Name: Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende a aislar y cultivar colangiocitos extrahepáticos de ratones neonatos mediante disección meticulosa y crecimiento en geles de colágeno grueso. Este método permite obtener monocapas puras para estudiar el desarrollo de los conductos biliares.

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Los autores agradecen a la Patología Molecular and Imaging Core del NIDDK Centro de la Universidad de Pensilvania de Estudios Moleculares de las Enfermedades Digestivas y Hepáticas (DK50306 P30) para la asistencia con la imagen. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (R01 DK-092111) y de la Fred y Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (a RGW) y por una beca de la Red de Investigación de Enfermedades del hígado infantil y Educación (SK).

Todo el procedimiento se lleva a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Todo animal de trabajo debe llevarse a cabo en condiciones humanas bajo un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso local (IACUC). 1. Preparación de Equipos y Soluciones <ol><li> Configuración de la mesa de operaciones del ratón en estrecha proximidad a la campana de cultivo de tejido y incubadora (Figura 1A). Nota: El equipo requerido incluye un microscopio de disección, una fuente de luz, 12,5 cm de largo tijeras iris recta, 6 pulgadas pinzas curvas dentadas no con puntas finas y 4 pulgadas pinzas dentadas con puntas curvas (fig. 1B). </li><li> Coloque los instrumentos esterilizados en un vaso de vidrio de 70% de alcohol en la mesa quirúrgica. </li><li> Llenar tres 60 mm placas de Petri estériles con medios de aislamiento estéril (Tabla 1); colocar dos en la mesa quirúrgica y una en la capilla, todo en hielo. </li><li> Coloque colágeno de cola de rata,estéril 10x tampón fosfato salino (PBS), agua estéril, estéril 1 N de NaOH y células epiteliales biliares (BEC) medios de comunicación (Tabla 1) en la campana de cultivo de tejido. Nota: El colágeno debe estar en hielo. </li></ol> 2. Aislamiento y cultivo del conducto biliar <ol><li> La eutanasia a los ratones neonatales entre 0-3 días de vida, por la exposición a dióxido de carbono hasta que inconsciente seguido por dislocación cervical, según las directrices del IACUC (Figura 1C). Nota: Los ratones más viejos pueden ser utilizados en función de las necesidades experimentales específicas. </li><li> Coloque animal en decúbito supino y hacer una pequeña incisión horizontal que cruza la línea media en la región de la pelvis. Extienda esta incisión lateralmente y hacia arriba a ambos lados del abdomen, formando una aleta en forma de U. Gire la solapa hacia arriba para destapar los órganos abdominales. Una vez que el abdomen está abierto, mover cuidadosamente los intestinos de la cavidad abdominal hacia el lado derecho del animal para una mejor visualización del conducto biliar común y del hígado. Nota: puede ser necesario extender las incisiones laterales en la caja torácica para obtener una mejor identificación del hígado. </li><li> Usando el microscopio de disección, identificar el conducto biliar común, el hígado y los intestinos. Identificar el conducto biliar común primero (Figura 1 D), utilizando cautela, ya que las estructuras son muy delicados. Con las pinzas dentadas de sierra y no gubernamentales, meticulosamente limpia y acaba con el tejido conectivo que incluye la grasa que rodea a la bilis. Utilice uno fórceps para sujetar el conducto y el otro para limpiar. </li><li> Utilice una técnica similar para limpiar la vesícula biliar. </li><li> Coloque los conductos limpios y la vesícula hasta el primer plato de medios de aislamiento en el hielo. Masajea suavemente las estructuras con los forceps no dentados, mientras que en los medios de comunicación para eliminar más tejido conectivo y eliminar la bilis desde la vesícula biliar. </li><li> Traslado conductos y vesícula biliar con el segundo plato de medios de aislamiento. </li><li> Después del aislamiento de los conductos y vesículas biliares de 5 animales, transferir elpiezas a la tercera placa de Petri, en el capó. Nota: Si las células han de ser aislado a partir de más de 5 animales, se puede hacer en lotes, utilizando soluciones frescas para cada grupo de 5 animales. </li><li> Preparar geles de colágeno gruesas en la campana de cultivo de tejidos: Nota: cualquier plato tamaño puede utilizarse. Una placa de cultivo de 60 mm con un volumen final de 3 ml de colágeno para cada grupo de 5 neonatos funciona bien. Esto debe ser preparado fresco en el momento de la incorporación de conductos recién aisladas. <ol><li> Coloque colágeno de cola de rata, estéril 10x tampón fosfato salino (PBS 10x), dH 2 O estéril, y estéril de NaOH 1 N en hielo. </li><li> Cálculo de los volúmenes de dH 2 0, 10x de PBS, NaOH, y el colágeno necesario para geles con una concentración final de 2 colágeno mg / ml en PBS 1x, utilizando un volumen de 1 N de NaOH igual a 0,023 veces el volumen de colágeno añadido. Nota: Si se utiliza una fuente alternativa de colágeno, siga las instrucciones del fabricante para la neutralización y la formación de gel. </li><li> Mezcle dH 2 0, 10x PBS, y 1 N de NaOH, a continuación, añadir colágeno y así pipeta para garantizar una mezcla uniforme. </li></ol></li><li> Una vez solución de colágeno se ha espesado a un gel de consistencia similar a temperatura ambiente, inmediatamente incrustar los conductos en el colágeno. </li><li> Coloque en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 min para permitir que el colágeno se solidifique. </li><li> Una vez gel se ha solidificado (color cambia de transparente a blanco), overlay con 3,5 ml de medio BEC (Tabla 1) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Retire el medio de BEC 3 veces por semana y reemplazarla con 3,5 ml de medio fresco. </li></ol> 3. Aislamiento cholangiocytes primarias de grueso colágeno geles Nota: en el plazo de 3 semanas, hojas de cholangiocytes (células con núcleo grande que se extiende directamente desde conductos integrados) serán visibles en el colágeno de espesor. Si hay un gran número de fibroblastos en el plato, debe desecharse. Si un par de regiones del plato tienende crecimiento de fibroblastos, éstos se puede cortar con un bisturí y se retira antes de la división de los colangiocitos. <ol><li> Preparar geles de colágeno delgadas: <ol><li> Diluir colágeno a una concentración de 1 mg / ml con PBS estéril. Nota: Utilice 1 ml por placa de 100 mm; ajustar en consecuencia para otros platos de tamaño. </li><li> Corre la solución de colágeno de manera uniforme con un esparcidor de células (grandes platos) o puntas de pipeta (pequeños platos), a continuación, dejar a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Cubrir la placa con DMEM/F12 y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 min. </li><li> Retirar la placa de la incubadora y lavar con PBS 1x. Inmediatamente aspirar el PBS 1x. </li><li> Escudo con una segunda capa delgada de colágeno, la difusión mediante la rotación de la placa o la colocación de la placa en un agitador. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 min. </li><li> Después de colágeno se ha solidificado, la placa de cubierta con DMEM/F12 e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min. </li></ol></li><li> Dividir celdas de thgeles de colágeno ick: <ol><li> Con espátula de cultivo celular o rascador de células, raspar gel de colágeno suavemente la placa de modo que está flotando. </li><li> Preparar la solución de colagenasa diluyendo Tipo XI colagenasa (vea la lista de materiales) a 10 mg / ml con DMEM/F12. Mezclar bien y filtrar de forma estéril. </li><li> Añadir 1 ml de solución de colagenasa (arriba) por 60 mm de placa de células en colágeno de espesor. No extraiga el soporte BEC (que debe ser 3 ml). Incubar plato durante 30 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Retire la solución que contiene células, y el lugar en 15 ml tubo cónico. </li><li> Centrifugar a 2200 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en volumen similar de DMEM/F12. </li><li> Girar solución de nuevo en 2200 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento en 3 ml de 0,5% de tripsina, y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 min. Después de la incubación, la solución de la pipeta hacia arriba y abajo para romper las hojas de cholangiocytes. Añadir 5 ml de los medios de comunicación un BECsolución giro ª a 1500 × g durante 5 min. </li><li> Extraer el sobrenadante, y resuspender el sedimento en DMEM/F12, a continuación, girar solución a 1500 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en medios BEC (Tabla 1). Las células de la placa en geles de colágeno delgadas hechas previamente. </li></ol></li></ol> 4. Pasaje y almacenamiento de células Nota: las células en geles de colágeno delgadas se pueden dividir según sea necesario. <ol><li> Lavar las placas con PBS estéril antes de la incubación en tripsina al 0,25% a 37 ° C durante 10-15 min. </li><li> Neutralizar con un volumen igual de medio de BEC, y sedimentar a 1500 xg durante 5 min. Enjuague de pellets con DMEM/F12, entonces sedimentar a 1500 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender las células en los medios de comunicación de BEC para la distribución de colágeno recubierto placas de cultivo celular. Nota: Alternativamente, las células pueden ser resuspendieron en medios de almacenamiento y se almacenan en un congelador de -80 ° C o nitrógeno líquido (Tabla 1). </li></ol>

<ol><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+bile+ducts%3A+Essentials+for+the+clinical+hepatologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li>
<li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes%2C+periportal+hepatocytes%2C+and+adult+liver+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li>
<li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium%3A+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Aquí se describe es una técnica para aislar cholangiocytes puros a partir de las vías biliares extrahepáticas de los ratones de los ratones de todas las edades, incluidos los recién nacidos. La técnica ofrece la ventaja de que cholangiocytes extrahepáticos se pueden estudiar por separado de cholangiocytes intrahepáticas, y puede facilitar los estudios para identificar las diferencias clave entre estas poblaciones de células. Hemos publicado recientemente un estudio que demuestra disminuyó cilios en cholangiocytes extrah...

El origen y desarrollo de cholangiocytes intra y extrahepáticas son marcadamente diferentes. El hígado se desarrolla a partir de un divertículo del intestino anterior endodermo ventral 5. La región caudal del divertículo forma el árbol biliar extrahepático, mientras que la región craneal genera el árbol biliar intrahepático 5. Cholangiocytes conductos intrahepáticos se derivan de células progenitoras alrededor de la placa ductal en las regiones portal peri 6. Estas células tienen la capacidad de diferenciarse en hepatocitos o colangiocitos 6. Esto tiene importantes implicaciones clínicas dado que cholangiopathies pueden dirigirse específicamente a una categoría de cholangiocytes. Por ejemplo, atresia biliar afecta inicialmente los conductos extrahepáticos del recién nacido, mientras que el síndrome de Alagille afecta conductos intrahepáticos. Hay múltiples descripciones de la aislamiento de cholangiocytes intrahepáticos y unidades de conducto biliar de ratones y ratas. Entigadores han aislado células individuales mediante el aislamiento de conductos y la posterior derivación o por digestión del hígado y el anticuerpo desplegable de cholangiocytes que expresan marcadores de superficie celular específicos 1-4. Unidades funcionales de las vías biliares y polarizados se han aislado por digestión del hígado y la filtración de tamaño 7. Unidades de conductos biliares son capaces de responder a los estímulos secretora y demostrar la secreción de líquido 7, mientras cholangiocytes aislados se ha demostrado que el desarrollo de las estructuras ductular in vitro 1,2. Las limitaciones de estos métodos incluyen la necesidad de conocimientos técnicos especializados y equipos especiales para la perfusión del hígado con las enzimas digestivas. Además, hay un riesgo de contaminación con células mesenquimales 3. Un método para aislar extrahepáticos cholangiocytes del conducto biliar, específicamente de los conductos biliares extrahepáticos neonatales, no se ha descrito previamente. En este trabajo se describe una técnica simplificada para aislar un neonatals así como las células de las vías biliares extrahepáticas adultos en los altos niveles de pureza. Esta técnica facilitará el estudio de las diferencias entre cholangiocytes y la investigación sobre los mecanismos de enfermedades como la atresia biliar que implican los conductos intra y extrahepáticas extrahepáticas.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 ml, utilizado en medios BEC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml, utilizado en medios BEC</td></tr><tr><td>MEM con aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 ml, utilizado en medios BEC</td></tr><tr><td>Insulina-transferrina-selenio</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>51300-044</td><td>5 ml, utilizado en medios BEC</td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml, utilizado en medios BEC</td></tr><tr><td>Concentrado lipídico químicamente definido</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml, utilizado en medios BEC</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml, utilizado en medios BEC y 500 &#956; l en el aislamiento</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15750-060</td><td>0,2 ml, utilizado en medios BEC y 500 &#956; l en el aislamiento</td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508-100ml</td><td>0,13 ml, utilizado en medios BEC</td></tr><tr><td>MEM solución vitamínica</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml, utilizado en medios BEC</td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina de soja</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml, utilizado en medios BEC. El disolvente es PBS, mezclar hasta 5 mg/ml concentración</td></tr><tr><td>de stock L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml, utilizado en medios BEC</td></tr><tr><td>Extracto de hipófisis bovina</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1,1 ml, utilizado en medios BEC</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0,5 ml, utilizado en medios BEC, stock conc 393 &#956; g/ml diluido con etanol</td></tr><tr><td>3 3',5-triyodo-L-tironina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0,5 ml, utilizado en medios BIC, Stock conc 3,4 mg/ml diluido con etanol</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0,5 ml, utilizado en medios BEC, 25 &#956; g/ml diluido con DMEM F12+1%BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886 5</td><td>ml, utilizado en medios BEC, uso a una concentración de stock de 0,411 mg/ml y diluido con DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 ml, utilizado en medios BEC y 500 &#956; l en el aislamiento</td></tr><tr><td>Colágeno de cola de rata</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>variable en función de la concentración de colágeno</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>uso a 10x, sterlie, utilizado para producir colágeno, la cantidad utilizada depende de la concentración</td></tr><tr><td>de colágeno dH2O</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>estéril, la cantidad utilizada depende de la concentración de colágeno</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>Diluido a 1 N, estéril, utilizado para producir colágeno, la cantidad utilizada depende de la concentración</td></tr><tr><td>de colágeno colagenasa tipo XI de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td><td>diluido en DMEM y filtro estéril antes de usar</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (1x) 0.25%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>25200-056</td><td>3 ml, incubar máx. 10 min</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (10x) 0.5%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15400-054</td><td>3 ml, incubar máx. 10 min</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>Otros modelos aceptables</td></tr><tr><td>Fuente de luz (iluminador de fibra óptica)</td><td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>Otros modelos aceptables</td></tr><tr><td>Tijeras de iris rectas de 12,5 cm</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Otros modelos aceptables</td></tr><tr><td>Pinzas curvas no dentadas de 6" con puntas finas</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica Otros</td><td>modelos aceptables</td>Pinzas <td></td></tr><tr><td>de acero inoxidable dentadas de 4" con puntas finas</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica Otros</td><td></td><td>modelos aceptables</td></tr></tbody></table>

aislamiento de neonatal extrahepática cholangiocytes

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Los conductos biliares intra y extrahepáticas del hígado son de desarrollo distinta, y puede ser diversamente afectados por ciertas enfermedades. Sin embargo, las diferencias entre cholangiocytes intra y extrahepáticas, y entre las células neonatales y de adultos, no están bien entendidas. Los métodos para el aislamiento de cholangiocytes de conductos biliares intrahepáticos están bien establecidos 1-4. Aislamiento de células ductales extrahepáticos, especialmente desde el recién nacido, todavía no se ha descrito, aunque esto sería de gran beneficio en la comprensión de las diferencias entre las poblaciones cholangiocyte distintos y en el estudio de enfermedades tales como la atresia biliar que aparecen para apuntar a los conductos extrahepáticos. Se describe aquí es una técnica optimizada para aislar las células de las vías biliares extrahepáticas, tanto neonatal y del adulto del ratón. Esta técnica permite obtener una población de células puro con un mínimo de contaminación de las células mesenquimales como los fibroblastos. Esta metod se basa en la eliminación de los conductos y de la vesícula biliar extrahepática, seguida de la disección meticulosa y raspado para remover capas de grasa y fibroblastos. Estructuras están incrustadas en capas gruesas de colágeno y se cultivaron durante aproximadamente 3 semanas para permitir el crecimiento de cholangiocytes en monocapas, que luego pueden ser tripsinizaron y re plateado para uso experimental.

El uso de este protocolo resulta en el aislamiento de una población de ratones cholangiocytes extrahepáticas neonatales con excelente pureza, como lo demuestra la tinción de inmunofluorescencia K19 (Figuras 2A y 2B); logramos resultados similares aislamiento de células a partir de ratones adultos. Hemos observado que se tarda 3 semanas para las células de los conductos biliares recién aisladas para formar monocapas sobre geles de colágeno gruesas. Los cholangiocytes crecen de forma lineal a lo largo del...

Una técnica para aislar cholangiocytes de los conductos biliares extrahepáticos de ratones recién nacidos se describe. Los conductos están meticulosamente disecados, y luego las células se aíslan por consecuencia en geles de colágeno gruesas. Este método proporciona una herramienta útil para el estudio del desarrollo de vías biliares extrahepáticas y patología.

Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y cultivar coledocitos extrahepáticos neonatales. Esto se logra primero exponiendo quirúrgicamente los órganos abdominales para permitir el acceso al hígado y a los conductos biliares. El segundo paso del procedimiento consiste en eliminar meticulosamente el tejido conectivo y las grasas que rodean los conductos biliares y la vesícula biliar.Los conductos biliares y la vesícula biliar limpios se colocan luego sobre geles gruesos de colágeno y se cultivan durante tres semanas. Las colangiócitos migrarán desde los conductos y se dividirán en geles delgados de colágeno para un cultivo adicional. En última instancia, los resultados muestran monocapas de colangiócitos puros mediante microscopía de inmunofluorescencia.Por lo general, las personas nuevas en esta técnica suelen tener dificultades debido a problemas técnicos con la técnica de disección, así como con la limpieza de los pequeños conductos biliares. Para este procedimiento, prepare una mesa quirúrgica para ratón cerca de la campana de cultivo de tejidos y del incubador. Coloque todas las herramientas quirúrgicas esterilizadas en un vaso de precipitados que contenga etanol al 70%.Coloque tres placas de 60 milímetros cargadas con medio sobre hielo. Se necesitan dos placas en la mesa quirúrgica, pero mantenga los demás materiales en la cabina. El colágeno debe estar sobre hielo.Comience colocando un ratón neonato de entre cero y tres días de edad, previamente sacrificado, en posición supina sobre la tabla de disección. Realice una pequeña incisión horizontal a lo largo de la línea media cerca de la pelvis. Extienda la incisión hacia arriba en ambos lados, formando una solapa en forma de U y exponga los órganos.Ahora desplace cuidadosamente los intestinos hacia el lado derecho del abdomen. Para visualizar el hígado y el conducto biliar, extienda las incisiones en la piel para agrandar la solapa si es necesario. Bajo el microscopio de disección, identifique y limpie cuidadosamente el conducto biliar común.Retire el tejido conectivo y la grasa circundante. A continuación, haga lo mismo. Para limpiar la vesícula biliar, retire el conducto biliar y la vesícula biliar, y colóquelos en uno de los recipientes preparados allí.Manipule las estructuras utilizando pinzas no graduadas para eliminar más tejido conectivo y expulsar la bilis. Luego, transfiera los tejidos limpios al segundo recipiente. Repita este procedimiento hasta recolectar tejido de exactamente cinco neonatos.Comience preparando un gel de colágeno espeso. Siempre elabórelo fresco primero. Reúna todas las soluciones esterilizadas sobre hielo.Calcule los volúmenes necesarios para dos miligramos de colágeno por mililitro de una XPBS. Añada 0,023 partes de hidróxido de sodio por cada parte de colágeno. Mezcle los alícuotas juntos a temperatura ambiente mediante pipeteo.Es esencial mezclar el hidróxido de sodio en PBS y agua destilada antes de agregar el colágeno. El colágeno debe ser el último componente añadido al gel, y la solución final debe ser pipeteada. Esto evita que el colágeno se aglutine.Cuando la solución comience a adquirir una consistencia similar a la de un gel, incruste inmediatamente los tejidos aislados y luego transfiera los tejidos incrustados al incubador durante 30 minutos para que solidifiquen. Una vez solidificados, cubra el gel con 3,5 mililitros de medio BEC y continúe la incubación a partir de ese momento. Cambie el medio BEC tres veces por semana. En un plazo de tres semanas, se formarán láminas de células con núcleos grandes que se extienden desde los conductos incrustados.Estas son las colangiocitos. Si el cultivo tiene una población significativa de fibroblastos, a menos que puedan eliminarse, el cultivo debe descartarse. Ahora, prepare geles delgados de colágeno con un miligramo de colágeno por mililitro de PBS, cubra un mililitro en una placa de 100 milímetros y distribuya el colágeno uniformemente; espere 10 minutos.Después de 10 minutos, cubra la placa con siete mililitros de DM EMF 12 e incúbela durante 10 minutos. Tras la breve incubación, lave rápidamente el colágeno con un XPBS. Elimine todo el PBS mediante aspiración y luego agregue una segunda capa de colágeno exactamente como se hizo para formar la primera capa.Una vez solidificado, cubra la placa con DMF 12 e incúbela durante 30 minutos. Ahora separe las células de los geles gruesos. Primero, utilizando una espátula o raspador, desprenda suavemente el colágeno de la placa para que flote.A continuación, prepare una solución filtrada de colagenasa y añada un mililitro a cada placa de 60 milímetros con colágeno espeso. Luego transfiera las placas al incubador. Tras una incubación de 30 minutos, retire toda la solución que contiene las células y transfiérala a un tubo de 15 mililitros.Centrifugar el tubo y eliminar el sobrenadante por aspiración. Re-suspender el precipitado en 4,5 mililitros de medio DM F 12 y volver a centrifugar. Re-suspender el precipitado en tres mililitros de tripsina al 0,5 % e incubar las células a 37 grados Celsius durante cinco minutos, tiempo durante el cual las láminas de células se despegarán.Después de cinco minutos, haga pasar los agregados a través de una pipeta de cinco o 10 mililitros hasta que se desintegren. Luego, agregue cinco mililitros de medio BEC y centrifugue las células. Una tercera vez, re suspenda.Suspenda el sedimento en medio DMM F 12 como paso de lavado y vuelva a sedimentar las células. Ahora, re suspenda las células en medio BEC e inóculelas en la capa delgada preparada. Los geles de colágeno permiten el crecimiento de las células y divídalas en geles de colágeno según sea necesario.Mediante el protocolo descrito, se aisló y tiñó con inmunofluorescencia para K 19 una población de colangiocitos extrahepáticos de ratón neonatal con excelente pureza. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una población pura de colangiocitos extrahepáticos de ratón neonatal mediante una combinación de disección meticulosa del conducto y crecimiento sobre geles gruesos de colágeno.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A continuación se describe el aislamiento de CD133 que expresan las células madre del hígado y las células madre del cáncer de hígado en su totalidad murino, un proceso que requiere de digestión de los tejidos, el enriquecimiento celular y citometría de flujo aislamiento. Se incluyen métodos para el aislamiento avanzado de células individuales y la expansión clonal.

El aislamiento de células madre CD133 + hígado para la expansión clonal

Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

lesiones hepáticas están acompañados por la expansión de células progenitoras que representa una población heterogénea de células. clasificación Novel de este compartimento celular permite la distinción de varios subconjuntos. El método descrito aquí ilustra el flujo de análisis de citometría de alto aislamiento y pureza de varios subconjuntos que se pueden utilizar para más ensayos.

El aislamiento y enriquecimiento de hígado progenitoras subconjuntos identificados por una combinación de marcadores de superficie Novel

Este protocolo describe la producción de un sistema de 3 dimensiones organoide ratón vía biliar extrahepática. Estos organoides biliares se pueden mantener en cultivo a estudiar biología de cholangiocyte. Organoides biliares expresan marcadores de progenitoras y células biliares y están compuestas de células epiteliales polarizadas.

Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento de hepatocitos de ratón de hígados de ratón adultos utilizando una técnica de perfusión de colagenasa modificada. También se describe el cultivo a largo plazo de hepatocitos en un ajuste de sándwich de colágeno 3D, así como la inmunoetiquetado de los componentes citoesqueléticos para estudiar la formación canalicular biliar y su respuesta al tratamiento.

Aislamiento y cultivo de sándwich de colágeno 3D de hepatocitos primarios de ratón para estudiar el papel del citoesqueleto en la formación canalicular de bilis en Vitro

Este protocolo detalla el uso de un catéter intravenoso especial, tubos desechables estériles estandarizados, control de temperatura complementado con monitoreo en tiempo real y un sistema de alarma para el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos para mejorar la consistencia en la viabilidad, el rendimiento y la funcionalidad de los hepatocitos primarios aislados de ratas.

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Para la observación de los trastornos murinos del conducto biliar neonatal, se requiere un conducto biliar intacto y una preparación eficiente. Por lo tanto, se desarrolló con éxito un nuevo enfoque para aislar todo el sistema de vías biliares extrahepáticas en neonatos murinos mientras se mantenía la integridad del conducto biliar.

Disección extrahepática de las vías biliares y la vesícula biliar en neonatos de ratón de nueve días de edad

Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.

Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones

Aprende a aislar y cultivar colangiocitos extrahepáticos de ratones neonatos mediante disección meticulosa y crecimiento en geles de colágeno grueso. Este método permite obtener monocapas puras para estudiar el desarrollo de los conductos biliares.

Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes

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