Métodos para caracterizar espontánea y de sobresalto-inducida Locomotion en un modelo de enfermedad de Parkinson inducida por rotenona-de

El objetivo general del siguiente experimento es determinar la locomoción inducida por el sobresalto y la locomoción espontánea a largo plazo en un modelo de enfermedad de Parkinson inducido por rotenona en drosófila, lo cual se logra criando a la drosófila en alimento suplementado con rotenona para inducir el fenotipo. Como segundo paso, las moscas se someten a un ensayo de respuesta al sobresalto y a un ensayo de locomoción espontánea a largo plazo utilizando un aparato de dos viales. En un monitor de actividad de drosófila, los resultados muestran que la exposición a la rotenona provoca defectos en la locomoción en drosófila, basados en la cuantificación de la respuesta al sobresalto y de la locomoción espontánea a largo plazo.

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la drosófila, modelos de trastornos neurodegenerativos y de locomoción, como los defectos en la locomoción inducida por susto y la locomoción espontánea a largo plazo. Para comenzar, agregue 1.5 gramos de medio instantáneo para drosófila. En un vial estándar para moscas, prepare el medio con cinco mililitros de agua desionizada que contenga la dosis adecuada de rotenona.

A continuación, sede ocho a doce moscas macho de uno a tres días de edad utilizando dióxido de carbono y transpórtelas a viales que contienen la droga. Deje que las moscas se recuperen de la sedación durante 20 minutos con el vial en posición horizontal, con alimento suplementado. Luego coloque el vial en posición vertical en un incubador con ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a 25 grados Celsius para el resto del experimento.

A continuación, invierta un vial estándar para moscas encima de otro vial y selle la junta con cinta adhesiva para crear un aparato de doble vial. Luego, divida el doble vial en tres secciones iguales de 6,33 centímetros marcando círculos alrededor de los viales con un rotulador permanente. Después de tres días de exposición al fármaco, transfiera las moscas al aparato de doble vial.

Sustituir la cinta sobre la costura permite que las moscas se aclimaten al nuevo ambiente durante 15 minutos. Luego, coloque los viales sobre un fondo blanco y prepare la cámara digital. Asegúrese de que todo el aparato sea visible en un solo encuadre y que el dispositivo de doble vial y el temporizador estén a la vista, y de que todas las moscas estén enfocadas.

Marque la ubicación de la cámara y del vial para mantener cuadros consistentes entre los ensayos; muestre claramente en la vista de la cámara el número del ensayo y el tratamiento farmacológico. A continuación, golpee firmemente el aparato con doble vial contra la superficie de trabajo tres veces y asegúrese de que todas las moscas caigan al fondo del vial, iniciando inmediatamente el cronómetro. Tome una fotografía del aparato cada cinco segundos durante un minuto.

Luego, permita que las moscas se recuperen sin perturbaciones durante un minuto. Repita el ensayo otras dos veces con tiempos de recuperación de un minuto entre cada prueba. Revise las imágenes y registre el número de moscas en cada sección a lo largo del tiempo para realizar los cálculos: reconstituya tres gramos de oph instantáneo, un medio con 15 mililitros de agua desionizada y la dosis adecuada de rotenona.

Después de cinco minutos, coloque cuidadosamente los tubos verticalmente en viales transparentes y cargue el alimento sólido hasta una altura de un centímetro girando el tubo. A continuación, empuje suavemente la tapa de plástico en el extremo del tubo, evitando la formación de burbujas de aire. Sedar moscas macho de un día de edad con dióxido de carbono e inserte cuidadosamente una mosca en cada tubo utilizando un pincel.

Luego, tape el extremo del tubo con una pequeña bola de algodón. Deje que las moscas se recuperen del dióxido de carbono con los tubos en posición horizontal durante 15 minutos y asegúrese de que todas las moscas estén vivas y activas. Inserte los tubos en el monitor de actividad de Drosophila o DAM, y verifique que todos los tubos estén en la misma posición con respecto al DAM.

Coloque el DAM en un incubador con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a 25 grados Celsius. A continuación, conecte el DAM al sistema de recolección de datos. Luego, abra el software del DAM en las preferencias.

Seleccione una duración de intervalo de 10 minutos para comenzar la recolección de datos y permita que el programa recolecte datos durante siete días. A continuación, abra el programa de escaneo de archivos DAM y acceda a los datos del monitor haciendo clic en seleccionar datos de entrada. Luego, seleccione el rango de monitor adecuado y configure la duración del intervalo en intervalos de 10 minutos.

A continuación, en el tipo de archivo de salida, seleccione los archivos de canal y deje todas las demás opciones en sus valores predeterminados. Luego, haga clic en escanear datos y guarde los archivos en una carpeta designada. Finalmente, importe los datos al software de análisis de datos circadianos para obtener las cuentas por minuto.

Después de tres días de exposición a diferentes dosis de roone, las moscas tipo silvestre Canton s expuestas a dosis crecientes mostraron una deficiencia en la respuesta de sobresalto. Un porcentaje menor de moscas se encontraba en la sección superior y un porcentaje mayor en la sección inferior del aparato después de 30 segundos, lo que indica una deficiencia en la respuesta saral; una tendencia similar se observó en las moscas del ensayo de locomoción espontánea. Se midieron los conteos por minuto en el monitor de actividad de Drosophila o DAM.

En el cuarto día después de la exposición, las moscas expuestas a 250 micromolares y 500 micromolares de rotenona muestran una reducción significativa en las cuentas por minuto. Estos ensayos pueden adaptarse fácilmente para caracterizar defectos en la locomoción en otros modelos esofágicos de enfermedad y la eficacia de agentes terapéuticos.