Transferencia de Protones y Proteína Conformación Dinámica de proteínas fotosensibles por Time resuelto-Step-scan transformada de Fourier espectroscopia de infrarrojo

El objetivo general de este procedimiento es investigar la dinámica de protonación y los cambios conformacionales de dos proteínas de membrana fotosensibles utilizando espectroscopía FTIR con escaneo STEP resuelta en el tiempo. Esto se logra primero formando una película proteica hidratada cuya absorción infrarroja será analizada, bien en una configuración de reflexión total atenuada para la bacterioopsina, bien en una configuración de transmisión para el canal Rodopsina 2. El segundo paso consiste en excitar la muestra con un destello láser de nanosegundos de longitud de onda adecuada para iniciar una reacción fotoquímica en la proteína, detectando así cambios resueltos en el tiempo en la intensidad de la luz infrarroja que interactúa con la muestra.

A continuación, se repite el proceso anterior en posiciones discretas del espejo móvil de un interferómetro que controla la diferencia de trayectoria óptica entre dos haces divididos, hasta que se registra un interferograma completo resuelto en el tiempo. El paso final consiste en transformar el interferograma resuelto en el tiempo en un espectro de absorción infrarroja por diferencias resuelto en el tiempo, utilizando la transformada de Fourier y la ley de Lambert-Beer. En última instancia, se examina la evolución temporal de las bandas, especialmente en la región del MI y en la del doble enlace C=O de los grupos carboxílicos, para obtener la dinámica de los cambios conformacionales y de protonación en la proteína.

La principal ventaja de la técnica frente a la mayoría de los métodos experimentales existentes es que permite resolver cambios transitorios de protonación en proteínas. Además, lo hace en escalas de tiempo de micro y milisegundos, el rango temporal más relevante para investigar la funcionalidad proteica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica molecular y la ciencia de proteínas, como qué residuos se protonan y cuándo lo hacen durante el mecanismo funcional de una proteína o cuándo tienen lugar cambios importantes en las proteínas.

El procedimiento será demostrado por Victor Ria, investigador asociado de mi laboratorio. En primer lugar, monte el accesorio de reflexión total atenuada o A TR en el compartimento de muestra del espectrómetro FTIR. Mida un espectro de energía amplio a cuatro centímetros inversos. Resolución de la superficie limpia del elemento de reflexión interna mediante espectroscopía FTIR de barrido rápido convencional. Cubra la superficie del A TR con 20 microlitros del tampón de alta fuerza iónica que se usará posteriormente para rehidratar la muestra.

Luego, mida la absorción IR del tampón. A continuación, retire el tampón y enjuague la superficie con agua sin tocarla. Elimine el líquido residual mediante un flujo intenso de aire y extienda aproximadamente tres microlitros de una solución proteica de seis miligramos por mililitro de bacterias Rodin en membrana púrpura sobre la superficie.

Seque la suspensión proteica bajo una corriente suave de aire seco hasta obtener una película. Luego, mida el espectro de absorción de la película seca. A continuación, agregue suavemente de 20 a 40 microlitros del tampón de alta fuerza iónica para rehidratar la película seca.

Cubra el soporte A TR con una tapa para evitar la evaporación del agua y medir el espectro absorbente. Estime el porcentaje de muestra restante cerca de la superficie después de la rehidratación de la película restando el espectro de absorción del tampón. En este punto, agregue 10 microlitros de canal opsin 2 disuelto en dec alside en un tampón de baja fuerza iónica en el centro de una ventana de fluoruro de bario de 20 milímetros de diámetro.

Extienda la solución con la ayuda de la punta de micropipeta hasta un diámetro de seis a ocho milímetros utilizando un flujo suave de aire seco para obtener una película homogénea tibia que tenga un diámetro aproximadamente igual al tamaño del haz de IR en la abertura más grande. A continuación, utilice una junta tórica plana de silicona de un milímetro de espesor. Hidrate la película añadiendo de tres a cinco microlitros de una mezcla de glicerol y agua distribuidos en tres a cinco gotas alrededor de la película seca y ciérrela herméticamente con una segunda ventana.

Inserte las ventanas de fluoruro de bario en forma de sándwich en un soporte. Luego coloque el soporte en el compartimento de la muestra. Mida un espectro de absorción.

Confirme que la absorción máxima en la región de amida uno esté en el rango de 0,6 a 1,0 para el equipo A TR. Utilice una fibra óptica colocada encima de la tapa A TR para acoplar el láser a la muestra. Ajuste la densidad de energía del láser en la muestra a dos o tres milijulios por centímetro cuadrado por pulso.

Utilizando un medidor de potencia o los experimentos de transmisión, use espejos para dirigir el láser hacia la muestra y, si es necesario, lentes para colimar o desviar el haz láser hasta un diámetro ligeramente superior al tamaño de la película de la muestra. Sincronice el pulso del láser con la grabación de datos utilizando el interruptor Q. Use el pulso TTL de salida de sincronización de la electrónica del láser de granate de aluminio y itrio dopado con neodimio para activar el convertidor analógico-digital del espectrómetro.

Configure la tasa de excitación del láser para realizar mediciones de barrido por pasos resueltas en el tiempo en el rango espectral de 1800 a 850 centímetros inversos. Coloque un filtro óptico de paso bajo en la trayectoria óptica que sea opaco por encima de 1.950 centímetros inversos y que tenga buena transmisión por debajo de 1800 centímetros inversos.

Luego cambie el detector del modo acoplado en CA al modo acoplado en CC. En este momento, lleve el nivel de CC del INTERFEROGRAMA a cero aplicando un sesgo de corriente al detector. Ajuste nuevamente la ganancia electrónica para aprovechar mejor el rango dinámico del convertidor analógico a digital.

A continuación, inicie el menú de escaneo por pasos del espectrómetro FTIR. Establezca el ancho de banda espectral objetivo para la medición de escaneo por pasos en un octavo del número de onda del láser de helio-neón. Establezca la resolución espectral y la resolución de fase en ocho centímetros inversos y 64 centímetros inversos, respectivamente.

Seleccione una función appe. Luego, configure el modo de adquisición de INTERFERÓGRAMA en avance unilateral. Establezca la tasa de muestreo del convertidor analógico a digital en el valor más alto disponible en el espectrómetro.

Configure el disparador del experimento en externo. A continuación, establezca el número de puntos de datos espaciados linealmente que se registrarán, incluyendo 100 puntos previos al disparador. Luego, establezca el número de coediciones o el número de promedios de la reacción fotónica por posición del espejo e inicie el experimento.

Finalmente, repita el experimento 10 veces para bacterias, redsin, y 35 veces en tres películas de muestra diferentes para el canal redsin dos, a fin de tener aproximadamente 200 coadicionamientos por posición del espejo. Las bandas características provenientes de las vibraciones del enlace peptídico de amita son distinguibles en el espectro de absorción del espuma seca de bacteria redsin. Al utilizar tampones de baja fuerza iónica, la película se expande excesivamente, reduciendo la cantidad de proteína analizada por el campo evanescente. La dependencia exacta entre la hinchazón de la película y la fuerza iónica del tampón dependerá, entre otros factores, de la naturaleza de los lípidos.

La hinchazón de la película tras la hidratación requiere tiempo para alcanzar la estabilización en bacterias de dosin. En la membrana púrpura, el proceso es monoexponencial con una constante de tiempo de 12 minutos. Un gráfico 3D de un escaneo típico resuelto en el tiempo por pasos, experimento FDIR en bacterias.

Se muestra aquí redsin. Se pueden extraer espectros en tiempos específicos. Por ejemplo, cuando se espera que los estados intermedios en el ciclo fotoquímico de redsin en bacterias alcancen su máxima población.

En las trazas temporales del ciclo fotoquímico de la bacteria bastón Dossin, los cambios de absorbancia a 1.762 centímetros inversos informan sobre la dinámica de protonación-desprotonación del aspartato 85, y a 1.741 centímetros inversos sobre cambios en los enlaces de hidrógeno y la dinámica de desprotonación-reprotonación del ácido aspártico.96. Las trazas temporales a 1.670 y 1.555 centímetros inversos.

Informe sobre los cambios en las vibraciones MI uno y dos, que son sensibles a la conformación del armazón peptídico. Tras el desarrollo de este método, se pueden realizar otras técnicas, como la neurogénesis dirigida por sitio o la espectroscopía enzimática retinal, con el fin de asignar bandas vibracionales a residuos específicos en la proteína. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biofísica molecular exploraran el mecanismo funcional de numerosas proteínas impulsadas por la luz.