: estas placas se utilizarán para determinar la salida de la luciferasa hipoxia que dependen de una serie de exposiciones de hipoxia: 0 h, 2 h, 6 h, 10 hy 24 h. </li><li> Al final del día siguiente, anote la hora y agregue la placa de la hipoxia de 24 horas a la estación de trabajo conjunto hipoxia al 1% de oxígeno. A la mañana siguiente, calcule el tiempo de 10 horas, 6 horas y 2 horas antes de que la placa de 24 horas se debe a ser eliminado frOM la estación de trabajo hipoxia. En estos momentos, añadir el 10 horas, 6 horas y 2 placas hr a la estación de trabajo de la hipoxia. </li><li> Preparar 30 ml de 2x tampón de lisis de luciferasa / ensayo combinado (50 mM de Tris fosfato de pH 7,8; 16 mM de MgCl 2; DTT 2 mM; 2% de Triton-X-100; 30% de glicerol; mM de ATP 1; 1% de BSA; 0,25 mM luciferina y 8 mM Na 4 P 2 O 7). Nota: agregar los componentes en el orden de la lista y permitir que la BSA al menos 30 minutos para disolver antes de la adición de luciferina y Na 4 P 2 O 7. </li><li> Eliminar todas las placas de la estación de trabajo de la hipoxia en el momento apropiado. Añadir 100 l de 2x tampón de lisis de luciferasa / ensayo a los pocillos apropiados de la placa de ensayo y cubrir con film transparente. Agitar las placas en un agitador de placas durante 10 min a 500 rpm para lisar completamente las células. </li><li> Transfiera la pila de placas de 96 pocillos a una placa de bastidor automatizado luminómetro. Bajo el menú &quot;Protocolos&quot;, seleccione &quot;abs 595&quot; y poner de relieve todo wells para ser leídos en el mapa de placa en la pantalla del menú &quot;bien la selección&quot;. Haga clic en &quot;Ejecutar&quot; para medir la luminiscencia de cada pocillo y luego calcular el promedio de lectura de cada placa. Calcular la hipoxia que dependen plegable aumento de la actividad del indicador dividiendo el promedio de lectura de cada placa hipoxia por la lectura promedio de la normoxia (0 hr hipoxia) Placa de control. Nota: es esencial observar una robusta respuesta de luciferasa dependiente de hipoxia de ser adecuado para el cribado. A veces más metro setenta y cinco, en la actividad del indicador se considera excelente. </li><li> Crear una placa de control maestro que contiene cuatro (HIF1A siRNA) réplicas (pozos A1-D1), cuatro bajo control (FIH1 siRNA) replica (pozos A12-D12) de alto control, cuatro almacenamientos intermedios sólo controlar repeticiones (pozos E1-H1) y cuatro réplicas de control de siRNA no objetivo (E12-H12), donde todos los grupos de siRNA se encuentran a una concentración de 200 nM. Nota: Los controles de alta y baja se establecen sobre la base de los reguladores de la vía conocidos que aumentan y decrfacilitar la respuesta a la hipoxia, respectivamente. Alternativamente, el desarrollo del ensayo usando un subconjunto de la biblioteca se puede utilizar para identificar los controles adecuados. </li><li> Con una pipeta multicanal, transferir 10 l de cada siRNA control a un blanco placa de ensayo amurallada estéril. Prepare la mezcla de transfección de reactivos de transfección de 0,1 l en 10 l medio reducido de suero (1:100) por pocillo, y la transferencia de 10 l de mezcla de transfección para cada pocillo de control. Pipetear hacia arriba y hacia abajo brevemente para mezclar, y dejar la placa en reposo durante 20 a 60 minutos para permitir la formación de complejos de transfección. </li><li> Preparar una suspensión de células de 75.000 células / ml con el segundo recipiente con células U20S-HRE. Usando una pipeta multicanal, añadir 80 l (6.000 células) de la suspensión celular a cada mezcla de transfección. Colocar la placa en un humidificado incubadora a 37 º C con CO2 al 5% durante 24 horas, luego se transfieren a una estación de trabajo hipoxia durante 24 horas más y realizar ensayos de luciferasa como se describe en los pasos 1.6-1.8. </li><li> Calcular el factor Z para los controles alto y bajo utilizando la fórmula Z = 1 - [3 x (desviación estándar de alta Control + desviación estándar de bajo el control) / (media de control de alta - media de baja de control)]. Nota: un valor de entre 0,5 a 1 indica un excelente ensayo y debe ser esforzó para. </li></ol> 2. Pantalla Principal Nota: una vez que estas condiciones básicas de la etapa de desarrollo del ensayo están en su lugar, la pantalla principal se puede realizar por triplicado en formato de 96 pocillos de la placa usando el siguiente protocolo. <ol><li> Grow 7 x 75 cm 2 frascos de células U20S-HRE a 80-90% de confluencia en DMEM suplementado con 10% v / v de suero bovino fetal (FCS). Nota: Los siguientes pasos 2.2 a 2.13 deben llevarse a cabo en el Día 1. </li><li> Iniciar réplica 1 preparando una placa de control maestro que contiene 200 l de cada control como se describe en el paso 1.9 y descongelación a cabo una serie de diluciones del ubiquitome l siRNAibrary por un mínimo de 30 min. Nota: Cada pocillo contiene una piscina de 4 siRNAs reunidos en 17 placas de 96 pocillos que con las columnas 1 y 12 se deja vacío para los controles. </li><li> En una campana de flujo laminar, la etiqueta (o de código de barras) 17 de paredes blancas placas de ensayo estériles con tapas de los números 1-17, correspondiente a cada placa de la serie de siARN. </li><li> Centrifugar la placa de control maestro y el ARNsi ubiquitome brevemente biblioteca (1 min a 2.000 xg) para asegurar que todos los siRNAs se acumulan en la parte inferior del pozo. </li><li> Utilice un dispensador de líquido automatizado para &quot;estampar&quot; robóticamente 10 l de cada control de la placa de control principal en las 17 placas de ensayo, usando la misma pila de punta de 96 pocillos para cada plato. </li><li> El uso de una pila fresca de 96 pocillos punta para cada una de las 17 placas de biblioteca, la transferencia de 10 l de cada ubiquitome ARNsi a su placa de ensayo correspondiente usando un dispensador de líquido automatizado. </li><li> Preparar 40 ml de reactivo de transfección para las 17 placas de ensayo utilizando los ES relacióntablished en 1.10. Nota: esto incluye un adicional de 20 ml para tener en cuenta el &quot;volumen muerto&quot; en el dispensador de la célula. El &quot;volumen muerto&quot; se refiere al volumen de líquido continuamente presente dentro de la red de tubos en el dispensador de células. </li><li> Utilice un dispensador de células automatizado para transferir 10 l de reactivo de transfección para cada pocillo en las placas de ensayo 17. Brevemente agitar las placas de ensayo en un agitador (1 min a 500 rpm) para permitir la mezcla completa de siRNA y reactivo de transfección, a continuación, dejar todavía a temperatura ambiente durante 20-60 minutos para permitir la ARNsi: la formación de complejos reactivo de transfección. </li><li> Lavar dos matraces de 75 cm2 de células U20S-HRE dos veces con 10 ml de PBS y separar con 2 ml de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 min. Añadir 8 ml de DMEM 10% de FBS a cada matraz y la pipeta arriba y abajo varias veces para crear una suspensión celular homogénea. Combinar las células de ambos matraces y transferir a un tubo de plástico de 50 ml estéril. </li><li> Calcular la concentración de células pipeteando20 células mu l por duplicado a una cámara de recuento de células y calcular la concentración celular media de dos lecturas de un contador automático de células como se describe en el paso 1.3. </li><li> Preparar 155 ml de suspensión de células por dilución con DMEM 10% de FBS a una concentración de 75.000 células por ml en un recipiente de plástico estéril. Nota: este volumen es suficiente para 17 placas y se incluye un adicional de 25 ml para el volumen muerto en el dispensador de células. </li><li> Añadir un agitador magnético estéril a la suspensión celular y el lugar en un agitador instalado en el interior de la campana de flujo laminar para limitar la formación de grumos de células. Equilibrar el dispensador automático de células con la suspensión celular y configurarlo para dispensar 80 l de células por pocillo (6.000 células). </li><li> Coloque cada una de las 17 placas, a su vez, en el dispensador automático de células y dispensar células. Registre el tiempo y las placas de la pila en grupos de 5 a continuación, coloque las pilas en un húmedo 37 ° C incubadora a 5% de CO 2 durante 24 horas. Nota: la concentración final depiscina siRNA será 20 nM en 100 l de volumen total. Nota: Los siguientes pasos 02.14 a 02.15 deben llevarse a cabo en el Día 2. </li><li> Inicie la segunda réplica en el día 2, siguiendo el procedimiento indicado en el Día 1 para la replicación 1 (02.02 a 02.13). </li><li> Después de 24 horas de la transfección, las placas de transferencia de réplica 1 en un ambiente estéril a una estación de trabajo hipoxia fijaron en 1% de oxígeno y dejan durante 24 horas para inducir el reportero EDH. Nota: Los siguientes pasos 02.16 a 02.20 deben llevarse a cabo en el Día 3. </li><li> Inicie la tercera réplica, siguiendo el procedimiento indicado en el Día 1 para la replicación 1 (2.2 a 2.13). </li><li> Después de 24 horas de la transfección, las placas de transferencia de réplica 2 en un ambiente estéril a una estación de trabajo hipoxia fijaron en 1% de oxígeno y dejan durante 24 horas para inducir el reportero EDH. </li><li> Dos horas antes de replicar 1 placas son para ser retirado de la estación de trabajo de la hipoxia, se preparan 200 ml de tampón de lisis 2x luciferasa / ensayo como se describe en 1.6. Nota: este volumen encluye un adicional de 20 ml para asegurar el depósito de regulación se mantiene bien cubierto. </li><li> Retire replicar 1 placas de ensayo de la estación de trabajo de la hipoxia después de la exposición hipoxia 24 horas y el uso de un dispensador de líquido automatizado, añadir 100 l de tampón de lisis 2x luciferasa / ensayo a cada placa de ensayo y cubrir con film transparente. </li><li> Agitar las placas en un agitador de células durante 10 min a 500 rpm para lisar completamente las células. Transfiera cada placa a su vez a un lector de placas luminómetro y luminiscencia registro tal como se describe en el paso 1.8. Nota: Los siguientes pasos 02.21 a 02.22 deben llevarse a cabo en el Día 4. </li><li> Después de 24 horas de la transfección, las placas de transferencia de réplica 3 en un ambiente estéril a una estación de trabajo hipoxia fijaron en 1% de oxígeno y dejan durante 24 horas para inducir el reportero EDH. </li><li> Lea la réplica 2 placas siguiendo los pasos utilizados para la replicación 02.18 a 02.20 1. Nota: el siguiente paso 2.23 debe llevarse a cabo en el Día 5. </li><li> Lea las réplicas de 3 platos siguiendo02.18-02.20 paso utilizado para la réplica 1. </li><li> Compilar los 3 repeticiones de la pantalla principal, y calcular el factor Z de cada placa utilizando la fórmula dada en 1.12. Nota: si cualquier placa tiene un factor Z de menos de 0,5, considerar la repetición de esta placa para mejorar la calidad de los datos. </li><li> Calcular el coeficiente de varianza (CV) para el alta y los controles bajos mediante el uso de la siguiente fórmula: 100 x desviación estándar del control / promedio de control. Nota: CV debe ser lo más bajo posible, es razonable esperar que la variación del 10-15%. Si la variación es significativamente mayor, considere la repetición de la placa. </li><li> Calcular ciento activación de cada siRNA por placa utilizando la siguiente fórmula: [(media de alto control - score siRNA) / (media de alto control - media de baja control)] x 100 Además, el cálculo de las especies no objetivo (NT. ) veces de cada siRNA utilizando la fórmula [Sample data / media de NT]. Por tanto la activación por ciento y NT veces, calcular la media de los tres replicaates y compilar los valores. </li><li> Utilizando los datos en bruto, el cálculo de Posición Coeficiente de correlación de Spearman (SRCC) para determinar cómo de cerca las tres placas replicadas se correlacionan con la fórmula: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51572/51572eq1.jpg" width="120" /> donde r = SRCC; d = diferencia entre los dos números en cada par de filas y n = número de pares de datos. Nota: una buena correlación entre las réplicas de la placa dará valores cercanos a 1 Si una réplica muestra bajo SRCC contra los otros 2 platos, investigar más a fondo y considerar la repetición de ese plato.. </li><li> Decida qué siRNAs son de suficiente interés para la investigación secundaria (hasta el 80). Emplear puntos de corte definidos por el usuario (por ejemplo, la selección de todos los siRNAs que muestran menos del 5% o más del 95% de activación por ciento, o menos de 0,5 NT veces o más de 1,5 veces el NT) o aplicar la bioinformática o razonamiento basado en el conocimiento para buscar grupos de golpea comprendidos en la misma vía de UBL. Nota:normalmente, una combinación de estos enfoques determina que se toman siRNA en el cribado secundaria. </li></ol> 3. Pantalla secundaria Nota: una pantalla secundaria de confirmación se lleva a cabo sobre la base de un máximo de 80 siRNAs de interés desde la pantalla principal. Este número se puede llevar a cabo convenientemente con cada réplica chapada en una sola placa de 96 pocillos con controles completos como por la pantalla principal (ver 2.2). Es muy útil para confirmar que los reguladores identificados en la pantalla principal de manera reproducible provocan el mismo fenotipo, y esto le ayudará a perfeccionar las decisiones de triage en el que golpea debe realizarse a través de la pantalla final terciaria / deconvolución. <ol><li> Grow 1 x 75 cm 2 frasco de células U20S-HRE a 80-90% de confluencia en DMEM con 10% de SFB. </li><li> Anote el número de la placa y la ubicación de los éxitos de la pantalla principal, y planificar su nueva ubicación en la cereza pantalla secundaria recogió la placa principal, dejando las columnas 1, unad 12 libre para los controles. Preparar la placa de control maestro como en 1.9 pero con un volumen total de cada control de 50 l. </li><li> Descongele una segunda serie de dilución de la biblioteca ubiquitome (reservado para piscinas siRNA individuales cherry-picking) por un mínimo de 30 min. Centrifugar brevemente placas (1 min a 2.000 xg) a continuación, añadir 50 l de los siRNAs pantalla secundaria a sus nuevas ubicaciones de la placa en la cereza recogido placa maestra. </li><li> Llevar a cabo la pantalla secundaria utilizando el mismo protocolo básico descrito para la pantalla primaria con las siguientes modificaciones: (a) ejecutar todas las tres repeticiones en el mismo día en una placa de ensayo por repetición y (b) ajustar los volúmenes de reactivos en consecuencia. </li></ol> 4. Terciario Deconvolution Screen / Nota: el cribado terciario o deconvolución se realiza en un máximo de 20 siRNAs de la pantalla secundaria. Este paso es examinar el efecto de la caída en el uso de cada siRNA individuo del poo originalesl de cuatro. Normalmente, al menos, dos dúplex siRNA individuales de cada grupo deben ilícito el mismo fenotipo que tener un grado razonable de confianza de que el fenotipo observado no se debe a siRNA fuera de objetivo efectos. Para aumentar aún más la confianza en esta etapa, dúplex siRNA dirigidos individuales adicionales del gen en cuestión pueden ser diseñados y probados por su capacidad de provocar el fenotipo dado. Los resultados de estos experimentos pueden usarse entonces para calcular la puntuación H, donde H = 0,6 o más (es decir, donde al menos 3 de 5 siRNAs individuales obtener la fenotipo) se considera aceptable 6. <ol><li> Crecer un 75 cm 2 frasco de células U20S-HRE a 80-90% de confluencia en DMEM con 10% de SFB. </li><li> Crear un mapa de la placa de la pantalla superior mediante la planificación de la ubicación de los cuatro dúplex siRNA individuales de cada golpe en la placa principal de pantalla superior, dejando las columnas 1 y 12 libre para los controles. Preparar la placa principal de control como en la 1.9 pero con un totalvolumen de cada control de 50 l. </li><li> Descongelar las placas deconvolución / siRNA individual y añadir 50 l de los siRNAs individuales (200 nM) en cada pocillo de la placa maestra pantalla terciario según el mapa de la placa (4.2) para permitir tres x 10 repeticiones ly un cómodo 20 l exceso . </li><li> Realizar la pantalla superior utilizando el mismo protocolo básico esbozado para la pantalla principal con las siguientes modificaciones: (a) ejecute las tres repeticiones en el mismo día en una placa de ensayo por repetición y (b) ajustar los volúmenes de reactivos en consecuencia </li></ol> Nota: Lo ideal sería que el umbral para ARNsi dúplex individuales debe fijarse en la misma rigurosidad de corte como para la piscina. Sin embargo, puede ser aceptable para relajar el umbral en un 10-20% de siRNAs individuales, especialmente donde al menos otro dúplex cae dentro del umbral establecido. Es cojinete vale la pena en cuenta que el efecto individual de siRNAs puede ser menor que la dela piscina, y por el contrario, en algunos casos siRNAs individuales pueden mostrar un mayor efecto sobre el fenotipo celular en aislamiento que cuando existe en la piscina (incluso cuando la concentración se explica).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de pantallas de siRNA en todo el genoma de células de mamíferos se ha demostrado ser de gran valor en la identificación de nuevos reguladores de las vías biológicas distintas. Aquí, hemos descrito el uso de una pantalla de ARNsi ubiquitome dirigido a identificar reguladores de la respuesta celular mediada por HIF1A a la hipoxia. Pantallas dirigidas están volviendo cada vez más atractivo, ya que son generalmente más baratos, más rápidos, más fáciles de manejar y un informe sólo sobre los componentes de la vía en l...

La modificación de proteínas con ubiquitina y ubiquitina-como las moléculas (Ubls) representa un sistema bioquímico expansiva que regula diversos procesos biológicos y las respuestas al estrés. La unión covalente de UBLs a sus proteínas diana puede tener diversos resultados que regulan la estabilidad, la localización, función o interactoma del sustrato 1. Los pasos enzimáticos subyacentes UBL modificación se establecieron por primera vez para la ubiquitina, y ahora sirven como paradigma para la modificación con la mayoría de UBLs, incluyendo SUMO, NEDD8, ISG15 y FAT10. Para que se produzca la modificación, el grupo carboxilato del motivo diglicina UBL se activa por primera vez por una enzima de activación E1 para formar un tiol de alta energía que se transfiere a la cisteína del sitio activo de una enzima de conjugación E2. El E2 entonces interactúa con un E3 ligase sustrato determinado para mediar la transferencia de la LBM en (generalmente) un residuo de lisina objetivo la creación de una cadena ramificada (isopeptídico) vinculación 2. Las rondas sucesivas de modificación pueden ocurrir para construir cadenas isopeptídicos sobre el sustrato, que para la ubiquitina puede ocurrir a través de cualquiera de sus siete lisinas, o a través de su metionina N-terminal para crear cadenas de ubiquitina lineales. Estas modificaciones forman topologías discretas con diversos fines, tales como la creación de nuevos motivos de interacción y dirigir proteínas para la degradación antes de la remoción UBL por proteasas especializados. En el caso de la ubiquitina hay dos enzimas E1, E2 30-40 enzimas de conjugación, al menos 600 ligasas E3 y aproximadamente 100 enzimas deubiquitylating (DUBS). Mientras que las vías son menos expansiva para las otras 10 o así UBLs, la complejidad general ubiquitome ofrece gran diversidad en el resultado biológico de una modificación particular UBL. Sin embargo, mientras que los principales avances de la biología UBL se han hecho, las funciones celulares precisas de la mayoría de estos componentes ubiquitome siguen siendo desconocidos. El uso de short interfering ácido ribonucleico (siRNAs) ha emergido como una herramienta poderosa en la genética inversa, debido a la capacidad de los siRNAs para dirigirse específicamente a los ARNm celulares para la destrucción, permitiendo que el papel de los genes individuales que se examinó en diferentes contextos biológicos 3. Pantallas de todo el genoma se han utilizado para identificar y validar nuevos reguladores de muchos procesos celulares, y han creado una gran cantidad de datos útiles al alcance de la comunidad científica en general. Sin embargo, mientras que las pantallas de todo el genoma han demostrado ser extremadamente útil, pantallas específicas son cada vez más populares, ya que son más baratos, más rápidos implican menos la gestión de datos y un informe sólo sobre los miembros del genoma en el que el investigador está más interesado. Por lo tanto, para entender mejor los componentes de la familia los procesos celulares UBL están involucrados en, hemos recopilado una biblioteca humana siRNA dirigido todos los conocidos y predijo componentes del ubiquitome. Esto incluye los UBLs, la activación de enzimas E1, E2 conjugaciónenzimas, ligasas E3, dominio de unión a ubiquitina (UBD) que contienen proteínas y DUBs. Esta biblioteca se puede utilizar para la pantalla contra una amplia gama de líneas celulares indicadoras de problemas biológicos distintos, permitiendo así la identificación imparcial de componentes UBL novedosos que rigen estas vías. El siguiente protocolo describe cómo realizar una rigurosa siRNA dirigidos ubiquitome pantalla para identificar nuevos reguladores de la respuesta HIF1A dependiente a la hipoxia. Bajo la tensión de oxígeno normal, HIF1A está sujeta a hidroxilación prolilo que hace que sea reconocida y destinada a la degradación por el Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligase complejo 4. La hipoxia inhibe la hidroxilación prolil que conduce a la estabilización de HIF1A y su posterior unión a elementos de respuesta a la hipoxia (HRE) para conducir la expresión de genes. Aquí, se describe una pantalla utilizando células de osteosarcoma U20S de forma estable que expresa luciferasa de luciérnaga bajo el control de tres copias en tándem de la Hypoxia Elemento de Respuesta (células U20S-HRE) 5. Este protocolo se puede adaptar para cualquier vía biológica si un robusto lectura de salida de la actividad del indicador es alcanzable y se puede acoplar con controles positivos y negativos apropiados.

<table><tbody><tr><td>Dosificador de líquido automatizado</td><td>Fluid-X</td><td>XPP-721</td><td>http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td></tr><tr><td>blanco Placa de ensayo de pared</td><td>Greiner Bio One</td><td>655083</td><td>http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td></tr> <tr><td>Película de placa transparente</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-461</td><td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td></tr><tr><td>biblioteca de siRNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>On-Target Plus</td><td>http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/</td></tr> <tr><td>Reactivo de transfección</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamine RNAimax</td><td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td></tr><tr><td>Suero Reducido Medio</td><td>Invitrogen</td><td>Optimem http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41965-039</td><td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td></tr><tr><td>Tryspin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td></tr></tbody></table>

screening sirna para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Modificación posterior a la traducción de las proteínas con ubiquitina y ubiquitina-como las moléculas (Ubls) se está convirtiendo en una red de señalización celular dinámica que regula diversos procesos biológicos, incluyendo la respuesta a la hipoxia, proteostasis, la respuesta al daño del ADN y la transcripción. Para entender mejor cómo UBLs regulan las vías pertinentes a la enfermedad humana, hemos recopilado un siRNA humana &quot;ubiquitome&quot; biblioteca que consta de 1.186 piscinas siRNA dúplex dirigidos todos conocidos y predijo componentes de las vías del sistema de UBL. Esta biblioteca se puede criba frente a una gama de líneas celulares que expresan los reporteros de diversas vías biológicas para determinar qué componentes UBL actúan como reguladores positivos o negativos de la vía en cuestión. Aquí se describe un protocolo que utiliza esta biblioteca para identificar ubiquitome-reguladores de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia mediante un indicador de luciferasa basado en la transcripción. Una etapa inicial de desarrollo de ensayosse lleva a cabo para establecer los parámetros de detección adecuados de la línea celular antes de realizar la pantalla en tres etapas: detección / deconvolución primaria, secundaria y terciaria. El uso de objeto a través de siRNA bibliotecas de todo el genoma se está convirtiendo cada vez más popular, ya que ofrece la ventaja de la cobertura del sólo miembros de la vía con la que los investigadores están más interesados. A pesar de las limitaciones inherentes de la detección siRNA, en particular, los falsos positivos causados ​​por siRNA fuera de objetivo efectos, la identificación de auténticos nuevos reguladores de las vías en cuestión superan estas deficiencias, que pueden ser superadas mediante la realización de una serie de experimentos de control llevadas a cabo cuidadosamente.

Antes de la detección, se establece la hipoxia-respuesta de las células U20S-HRE. Células U20S-HRE expresan un constructo indicador que consiste en la luciferasa de luciérnaga fundida aguas abajo de tres copias en tándem del elemento de respuesta a la hipoxia, que está obligado por el heterodímero HIF1A/HIF1B tras la exposición a la hipoxia (Figura 1A). Las células se colocan en una estación de trabajo hipoxia para una serie de veces para establecer que la exposición hipoxia produce la respuesta más efi...

Aquí se describe una metodología para llevar a cabo un siRNA dirigidos pantalla &quot;ubiquitome&quot; para identificar nuevos ubiquitina y reguladores-ubiquitina de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia. Esto puede ser adaptado a cualquier vía biológica, donde una lectura robusta de la actividad del indicador está disponible.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar la participación de nuevos componentes de la ubiquitina y sistemas modificadores similares a la ubiquitina en las vías biológicas, utilizando como ejemplo la respuesta de hipoxia dependiente de HF un alfa. Esto se logra optimizando primero la respuesta de la línea celular reportera a la hipoxia del estímulo ambiental, de modo que sean adecuadas para el cribado. El segundo paso del procedimiento es establecer los controles alto y bajo para proporcionar un factor Z adecuado para el cribado.Con los parámetros establecidos, el cribado primario de irna se realiza por triplicado, tras lo cual se confirman los aciertos mediante cribados de deconvolución secundarios y terciarios. En última instancia, los resultados pueden revelar nuevos reguladores del sistema de ubiquitina y similares a la ubiquitina de la vía biológica en cuestión. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como el cribado de Irna del genoma completo, es que el cribado es más rápido, más fácil de realizar, menos costoso, e informa únicamente sobre los miembros de la vía bioquímica en los que el investigador está más interesado en caracterizar.La capacidad de respuesta a la hipoxia de la línea celular reportera U2 O-S-H-R-E tiene listo un matraz cuadrado de 2 75 centímetros de células en DMM con 10% FBS. Cuando las células estén al 80 o 90% de confluencia, aspire el medio de un matraz y lave esas células dos veces con 10 mililitros de PBS. Los trips anizan las células y las resuspenden en ocho mililitros de DMM con un 10% de FBS, hacen que las células sean homogéneas con una pipeta y obtienen un promedio de dos recuentos de células, luego diluyen las células a 60, 000 por mililitro.A continuación, utilizando una pipeta multicanal, añada 6.000 células a tres columnas de cinco placas de ensayo de 96 pocillos de paredes blancas e incube las cinco placas durante la noche mientras incuba para superar los efectos de borde. Coloque un papel de seda húmedo en la base de los platos y coloque una bolsa de plástico rígida y transparente sobre la pila de platos al final del día siguiente. Anote la hora y transfiera una placa a la estación de trabajo de hipoxia configurada en 1% de oxígeno.A continuación, traslade una placa a la estación de trabajo de hipoxia a las 14, 18 y 22 horas después de iniciada la incubación. A continuación, prepare 30 mililitros de tampón de lisis de luciferasa. Asegúrese de que el BSA se disuelva durante al menos 30 minutos en el tampón antes de agregar Lucifer y pirofosfato de sodio.24 horas después de la primera edición de la placa, descargue la estación de trabajo de hipoxia y agregue 100 microlitros del tampón preparado a cada pocillo cargado de las placas de ensayo para cortar completamente las células. Cubra los platos con film transparente y agítelos durante 10 minutos. A 500 RPM, ahora transfiera las placas en una pila al lector automático de placas en el software.Seleccione el menú de protocolos y elija un BS 5 95. A continuación, resalte todos los pozos que se van a leer en el menú de selección de pozos. Haga clic en la función de ejecución y calcule la actividad promedio del reportero por placa.A continuación, normalice los datos a las lecturas de la placa sin tratamiento de hipoxia. Una respuesta robusta a la hipoxia es esencial para el ensayo y el aumento de diez veces en la actividad del informe es excelente. Proceda configurando los controles y calculando el factor Z.La etapa de desarrollo del ácido es la parte más crítica del procedimiento de detección. Es importante tener una respuesta fenotípica robusta de la línea celular junto con buenos controles de gama alta y baja. Esto asegurará que la pantalla IRNA sea un éxito.Realice el cribado primario por triplicado utilizando el formato de 96 pocillos. Siete frascos confluentes de células serán suficientes. Comience descongelando una serie de diluciones de la biblioteca de ubiquitina del ARN SI durante al menos 30 minutos bajo un capó.A continuación, haga una placa de control maestra con cuatro réplicas de 200 microlitros de 200 nano molares SI. Rnas. Cargue cuatro pozos con un control alto, cuatro pozos con un control bajo, cuatro pozos con un control de solo amortiguamiento y cuatro pozos con un control IRNA no objetivo. Siguiente etiqueta, 17 placas de ensayo de paredes blancas entre las columnas de control.Cada pocillo se carga con un grupo de cuatro siRNAs dirigidos a este mismo ARNm. Para asegurarse de que las soluciones en la placa de control maestra y las placas de biblioteca se agrupen en la parte inferior de cada una, gire las placas durante un minuto a 2000 gs. Luego, usando un dispensador automático, transfiera 10 microlitros de cada pocillo de control en la placa maestra a cada una de las 17 placas etiquetadas.A continuación, utilice el dispensador automático para transferir 10 microlitros de cada grupo de ARN SI de las placas de la biblioteca a una placa de ensayo. Prepare 40 mililitros de reactivo de transfección en la proporción predeterminada utilizando el dispensador Transfiera 10 microlitros a cada pocillo de las 17 placas de ensayo. 40 mililitros proporcionan suficiente volumen muerto para el sistema dispensador.Después de cargar el reactivo de transfección, agite las placas durante un minuto a 500 RPM. A continuación, déjelos incubar durante 20 a 60 minutos para formar los complejos reactivos de transfección S-I-R-N-A. Ahora lave 2 matraces cuadrados de 75 centímetros de pilas U2 O-S-H-R-E con 10 mililitros de PBS cada uno.A continuación, los tritones anizan las células y las resuspenden en ocho mililitros de DM EM con FBS, combinan ambas colecciones de células en un tubo de plástico de 50 mililitros. A continuación, calcule la densidad de células como antes. Utilice el valor para preparar una suspensión de 155 mililitros de células a 75.000 por mililitro.Este volumen es suficiente para cargar las placas y llenar el volumen muerto del dispensador debajo del capó. Mantenga las células agitadas con la agitación magnética. Usando el dispensador automático, cargue 80 microlitros de celdas en cada pocillo de las placas de reacción.Cada reacción preparada. Well ahora contiene 100 microlitros con los ARN del SI a 20 nano molares. Registre el tiempo y apile las placas en grupos de cinco en una incubadora de 37 grados centígrados.Deje que las placas se incuben durante 24 horas durante los próximos dos días. Inicie las dos réplicas de estas 17 placas de reacción. 24 horas después de la transferencia de la transfección, las placas de reacción a la estación de trabajo de hipoxia.Incubar las placas bajo 1% de oxígeno durante 24 horas para inducir el reportaje al día siguiente, dos horas antes de que se complete el período de hipoxia. Prepare un tampón de ensayo de lisis de luciferasa fresco como antes, 200 mililitros son suficientes para 17 placas. Después de retirar las placas del entorno hipóxico, utilice el dispensador automático para cargar cada pocillo con 100 microlitros del tampón de ensayo.Luego cubra cada placa con una película transparente y cárguelas en la coctelera agitando a 500 RPM durante 10 minutos. Las células se lisarán a fondo. Ahora proceda con la lectura de las placas como se detalló anteriormente.Analice los datos tomados por triplicado, e identifique irna de interés para las siguientes cribas. Las células verdes U2 O-S-H-R-E contienen un indicador de luciferasa de luciérnaga fusionado con tres copias posteriores del elemento de respuesta a la hipoxia. Estos elementos están unidos por heterodímeros HIF uno alfa HIF uno beta, que son abundantes durante la hipoxia.La capacidad de respuesta a la hipoxia de estas células se determinó antes del cribado con la biblioteca I a utilizando el protocolo descrito. 24 horas de hipoxia indujeron un aumento de diez veces en la expresión de luciferasa con respecto al valor basal. Se seleccionaron Hi F1 alpha y FIH one I a como las celdas de control bajas y altas.Los transfectados con estos controles mostraron un 10% o 170% de la señal basal de luciferasa después de 24 horas de hipoxia. A continuación, las células se transfectaron con la biblioteca IRNA de ubiquitina y se expusieron a oxígeno al 1% durante 24 horas. Al analizar las placas de reacción, se obtuvo un factor Z deseable superior a 0,5 para cada placa.Los valores de cada placa se mostraron mediante un diagrama de dispersión, la pantalla principal registró valores entre los controles alto y bajo. Como era de esperar, hubo aproximadamente el mismo número de reguladores IRNA positivos y negativos, mientras que la mayoría no tuvo un efecto significativo en el reportero, las pantallas secundarias y terciarias continuaron este estudio, los detalles sobre los cuales se dan en el protocolo de texto. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una prueba de detección de irna dirigida para identificar los componentes de los sistemas de ubiquitina y lago de ubiquitina que regulan su vía biológica específica de interés.Proporcionando así un punto de partida para futuras investigaciones.

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Ubiquitinación es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Las mutaciones de los genes implicados en esta modificación se asocian con muchas enfermedades humanas diferentes. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células...

La detección de ubiquitinación de proteínas

El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.

Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

Aquí describimos un ensayo de genes reporteros basado en células como una herramienta valiosa para examinar bibliotecas químicas en busca de compuestos que modulan los mecanismos de control postranscripcional ejercidos a través de 3' UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

El actual protocolo detalla un método para medir la actividad de las enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializadas modifican covalentemente la enzima y permiten la detección. Este método tiene el potencial de identificar nuevas dianas terapéuticas.

Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.

Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones

Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de ubiquitilación de un sustrato específico y una ubiquitina ligasa E3 en células de mamíferos. Se utilizaron líneas celulares HEK293T para la sobreexpresión de proteínas, el sustrato poliubiquitilado se purificó a partir de lisados celulares por inmunoprecipitación y se resolvió en SDS-PAGE. Se utilizó immunoblotting para visualizar esta modificación post-traduccional.

Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

El experimento utilizado aquí muestra un método de acoplamiento molecular combinado con tecnologías de sonda para predecir y validar la interacción entre pequeñas moléculas de la medicina tradicional china y objetivos proteicos.

Detección de compuestos de la medicina tradicional china para inhibir la actividad de UCHL3 basada en la tecnología de sonda de enzimas de acoplamiento molecular y desubiquitinación

La ubiquitinación es un regulador crítico de las funciones intracelulares de las proteínas. Aquí describimos dos métodos de lisis celular para detectar los niveles de ubiquitinación de proteínas del sustrato en células de mamíferos y comparamos su eficacia para analizar los niveles de ubiquitinación. La sobreexpresión de proteínas en HEK293T células fue inducida por transfección transitoria, y proteínas ubiquitinadas fueron detectadas mediante análisis de western blot.

Estrategias comparativas para la detección de ubiquitinación en lisados celulares de mamíferos utilizando SMAD2/SMURF2 como modelo

Aprende a realizar un screening de siRNA dirigido para identificar reguladores del sistema ubiquitina en la respuesta a hipoxia mediada por HIF1A en células de mamífero. Este método optimizado es más rápido y económico que los screenings de genoma completo.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo (Video) | JoVE Journal

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

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