Métodos para caracterizar espontánea y de sobresalto-inducida Locomotion en un modelo de enfermedad de Parkinson inducida por rotenona-de Drosophila

El objetivo general del siguiente experimento es determinar la locomoción espontánea inducida por sobresaltos y a largo plazo en un modelo de enfermedad de Parkinson inducida por rotenona de drosophila, esto se logra criando drosophila con alimentos suplementados con rotenona para inducir el fenotipo. Como segundo paso, las moscas se someten al ensayo de respuesta al sobresalto y a un aparato de doble vial y al ensayo de locomoción espontánea a largo plazo. En un monitor de actividad de Drosophila, los resultados muestran que la exposición a la rotenona causa defectos de locomoción en Drosophila basándose en la cuantificación del sobresalto y la locomoción espontánea a largo plazo.

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la drosophila, modelos de trastornos neurodegenerativos y de locomoción, como defectos en la locomoción inducida por sobresalto y locomoción espontánea a largo plazo. Para empezar, añade 1,5 gramos de medio instantáneo para drosophila. En un vial estándar para moscas constituya el medio con cinco mililitros de agua desionizada que contiene la dosis adecuada de rotenona.

A continuación, de ocho a 12 moscas macho de uno a tres días de edad utilizan dióxido de carbono y las transportan a viales que contienen el medicamento. Los alimentos suplementados permiten que las moscas se recuperen de la sedación durante 20 minutos con el vial en posición horizontal. A continuación, coloque el vial en posición vertical en una incubadora de 12 horas de luz oscura a 25 grados centígrados durante el resto del experimento.

A continuación, invierta un vial de mosca estándar encima de otro vial y selle la costura con cinta adhesiva para crear un aparato de doble vial. A continuación, divida el vial doble en tres secciones iguales de 6,33 centímetros marcando círculos alrededor de los viales con un rotulador permanente. Después de tres días de exposición al fármaco, transfiera las moscas al aparato de doble vial

Reemplazar la cinta sobre la costura permite que las moscas se aclimaten al nuevo entorno durante 15 minutos. A continuación, coloque los viales sobre un fondo blanco y configure la cámara digital. Asegúrese de que todo el aparato esté visible en un solo marco y que el aparato de doble vial y el temporizador estén a la vista y que todas las moscas estén enfocadas.

Marque la ubicación de la cámara y el vial para mantener fotogramas consistentes entre los ensayos, muestre claramente el número de ensayo y el tratamiento farmacológico en la vista de la cámara. A continuación, golpee firmemente el aparato de doble vial contra la encimera tres veces y asegúrese de que todas las moscas caigan al fondo del vial y ponga en marcha el temporizador inmediatamente. Tome una fotografía del aparato cada cinco segundos durante un minuto.

Luego deje que las moscas se recuperen sin ser molestadas durante un minuto. Repita el ensayo dos veces más con tiempos de recuperación de un minuto entre cada ensayo. Revise las imágenes y registre el número de moscas en cada sección a lo largo del tiempo para hacer los cálculos reconstituyan tres gramos de OPH instantáneo, un medio con 15 mililitros de agua desionizada y la dosis adecuada de rotenona.

Después de cinco minutos, coloque con cuidado los tubos verticalmente en viales transparentes y cargue el alimento firme a un centímetro de altura girando el tubo. A continuación, empuje suavemente la tapa de plástico en el extremo del tubo, evitando la creación de burbujas de aire Sedado. Un día el macho de un día se alimenta de moscas con dióxido de carbono y se inserta cuidadosamente una mosca en cada tubo con un pincel.

A continuación, tapona el extremo del tubo con una pequeña bola de algodón. Permita que las moscas se recuperen del dióxido de carbono con los tubos en posición horizontal durante 15 minutos y asegúrese de que todas las moscas estén vivas y activas. Inserte los tubos en el monitor de actividad de drosophila o DAM y compruebe que todos los tubos estén en la misma posición en relación con el DAM.

Coloque el DAM en una incubadora de 12 horas de luz oscura a 25 grados centígrados. A continuación, conecte el DAM al sistema de recopilación de datos. A continuación, abra el software DAM en preferencias.

Seleccione una longitud de ubicación de 10 minutos, inicie la recopilación de datos y permita que el programa recopile datos durante siete días. A continuación, abra el programa de escaneo de archivos DAM y acceda a los datos del monitor haciendo clic en seleccionar datos de entrada. A continuación, seleccione el rango de monitor adecuado y establezca la longitud del contenedor en intervalos de 10 minutos.

A continuación, en el tipo de archivo de salida, elija archivos de canal y deje todas las demás opciones en sus valores predeterminados. A continuación, haga clic en escanear datos y guarde los archivos en una carpeta designada. Por último, importe los datos en el software de análisis de datos circadianos para obtener recuentos por minuto.

Después de tres días de exposición a diferentes dosis de roone wild type, las moscas de Cantón expuestas a dosis aumentadas mostraron una deficiencia en la respuesta de sobresalto. Un porcentaje menor de moscas estaban en la sección superior y un porcentaje más alto en la sección inferior del aparato después de 30 segundos, lo que indica una deficiencia en la respuesta saral, se observó una tendencia similar para las moscas en el ensayo de locomoción espontánea. Los recuentos por minuto se midieron en el monitor de actividad de Drosophila o DAM.

Al cuarto día después de la exposición, las moscas expuestas a 250 micromolares y 500 micromolares de rotenona muestran una reducción significativa en los recuentos por minuto. Estos ensayos pueden adaptarse convenientemente para caracterizar los defectos de locomoción en otros modelos esófagos de enfermedad y la eficacia de los agentes terapéuticos.