Transferencia de Protones y Proteína Conformación Dinámica de proteínas fotosensibles por Time resuelto-Step-scan transformada de Fourier espectroscopia de infrarrojo

El objetivo general de este procedimiento es investigar la dinámica de la protonación y los cambios de confirmación de dos proteínas de membrana fotosensibles utilizando espectroscopía FTIR de escaneo STEP resuelto en el tiempo. Esto se logra formando primero una película de proteína hidratada cuya absorción infrarroja se probará en una configuración de reflexión total atenuada para la opsina de las bacterias, o en una configuración de transmisión para el canal Rodin dos. El segundo paso es excitar la muestra con un destello láser de nanosegundos de longitud de onda adecuada para iniciar una reacción fotocíclica en la proteína, detectando cambios resueltos en el tiempo en la intensidad de la luz infrarroja que interactúa con la muestra.

A continuación, el proceso anterior se repite en posiciones discretas del espejo móvil de un interferómetro que controla la diferencia de trayectoria óptica entre dos haces divididos hasta que se registra un interferograma resuelto en el tiempo completo. El paso final es transformar el interferograma resuelto en el tiempo en un espectro de absorción de diferencia IR resuelto en el tiempo utilizando la transformada de Fourier y la ley de la cerveza de Lambert. En última instancia, se inspecciona la evolución temporal de las prohibiciones, especialmente en la región MI y en las regiones carboxílicas de doble enlace CO para obtener la dinámica de los cambios de confirmación y protonación en la proteína.

La principal ventaja de la técnica de los métodos experimentales más existentes es que resuelve los cambios transitorios de la protonación en las proteínas. Además, lo hace en las escalas de tiempo de micro y milisegundos, el rango de tiempo más relevante para sondear la funcionalidad de las proteínas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica molecular y la ciencia de las proteínas, como qué residuos contiene el protonato y cuándo lo hacen durante el mecanismo funcional de una proteína o cuándo se producen cambios importantes en las proteínas.

La demostración del procedimiento será realizada por Victor Ria, investigador asociado de mi laboratorio First mount, la reflectancia total atenuada o un accesorio TR en el compartimiento de muestras del espectrómetro FTIR. Mida un espectro de energía de amplio rango a cuatro centímetros inversos. La resolución de la superficie limpia del elemento de reflexión interna mediante espectroscopia FTIR de barrido rápido convencional cubre la superficie del A TR con 20 microlitros del tampón de alta fuerza iónica que se utiliza posteriormente para rehidratar la muestra.

A continuación, mida la absorción IR del tampón. A continuación, retire el tampón y enjuague la superficie con agua sin tocarla. Eliminar el líquido residual mediante un intenso flujo de aire esparcido aproximadamente tres microlitros de una solución proteica de seis miligramos por mililitro de bacterias Rodin en membrana púrpura en la parte superior de la superficie.

Seque la suspensión de proteínas bajo un suave chorro de aire seco hasta obtener una película. A continuación, mida el espectro de absorción de la película seca. A continuación, agregue suavemente de 20 a 40 microlitros del tampón de alta fuerza iónica para rehidratar la película seca.

Cubra el soporte A TR con una tapa para evitar la evaporación del agua, mida y absorba el espectro. Estime el porcentaje de muestra que queda cerca de la superficie después de la rehidratación de la película restando el espectro de absorción del tampón. En este punto, agregue 10 microlitros de opsina de canal dos disueltos en dec a un lado en un tampón de baja fuerza iónica en el centro de una ventana de fluoruro de bario de 20 milímetros de diámetro.

Extienda la solución con la ayuda de la punta de la micropipeta a un diámetro de seis a ocho milímetros utilizando un flujo suave de película homogénea cálida de aire seco que tenga un diámetro aproximadamente igual al tamaño del haz IR en la apertura más grande. A continuación, utilice una junta tórica plana de silicona de un milímetro de grosor. Hidrata la película añadiendo de tres a cinco microlitros de una mezcla de glicerol y agua distribuida en tres a cinco gotas alrededor de la película seca y ciérrala herméticamente con una segunda ventana.

Inserte las ventanas intercaladas de fluoruro de bario en un soporte. A continuación, coloque el soporte en el compartimento de muestras. Mide un espectro de absorción.

Confirme que la absorción máxima en la región de la amida uno está en el rango de 0,6 a 1,0 para la configuración A TR. Utilice una fibra óptica colocada en la parte superior de la tapa A TR para acoplar el láser a la muestra. Ajuste la densidad de energía del láser en la muestra a dos o tres milijulios por centímetro cuadrado por pulso.

Usando un medidor de potencia o los experimentos de transmisión, use espejos para llevar el láser a la muestra y, si es necesario, lentes para cotejar o desviar el rayo láser a un diámetro ligeramente superior al tamaño de la película de la muestra. Sincronice el pulso láser con el registro de datos mediante el interruptor Q. Sincronice el pulso TTL de la electrónica del láser de granate de aluminio y atrio de neodimio para activar el convertidor analógico a digital del espectrómetro.

Ajuste la velocidad de excitación del láser para realizar el tiempo resuelto. Mediciones de escaneo escalonado en el rango espectral de 1800 a 850 centímetros inversos. Coloque un filtro óptico de paso bajo en la trayectoria óptica que sea opaco por encima de 1.950 centímetros inversos y con buena transmisión por debajo de 1800 centímetros inversos.

A continuación, cambie el detector del modo acoplado de CA a CC. En este punto, lleve el nivel de CC del interferograma a cero aplicando un sesgo de corriente al detector. Reajuste la ganancia electrónica para hacer un mejor uso del rango dinámico del convertidor de analógico a digital.

A continuación, inicie el menú de escaneo por pasos del espectrómetro FTIR. Establezca el ancho de banda espectral objetivo para la medición de escaneo escalonado a un octavo del número de onda láser de helio neón. Establezca la resolución espectral y de fase en ocho centímetros inversos y 64 centímetros inversos respectivamente.

Seleccione una función de appe. A continuación, configure el modo de adquisición de INTERFEROGRAMA en un solo lado hacia adelante. Ajuste la frecuencia de muestreo del convertidor de analógico a digital a la más alta disponible en el espectrómetro.

Establezca el desencadenador del experimento en externo. A continuación, establezca el número de puntos de datos espaciados linealmente que se van a registrar, incluidos los 100 puntos de activación pret. A continuación, establezca el número de coediciones o el número de promedios de la reacción fotográfica por posición del espejo e inicie el experimento.

Finalmente, repita el experimento 10 veces para bacterias, redsin, y 35 veces en tres películas de muestra diferentes para que el canal redsin dos tenga aproximadamente 200 coadiciones por posición de espejo prohibiciones características de las vibraciones de amita de enlace peptídico se distinguen en el espectro de absorción de espuma seca de bacterias redsin. Cuando se utilizan tampones de baja fuerza iónica, la película se expande excesivamente reduciendo la cantidad de proteína sondeada por el campo evanescente. La dependencia exacta entre el hinchamiento de la película y la fuerza iónica del tampón dependerá, entre otros factores, de la naturaleza de los lípidos.

La hinchazón de la película después de la hidratación requiere tiempo para alcanzar la estabilización de las bacterias de la dosina. En la membrana púrpura, el proceso es monoexponencial con una constante de tiempo de 12 minutos. Un gráfico 3D de un escaneo de pasos típico resuelto en el tiempo, experimento FDIR sobre bacterias.

Aquí se muestra Redsin. Los espectros se pueden extraer en momentos específicos. Por ejemplo, cuando se espera que los estados intermedios en el fotociclo de la bacteria redsin alcancen su mayor población.

En el bastones de bacterias Dossin, el tiempo del fotociclo de las trazas de absorbancia cambia a 1.762 centímetros inversos. Informes sobre la dinámica de desprotonación del aspartato 85 y a 1, 741 centímetros inversos sobre los cambios en los enlaces de hidrógeno y la dinámica de reproducción de la desprotonación del ácido aspártico.96. El tiempo se sitúa a 1.670 y 1.555 centímetros inversos.

Informe sobre los cambios en las vibraciones MI uno y dos, que son sensibles a la confirmación de la columna vertebral del péptido. Siguiendo este método, se pueden realizar otras técnicas como la neurogénesis dirigida al sitio o la espectroscopia enzimática de la retina con el fin de asignar banda vibracional a residuos específicos en la proteína después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biofísica molecular exploraran el mecanismo funcional de muchas proteínas diferentes impulsadas por la luz.