Perfiles de expresión de microARN de las células iPS humanas, de la retina del epitelio pigmentario Derivado de Ips y Fetal epitelio pigmentario de la retina

El objetivo general de este procedimiento es comparar la expresión de microARN en células madre pluripotentes inducidas. Células epiteliales pigmentarias retinianas derivadas de células madre pluripotentes inducidas y células epiteliales pigmentarias retinianas fetales. Esto se logra primero cultivando y expandiendo células IPS y RPE fetales.

El segundo paso consiste en diferenciar las células IPS en RPE. A continuación, se extrae el ARN de las células IPS, las células I-P-S-R-P-E y las células RPE fetales. El paso final es realizar un análisis de microarreglo de microARN en las muestras de ARN y analizar los datos.

En última instancia, el análisis de vías y redes se utiliza para identificar microARNs diferencialmente expresados que participan en múltiples redes celulares, incluyendo la proliferación y la progresión del ciclo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de la visión, como el papel del microARN en la regulación de la diferenciación hacia células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) maduras, la progresión del ciclo celular, la proliferación y la senescencia. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia empleada en el epitelio pigmentario de la retina derivado de células madre para reemplazar el RPE afectado por enfermedad o daño, ya que el número de pasaje Optima de las células utilizadas en la terapia puede determinarse.

Aunque este tema puede proporcionar información sobre los factores que regulan la diferenciación de RRP a partir de IPS, también puede aplicarse a otros sistemas orgánicos, como la diferenciación de otros tipos celulares específicos de TC a partir de IPS. Para comenzar este procedimiento, siembre las células madre pluripotentes inducidas a razón de aproximadamente 350 colonias celulares por pocillo en una placa recién recubierta con medio M tester one, y permita que las colonias de IPS se expandan durante cuatro a cinco días en cultivo.

Luego, cada tres días, reemplace el medio M tesser por cuatro mililitros de medio de diferenciación y cambie la mitad del medio por medio de diferenciación fresco. Deje que los focos pigmentados crezcan lo suficientemente grandes como para poder diseccionarlos manualmente de la cultura, lo cual toma aproximadamente de 40 a 50 días. Luego, use una punta de pipeta de 200 microlitros para cortar alrededor y levantar las colonias pigmentadas.

Recolecte y reúna las colonias diseccionadas en un tubo cónico de 15 mililitros. Añada cinco mililitros de medio DMMF 12 a las células de RPE agrupadas y centrifugue a 300 GS durante cinco minutos. A continuación, retire el medio, re suspenda el sedimento celular en cinco mililitros de medio y repita la centrifugación.

Retire el medio del pellet celular. Luego, prepare una solución de células individuales incubando el I-P-S-R-P-E agrupado con tripsina-EDTA al 0,25 % durante cinco a diez minutos a 37 grados Celsius, hasta que los agregados celulares se disocien en células individuales. Enjuague las células I-P-S-R-P-E con medio I-P-S-R-P-E y luego siembre las células recolectadas en una placa nueva recubierta con matrigel en cuatro mililitros de medio I-P-S-R-P-E. Incube las células durante tres semanas antes del paso y cambie el medio por medio I-P-S-R-P-E fresco cada tres días durante el experimento.

Siembre las células I-P-S-R-P-E a 100.000 células por centímetro cuadrado y luego recolecte las células 17 días después de la siembra para la obtención de células I-P-S indiferenciadas. Cultive las células hasta que se observen colonias indiferenciadas densas en el centro. Cuando esto ocurra, enjuague las colonias con medio D-M-E-M-F 12 y luego disocie las células I-P-S en células individuales utilizando Accutane.

Recolecte las células en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 300 G durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en dos mililitros de medio D-M-E-M-F 12 para recoger el epitelio pigmentario retinal fetal; primero lave las culturas celulares de epitelio pigmentario retinal fetal con D-M-E-M-F 12. Luego, disocie las culturas celulares en células individuales utilizando TRIPSIN-EDTA al 0,25 % durante cinco a 10 minutos a 37 grados Celsius.

Recolecte las células del epitelio pigmentario retiniano fetal en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 300 ×g durante cinco minutos. Luego aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en dos mililitros de medio D-M-E-M-F 12.

Recoger las células I-P-S-R-P-E el día 17. Después del tercer y quinto pase, lavar las células I-P-S-R-P-E dos veces con PBS y preparar una suspensión individual de células mediante incubación con un mililitro de tripsina al 0,25 % durante cinco a 10 minutos a 37 grados Celsius. A continuación, neutralizar la tripsina con dos mililitros de medio I-P-S-R-P-E frío con hielo y recoger las células en un tubo cónico de 15 mililitros.

Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 300 Gs y luego aspirar el sobrenadante. Suspender nuevamente el sedimento celular en tres mililitros de tampón de tinción del kit de microperlas, centrifugar la suspensión de células I-P-S-R-P-E en el tampón de tinción a 300 Gs durante cinco minutos. Luego aspirar el sobrenadante y volver a suspender.

Suspenda el botón celular a una concentración de dos veces 10 a la seis células por 100 microlitros del tampón de tinción del kit de microperlas. Añada 10 microlitros de anticuerpo anti TRA uno 60 PE por dos veces 10 a la seis células. Mezcle bien y luego incube a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.

Lave las células con un mililitro de tampón de tinción por dos veces 10⁶ células. A continuación, centrifugue la suspensión celular durante 10 minutos a 300 ×g. Luego, aspire el sobrenadante y resuspenda el botón celular en 80 microlitros de tampón de tinción por dos veces 10⁶ células.

Luego, agregue 20 microlitros de microesferas marcadas con anti-PE por cada dos veces 10 a la seis células. Mezcle bien e incube durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Añada un mililitro de tampón de tinción por cada dos veces 10 a la seis células, centrifugue durante 10 minutos a 300 Gs y aspire el sobrenadante.

Luego, re suspenda el pellet celular en 500 microlitros de tampón de tinción y separe las células TRA-1-60 negativas en un clasificador magnético de células según se describe en el protocolo de texto adjunto. Lise las células haciendo pasar cada muestra a través de una columna mini spin homogenizadora para microcentrífuga disponible comercialmente, diseñada para mini preparaciones de ácidos nucleicos. Luego, extraiga el ARN total de las células IPS, I-P-S-R-P-E y el epitelio pigmentario retiniano fetal con un kit comercialmente disponible para la extracción de ARN, diseñado para preservar moléculas de ARN pequeñas.

Utilice un espectrofotómetro NanoDrop para determinar las concentraciones totales de ARN; puede crear un archivo de Excel con una lista de los microARN que se identificaron con niveles de expresión diferentes en al menos dos veces entre los grupos de muestras. Luego, inicie sesión en el programa en línea de análisis de vías de ARN y cargue el archivo de Excel. Seleccione el formato flexible para el formato del archivo y seleccione Agilent en la lista desplegable para el identificador.

Escriba debajo del encabezado de datos brutos. Asigne el ID al campo de ID de sonda y asigne observación uno y razón logarítmica al campo de razón logarítmica. Seleccione ignorar para todos los demás campos.

Seleccione los parámetros para el análisis de la siguiente manera: confianza, observado experimentalmente, incluya solo relaciones directas e indirectas e incluya sustancias químicas endógenas. Seleccione la base de conocimientos Ingenuity como conjunto de referencia. Luego, elija la base de datos de moléculas de referencia.

Esto incluye datos de todas las especies, todas las líneas celulares y tejidos, y todas las mutaciones. Después de seleccionar todos los parámetros, ejecute el análisis de red seleccionando redes. Luego, seleccione redes superpuestas y haga clic en una red de interés para ver los resultados.

Las células IPS que se diferenciaron en células I-P-S-R-P-E exhibieron el fenotipo clásico de RPE de morfología celular hexagonal pigmentada, similar al de las células de RPE fetales. La comparación del perfil de expresión de microARN de células IPS indiferenciadas con células I-P-S-R-P-E reveló una regulación positiva de 47 microARN y 36 se reguló negativamente, mientras que las células de RPE fetales mostraron 61 microARN regulados positivamente en comparación con las células I-P-S-R-P-E y 49 regulados negativamente. El análisis de vías mediante el software Ingenuity IPA indicó que los genes diana de los microARN expresados diferencialmente estaban implicados en procesos celulares como el desarrollo celular, el crecimiento y el ciclo celular. Este análisis también indicó que los microARN expresados en tejidos oculares in vivo estaban enriquecidos en I-P-S-R-P-E y en RPE fetal en comparación con células IPS. Al intentar este procedimiento, es importante recordar prevenir la contaminación y la degradación de las muestras de ARN tras seguir este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la R-T-P-C-R, para confirmar el nivel de expresión de microARN en cada tipo celular tras su implementación. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación de la visión exploren el papel del microARN en la diferenciación y la progresión del ciclo celular en el rrp. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo derivar el EPR a partir de IPS y comparar el perfil de expresión de microARN de EPR-IPS con las células IPS y el EPR fetal.