Name: Electrospun fibroso Andamios de poli (glicerol-dodecanodioato) de Ingeniería Neural Los tejidos de las células madre embrionarias de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende a fabricar fibras electrohiladas de poli(glicerol-dodecanodioato) para ingeniería de tejidos neuronales usando células madre embrionarias de ratón. Este método demuestra la viabilidad de estos andamios biodegradables.

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Este trabajo se llevó a cabo utilizando las instalaciones del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Internacional de la Florida.

1. Configuración Electrohilado Collector <ol><li> Cortar el papel de aluminio en una pieza rectangular. </li><li> Doble la pieza rectangular en una tira rectangular, y adjuntarlo perpendicular a una placa metálica plana con cinta (Figura 1). Nota: El tamaño de la estera de fibras depende de la longitud y la anchura de la tira. Por lo tanto, las dimensiones de la tira se pueden ajustar según sea necesario. </li></ol> 2. Polimérico Preparación de la Solución <ol><li> Mezclar glicerol y ácido dodecanodioico (DDA) en una relación molar 1:1 en un vaso de precipitados a 120 ° C durante 100 h para obtener polímero de PGD. </li><li> Disolver poli (óxido de etileno) (PEO) y gelatina en etanol 65% con una relación en peso de 1.5:3:95.5 en un tubo de 15 ml, apretar la tapa y calentar la mezcla en un horno a 60 ° C durante 1 hora con agitación hasta que se convierte en una solución homogénea (solución basal). </li><li> Para electrospinning, mezclar el polímero PGD y la solución basal en 04:06 relación de pesos. Nota: La concentración PGD tiene un big efecto sobre diámetro de la fibra. 30% -50% por ciento PGD es aceptable para producir fibras de más de 5 cm con mayores diámetros de las fibras. </li><li> Añadir 0,1% de riboflavina a la solución polimérica y mezclar bien. </li></ol> 3. Electrohilado <ol><li> Alimentar a la solución polimérica en una jeringa estándar de 5 ml con una aguja de 18 G romos de acero inoxidable. </li><li> Inserte la jeringa en una bomba de jeringa. </li><li> Una el plomo a tierra de una fuente de alimentación de alta tensión a la placa metálica y el cable de carga positiva a la aguja. </li><li> Ajustar la distancia entre la aguja y la tira de papel de aluminio a 15 cm. </li><li> Coloque la bomba de jeringa en un ángulo de aproximadamente 15 ° con la horizontal para evitar la agregación de las fibras en la parte delantera de la tira. </li><li> Encienda la bomba de jeringa y ajustar la velocidad de flujo de la bomba a 0,6 ml / h. </li><li> Encienda la fuente de alimentación de alta tensión y ajustar la tensión de funcionamiento a 14,6 kV. </li></ol> 4.Procesamiento de Fibra <ol><li> Después de la colección es completa, exponer la esterilla de fibra a luz UV durante 60 min para la reticulación. </li><li> Transfiera la estera de fibra de la tira de papel de aluminio para un 100 mm placa de Petri, y exponerlo a la luz UV durante otros 20 minutos para la esterilización. </li><li> En un gabinete de bioseguridad, corte la estera de fibra en pedazos redondos del mismo tamaño, con una hoja de bisturí y colocar las piezas en una placa de 24 pocillos. </li><li> Para celda de tratamiento de pre-siembra, sumerja las muestras de fibra en 1 ml de tampón fosfato salino (PBS) y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Al día siguiente, aspirado PBS con cuidado, añadir 1 ml de medio de diferenciación (DMEM/F12, N2, y FGF2) (vea la receta en la tabla de materiales) a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 3 horas. </li><li> Medio de diferenciación Aspirar cuidadosamente, añadir 0,2 ml de Matrigel a cada muestra de fibra y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Nota: La laminina también puede ser utilizado para el recubrimiento de fibra. Añadir 0,2 ml de 20 mg / ml de lamininaa la fibra y se incuba a temperatura ambiente durante 3 h. </li><li> Eliminar cuidadosamente el exceso matrigel de cada pocillo. Enjuague con 2 ml de medio de diferenciación una vez. Nota: Las muestras de fibra están listos para el cultivo celular. </li></ol> 5. Siembra de células en fibras <ol><li> Añadir 1 ml de Accutase a la placa de cultivo celular MES y se incuba durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Después de 10 min, las células TEr se separan de la placa de cultivo. Añadir 4 ml de medio de diferenciación a la placa. Recoger las células TEr flotantes en un tubo de 15 ml y las células de la pipeta hacia arriba y abajo para romper colonias (aproximadamente 15x). </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min y volver a suspender las células en 4 ml de medio de diferenciación. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro. Transferir 200 l de la suspensión celular en un tubo de 15 ml y diluir 10 veces con medio de diferenciación. Transferir 15 l de la suspensión celular diluida a una cámara en el hemocitómetro con un cubre en su lugar. Contarlas células en la plaza del centro de 1 mm y las cuatro esquinas del hemocitómetro bajo el microscopio. Nota: la célula por ml = el recuento promedio por metro cuadrado x el factor de dilución x 10 4 </li><li> Coloque aproximadamente 5 x 10 4 células TEr en cada pocillo. Lentamente gota la suspensión celular en el medio de las muestras de fibra, en vez de deslizarse a un lado del pozo, para evitar que la solución se drene fuera de la estera de fibra. </li><li> Añadir 1 ml de medio de diferenciación a cada pocillo, y mantener la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 para permitir la unión de células, el crecimiento y la diferenciación. </li><li> Aspirar el viejo medio de cada pocillo y sustituir con 1 ml de medio de diferenciación fresca cada dos días. </li></ol> 6. Viabilidad de las células <ol><li> Aspirar el viejo medio de cada pocillo. </li><li> Mezclar 1/10 volumen de resazurina reactivo de fluorescencia con medio de cultivo y añadir 1 ml a cada pocillo. </li><li> IncubComimos en 37 ° C y 5% de CO 2 durante 4 horas, protegido de la luz directa. </li><li> Después de 4 horas, la transferencia de 100 l 3x del reactivo de cada pocillo a una placa de 96 pocillos, y luego las muestras están listas para ser medido en un espectrofotómetro de fluorescencia utilizando los ajustes de filtro 560EX nm/590EM. </li></ol> 7. En tiempo real PCR <ol><li> Después de 14 días de cultivo, añadir tampón de lisis a las muestras y aislar ARN total de las células en las muestras de fibra. </li><li> Utilice 4 l de ARN total para sintetizar cDNA en 20 escalas de reacción mu l mediante transcripción inversa. </li><li> Preparar la mezcla de PCR reacción en cada tubo óptico: 10 l de mezcla maestra (2x), 0,2 l de colorante, 8 l agua libre de nucleasa, 1 l de ADNc, y 1 l de cebadores (primers utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1). </li><li> Configure el programa de PCR: a. 95 ° C 2:20 min, 1 ciclo b. 95 ° C 3 seg → 60 ° C 1 min, 40 ciclos c. 95 ° C 15 seg, 1 ciclo d. 60 ° C 1min, 1 ciclo e. 95 ° C 15 seg, 1 ciclo. Elija comparativo C T método para determinar los niveles de expresión génica relativa. </li><li> Después de la PCR está terminado, analizar los resultados en tiempo real de PCR con el software StepOne y exportar los resultados a Excel. </li></ol>

<ol><li>Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28glycerol-dodecanoate%29%2C+a+biodegradable+polyester+for+medical+devices+and+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds.</a> Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las limitaciones de los colectores simples o las complejidades de los colectores que se utilizan actualmente para electrospinning aumentar la restricción de obtener la longitud deseada y el tamaño de la estera de fibra para algunas aplicaciones de rotación. Además, la transferencia de fibras desde el colector de tierra a la placa de cultivo o de otros sustratos es un desafío 5. En este informe, un coleccionista de nuevo diseño, hecho simplemente uniendo una tira de papel de aluminio para el colector a tierra,...

Electrospinning es uno de los métodos de procesamiento eficaces para producir andamios de fibra de tamaño micro-a nanómetros. El principio básico de electrospinning implica un cono de Taylor de la solución que se mantiene en el orificio de una aguja, mediante la aplicación de alto voltaje entre la punta de la aguja y un colector a tierra. Cuando la repulsión electrostática en la solución supera la tensión superficial, un chorro de fluido cargado se expulsa fuera de la punta de la aguja, viaja por el aire con la evaporación del disolvente, y finalmente se deposita en el colector conectado a tierra. La bomba de jeringa proporciona un flujo continuo de la solución que emerge de la hilera y por lo tanto múltiples copias de las fibras electrohiladas se puede fabricar dentro de un corto período de tiempo. Durante el curso de salir de la hilera para llegar al colector, el chorro cargada someterse a estiramiento y batir según un número de parámetros que incluyen la viscosidad y la tensión superficial de la solución polimérica, los electrostáticamentefuerza de C en la solución, y la interacción del campo eléctrico externo, etc 2. En el proceso de electrospinning, un colector sirve como un sustrato conductor, donde las fibras micro-a nanómetros podrían ser depositados. En este estudio, un nuevo tipo de colector de fibras fue diseñado para obtener esteras de fibra con el tamaño deseado (longitud x anchura). Tradicionalmente, el papel de aluminio se utiliza como un colector pero es difícil de transferir las fibras de la superficie plana a otro sustrato. La dificultad de la recolección de una manta de fibra intacta de un coleccionista tradicional se debió principalmente al hecho de que las fibras se adhieren fuertemente electrohiladas a la superficie del colector. Por lo tanto, hemos modificado el colector doblando un pedazo de papel de aluminio en una tira rectangular y lo conecta perpendicularmente a una placa metálica plana. Las fibras electrohiladas se estiran a través del área entre la punta de la tira y la placa de metal, que se puede transferir fácilmente a otro sustrato dee. El interés en los polímeros elastoméricos reticulados térmicamente está creciendo rápidamente debido a la labor pionera del grupo de Robert Langer, quien presentó poli (sebacato de glicerol) (PGS), un poliéster que es análogo al caucho vulcanizado en 2002 3. Similar a PGS, hemos desarrollado con éxito poli (glicerol-dodecanoato) (PGD) por condensación térmica de glicerol y ácido dodecanodioico y demostraron su única propiedad con memoria de forma 1. A diferencia de más rígido materiales sintéticos de poli (butirato de hidroxilo) o poli (L-lactida) (módulos de Young de 250 MPa y 660 MPa, respectivamente), PGD exhibe la propiedad de elastómero como el caucho, con un módulo de Young de 1,08 MPa cuando la temperatura está por encima de 37 ° C, que es una coincidencia cercana a la de los nervios periféricos in situ (0,45 MPa). Además, PGD es biodegradable y el tiempo de degradación puede ser ajustado por la variación de la proporción de glicerol y ácido dodecanodioico. Ácido dodecanodioico es un sub doce de carbonopostura con dos grupos carboxílicos terminales, HOOC (CH2) 10 COOH. Ácidos dicarboxílicos con número par, como el ácido sebácico y ácido dodecanodioico pueden ser metabolizados a acetil-CoA y entrar en el de los ácidos tricarboxílicos (TCA) / ciclo (ácido cítrico). El producto metabólico de los ácidos dicarboxílicos, succinil-CoA reductasa, es un precursor gluconeogenética y el intermedio de ciclo TCA 4. Por lo tanto, algunos estudios sugieren que podrían ser utilizados como un sustrato de combustible alternativo para la nutrición enteral y parenteral, especialmente en las condiciones patológicas. Además, el DGP presenta memoria de forma única, ya que su temperatura de transición vítrea es de 31 ° C, por lo tanto, muestra propiedades mecánicas distintas a temperatura ambiente y a la temperatura corporal. En suma, PGD es biodegradable, biocompatible, que presenta propiedades elásticas únicas con propiedades mecánicas similares a los tejidos nerviosos; Por lo tanto, es un material adecuado para aplicaciones de ingeniería de tejido nervioso. En este protocolo, el electrospunfibras largas que cubren un área de gran depósito fueron fabricados por el captador de nuevo diseño de PGD. Los andamios de fibra pueden apoyar el crecimiento de células madre pluripotentes de ratón y la diferenciación.

<table><tbody><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Ácido dodecanodioico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1009</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1890</td><td></td></tr><tr><td>Poli(óxido de etileno) (PEO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>132350250</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Células</td> <td>madre embrionarias de ratónGlobalStem</td><td>GSC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30272.02</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1%</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Colorante de fluorescencia de resazurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62758-13-8</td><td></td></tr><tr><td>SV Sistema de aislamiento de ARN total</td><td>Promega</td><td>Z3100</td><td></td></tr><tr><td>GoScript Sistema de transcripción inversa</td><td>Promega</td><td>A5000</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix Promega</td><td></td><td>A6001</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>14-831-200</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de alto voltaje&nbsp;</td><td>Spellman High Voltage Electronics Corporation</td><td></td><td>SL30</td></tr><tr><td>Luz UV</td><td>Philips</td><td>308643</td><td>15W/G15T8</td></tr><tr><td>Synergy HT Lector de microplacas multimodo</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Sistema de PCR GeneAmp 9600</td><td>Perkin Elmer</td><td>8488</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376357</td><td></td></tr></tbody></table>

electrospun fibroso andamios de poli (glicerol-dodecanodioato) de ingeniería neural los tejidos de las células madre embrionarias de ratón

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Para aplicaciones de ingeniería de tejidos, la preparación de estructuras biodegradables y biocompatibles es la tarea más deseable pero desafiante. Entre los diversos métodos de fabricación, de electrospinning es la más atractiva debido a su simplicidad y versatilidad. Además, las nanofibras electrohiladas imitan el tamaño de la matriz extracelular natural, garantizando un apoyo adicional para la supervivencia y el crecimiento celular. Este estudio demostró la viabilidad de la fabricación de fibras largas que abarcan un área de depósito más grande para un nuevo polímero biodegradable y biocompatible llamado poli (glicerol-dodecanoato) (DGP) 1 mediante el uso de un colector de nuevo diseño para electrospinning. PGD ​​exhibe propiedades elásticas únicas con propiedades mecánicas similares a los tejidos nerviosos, por lo que es adecuado para aplicaciones de ingeniería de tejidos neuronales. La síntesis y fabricación de puesta a punto para la fabricación de materiales de andamios fibrosos era simple, altamente reproducible y de bajo costo. En biocompatibilidadlas pruebas, las células derivadas de células madre embrionarias de ratón podrían adherirse y crecer en las fibras de PGD electrospun. En resumen, este protocolo proporciona un método de fabricación versátil para la fabricación de fibras electrohiladas PGD para apoyar el crecimiento de las células madre embrionarias de ratón derivados de células de linaje neural.

Los componentes principales de la electrospinning se muestran en la Figura 1. Una gran estera de fibras de tamaño se obtuvo típicamente a través de la tira de papel de aluminio perpendicularmente adjunto y una placa de metal plana. Figura 2 muestra el diseño de colector y la estera de fibra de electrospinning. La anchura y la longitud se pueden ajustar para diferentes aplicaciones. La longitud de la fibra hecho con polímero de PGD y mezcla de solución basal es de hasta 10 cm. La morfolo...

Se informó de síntesis y fabricación de fibras electrohiladas largos que abarcan un área de depósito más grande a través de un colector de nuevo diseño de un nuevo polímero biodegradable llamado poli (glicerol-dodecanoato) (PGD). Las fibras fueron capaces de apoyar el crecimiento de células derivadas de células madre pluripotentes de ratón.

Electrospun fibroso Andamios de poli (glicerol-dodecanodioato) de Ingeniería Neural Los tejidos de las células madre embrionarias de ratón

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Este procedimiento, fabrica fibras largas hiladas Electros a partir de un nuevo polímero biodegradable llamado poli glicerol Dote Cano ocho. Primero configure el colector de nuevo diseño y prepare la solución polimérica para el electrohilado, utilizando una jeringa y una bomba, entregue la solución al colector. A continuación, transfiera la estera de fibra resultante a una placa de cultivo para su reticulación.A continuación, siembra células madre embrionarias de ratón en las fibras cortadas. En última instancia, los resultados pueden demostrar que las células madre embrionarias de ratón pueden sobrevivir y diferenciarse en células neuronales en los andamios de fibra. En el video de hoy, le mostramos cómo preparar el biomaterial a partir de la fabricación de células syn y, finalmente, usar esas fibras electro span para el cultivo celular.Especialmente cuando lo combinamos con la célula derivada del poli y la célula de tinción. Pueden tener una aplicación muy importante en el futuro para la entrega de células y la creación de un tejido funcional. Tissue invis hoy que ella demostrará un procedimiento horrible para usted.Es lo más grande de mi laboratorio. Corta el papel de aluminio e

electrospun-fibrous-scaffolds-poly-glycerol-dodecanedioate-for

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Bioengineering

Bioingeniería

El proceso de electrospinning polímeros de ingeniería de tejidos y cultivos celulares se trata en este artículo. En concreto, el electrospinning de macrómeros fotorreactivos con capacidades de procesamiento adicional de photopatterning y electrospinning multi-polímero se describe.

Electrospinning andamios fibroso polímero para ingeniería de tejidos y cultivos celulares

Alineados fibras electrospun dirigir el crecimiento de las neuronas in vitro y son un componente potencial de andamios la regeneración nerviosa. Se describe un procedimiento para la preparación de sustratos electrospun fibra y el cultivo libre de suero de rata principal E15 sensorial (GRD) y las neuronas motoras. La visualización de las neuronas por inmunocitoquímica también se incluye.

La cultura de la motora primaria y las neuronas sensoriales en los medios de comunicación definidas en Electrospun poli-L-láctico andamios nanofibras

Estos detalles del trabajo de la preparación de la fibrina andamios 3D para el cultivo y diferenciación de las células madre plutipotent. Tales andamios puede ser utilizado para cribar los efectos de diversos compuestos biológicos sobre el comportamiento de células madre, así como modificado para contener los sistemas de suministro de fármacos.

Preparación de fibrina Andamios 3D para Aplicaciones madre para cultivo celular

A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

Andamios electrospun puede ser procesado post-producción para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Aquí se describen los métodos para hacer girar los andamios complejos (por hilado consecutivos), para la fabricación de andamios más gruesas (por el multi-capas usando calor o recocido de vapor), para lograr la esterilidad (la producción aséptica o esterilización de la post-producción) y para la consecución de adecuadas propiedades biomecánicas.

Postproducción de procesamiento de las Fibras electrospun de Ingeniería de Tejidos

Este protocolo combina electrospinning y microesferas para desarrollar andamios de ingeniería tisular para dirigir neuronas. El factor de crecimiento nervioso se encapsuló dentro de microesferas de PLGA y se electrohiló en andamios fibrosos de ácido hialurónico (HA).  La bioactividad proteica se probó sembrando los andamios con ganglios primarios de la raíz dorsal del pollito y cultivando durante 4-6 días.

Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios

A continuación, presentamos un protocolo para fabricar nanofibras andamios electrospun con organización gradated de fibras y explorar sus aplicaciones en la regulación de la morfología celular / orientación. Gradientes con respecto a las propiedades físicas y químicas de las nanofibras andamios ofrecen una amplia variedad de aplicaciones en el campo biomédico.

Electrospun nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra

La comprensión de las complejas acciones del cerebro requiere herramientas de investigación avanzadas. Aquí demostramos un novedoso modelo de ingeniería 3D basado en colágeno de seda de tejido neuronal que se asemeja a una arquitectura similar a la del cerebro. El modelo se puede utilizar para estudiar el ensamblaje de redes neuronales, la guía axonal, las interacciones célula-célula y la actividad eléctrica.

Modelo de polarizado Neural tisular basada Silk-colágeno-Engineered 3D

Adjunto, presentamos un protocolo para el cultivo 3D de rata células glia derivado del cerebro, incluyendo astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Demostramos cultivo celular primario, síntesis de hidrogel desarrolla el ácido hialurónico (HAMA), encapsulación HAMAphoto-polimerización y de la célula y muestra de procesamiento para la proyección de imagen microscópica electrónica de barrido y confocal.

Mejora 3D hidrogel culturas de células Glial primarias para In Vitro modelado de neuroinflamación

Este protocolo describe la fabricación de un sistema de cultivo celular para permitir la siembra de células madre en un andamio de polímero conductor en vitro la estimulación eléctrica y posterior en vivo la implantación del andamio sembrado de células madre usando un técnica mínimamente invasiva.

Eléctricamente conductivo andamio modular y entregar las células madre

Aprende a fabricar fibras electrohiladas de poli(glicerol-dodecanodioato) para ingeniería de tejidos neuronales usando células madre embrionarias de ratón. Este método demuestra la viabilidad de estos andamios biodegradables.

Electrospun fibroso Andamios de poli (glicerol-dodecanodioato) de Ingeniería Neural Los tejidos de las células madre embrionarias de ratón (Video) | JoVE Journal

Electrospun fibroso Andamios de poli (glicerol-dodecanodioato) de Ingeniería Neural Los tejidos de las células madre embrionarias de ratón

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