Name: ADN-ARN combinado fluorescente In situ La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 54 s
Description: Aprende a realizar FISH combinado de ADN y ARN para estudiar la inactivación del cromosoma X en células madre embrionarias de ratón hembra diferenciadas. Este protocolo permite detectar simultáneamente ambos tipos de ácidos nucleicos.

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Los autores agradecen a todos los miembros anteriores y actuales del departamento de Reproducción y Desarrollo del Erasmus MC por sus útiles y estimulantes debates durante los últimos años. También queremos agradecer a los tres revisores anónimos por proporcionar comentarios útiles. El trabajo en el laboratorio de Gribnau cuenta con el apoyo financiero del Consejo Holandés de Investigación (NWO-VICI) y una subvención inicial del CEI.

1. Inducción de la diferenciación de células madre embrionarias Mujer para inducir inactivación del cromosoma X NOTA: las células madre embrionarias de ratones hembra (disponibles bajo petición) se cultivan en condiciones normales de células ES en placas de cultivo gelatinizados recubiertas con fibroblastos de embriones de ratón (MEFs). Estamos aquí, suponemos que el lector está familiarizado con las técnicas de cultivo celular convencionales 39-41. Para inducir la diferenciación, las células ES cultivadas en placas de T25 serán separados de las MEFs, y se colocaron en placas en medio de diferenciación. <ol><li> Retire medio ES a partir del cultivo de células ES, y lavar dos veces con PBS cultivo celular. </li><li> Añadir 1,5 ml de tripsina-EDTA (pre-calentado a 37 ° C), y se incuban las células a 37 º C durante 7 min. Después de 3,5 min, agitar el plato suavemente para romper las colonias. </li><li> Inactivar la tripsina-EDTA mediante la adición de 3,5 ml de medio de diferenciación a las células. Células de pipeta hacia arriba y abajo para obtener una solución de una sola célula, y recogenen un tubo de 15 ml. Centrifugar durante 5 min a 200 xg, y recoger las células en 10 ml de medio de diferenciación. </li><li> Añadir suspensión celular a una placa de cultivo no gelatinizado, y se incuba durante 1 hora en una incubadora de cultivo celular. NOTA: MEFs serán capaces de adherirse a la placa de cultivo no gelatinizado, mientras que las células ES permanecerán en suspensión. </li><li> Mientras tanto, añadir cubreobjetos de vidrio esterilizados (24 x 24 mm) para placas de 6 pocillos, agregar 0.2% de gelatina, y se incuba durante un mínimo de 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de 1 hora, recoger el sobrenadante del cultivo de células ES pre-plateado, que consistirá principalmente en no adherentes células madre embrionarias. Placa células madre embrionarias a placas de 6 pocillos que contienen cubreobjetos. NOTA: El uso ⅙ ª de un plato T25 confluente de 6 pocillos de una placa de 6 pocillos. Esto permitirá una diferenciación confluentes bien después de 3 días de diferenciación. Cambio de medio en una base diaria. Para los cursos más largos de tiempo, la diferenciación de la placa pre-chapada células ES en medio de diferenciación en platos bacterianas y incubcomió en un agitador de células integrado en la incubadora de cultivo celular. Esto permitirá que las células para formar cuerpos embrioides, que pueden sembrarse a cubreobjetos de 1-2 días antes de la fijación. </li></ol> 2. Fijación de células diferenciadas embrionarias para su posterior análisis FISH de ADN-ARN <ol><li> Retire medio de diferenciación a partir de cultivos de diferenciación, y lavar dos veces con PBS cultivo celular. NOTA: Agregar PBS con cuidado para evitar que las células se lavan. </li><li> Eliminar cultivo celular PBS y fijar las células mediante la adición de 4% de paraformaldehído (PFA) / PBS, y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: PFA es tóxico y puede causar riesgo significativo para la salud cuando se inhala o al entrar en contacto con la piel o los ojos. Además, PFA es cancerígeno. </li><li> Eliminar 4% de PFA / PBS, y lavar 3x cubreobjetos con etanol al 70%. NOTA: El lavado correcto es importante, ya que cualquier rastro de PFA interfiera con los pasos posteriores de FISH. Los cubreobjetos se pueden almacenar en etanol al 70% a -20 ° C durante varios meses antes de la FEl análisis de ISH. </li></ol> 3. Etiquetado de sondas de ADN para experimentos de FISH NOTA: Obtenga un fragmento de ADN del gen de interés (longitud mínima&gt; 2 kb de ARN FISH, o&gt; 20 kb de ADN FISH), o una tasa de alcoholemia que abarca el gen de interés. Para la detección de ARN, una sonda más pequeña puede ser suficiente en comparación con la detección de ADN, ya que la mayoría de la transcripción probablemente resultará en múltiples transcripciones, que pueden ser detectados simultáneamente. Para una señal fuerte en la cadena de ADN de copia única, se requiere una sonda más larga, para ser capaz de detectar un número suficiente de haptenos incorporados. Preferiblemente, una región genómica no transcrita se elige para el diseño de la sonda de ADN. Además, cuando se utiliza una sonda más pequeña para detectar el ARN, se puede prevenir que se está detectando la loci del genoma a partir del cual se transcribe el ARN en el enfoque de FISH de ADN-ARN combinado, aunque esto no puede ser totalmente excluido. Para detectar ratón Xist, se utilizó una sonda de ADNc de 5,5 kb. Para detección del cromosoma X, se pueden utilizar varias sondas de BAC. Buenos resultados se han obtenido con una mezcla de BAC RP23-100E1 y BAC CT7-474E4, que se encuentra en estrecha proximidad con el locus de Xist. En función del gen o cromosoma de interés, varias sondas diferentes podrían ser necesarias para obtener resultados óptimos. Cuando se trabaja con materiales que se utilizarán para el ARN-FISH, utilice puntas estériles de filtro, RNAsa H 2 O gratis, y el trabajo en un ambiente limpio. <ol><li> Tomar 1 g de ADN y se diluye en H 2 O en un volumen total de 16 l. Añadir 4 l de digoxigenina o solución de etiquetado biotina (ver reactivos), mezclar por agitación e incubar a 16 ° C durante 90 min. NOTA: La biotina o nucleótidos marcados con digoxigenina ahora serán incorporados por la mella. </li><li> Mientras tanto, preparar columnas G50 para eliminar los nucleótidos no integrados. Tome una jeringa de 2 ml, quite el estampador, y agregue algodón esterilizado en la jeringa. Añadir bolas de G50 en solución de to llenar la jeringa, colocar la jeringa en un tubo de 15 ml y centrifugar a 642 xg durante 1 min. NOTA: En torno al 80% de la jeringa ahora debe estar lleno de G50. Repita cuando menos G50 está presente. </li><li> Después de 90 minutos, añadir 40 l de H2O a la mezcla de reacción de la mella, y añade que la reacción a la columna de la G50. Añadir un tubo vacío en la columna, y centrifugar a 642 xg durante 2 min. Recoger el flujo a través de un tubo de reacción. </li><li> Medir el volumen del flujo a través con una pipeta, y añadir H2O para llegar a un volumen total de 200 l. Precipitar el flujo a través mediante la adición de 13,3 l de ADN de esperma de salmón (10 mg / ml), 13,3 l de ARNt de levadura (10 mg / ml), 26,7 l ratón ADN Cot-1 (1 mg / ml) y 28 l 2 M de NaAc, pH 5.6. Mezclar por agitación y añadir 533 l de hielo etanol frío al 100%. Agitar el tubo y centrifugar a 16.200 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar pellet dos veces con etanol al 70%. Se centrifuga a 16200 × g durante 5 min a4 ° C, y el aire seco el sedimento. Añadir 50 l de solución de 50 + de hibridación, y se incuba a 37 ° C durante 30 min para facilitar la disolución. NOTA: sonda marcada se puede almacenar durante varios años a -20 ° C. PRECAUCIÓN: 50 solución de hibridación contiene formamida +, que es tóxico, puede irritar la piel, los ojos y el sistema respiratorio, y también es un teratógeno. </li></ol> 4. Permeabilización, Pre-tratamiento y la hibridación de células fijadas para el Combinado de ADN-ARN FISH <ol><li> Rehidrate células fijadas en cubreobjetos, mediante la eliminación de etanol al 70% y la adición de cultivo de células de PBS a las placas de 6 pocillos. Incubar durante 5 min. Repita en el total de tres veces. </li><li> Eliminar el cultivo de células de PBS, y añadir 0,2% de pepsina a las placas de 6 pocillos, para permeabilizar las células. Incubar las placas de 6 pocillos en un baño de agua a 37 ° C durante 4 min. Retire la pepsina, e inactivar con RNAsa H 2 O. libre </li><li> Células post-fix por incubación con 4% PFA / PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Después FIJACIÓNen, lavar dos veces con el cultivo de células de PBS durante 5 min. </li><li> Deshidratar las células por incubación con etanol al 70% durante 3 min, etanol al 90% durante 3 min y etanol al 100% durante 3 min. Transferencia cubreobjetos de placas de 6 pocillos y cubreobjetos secar al aire durante varios minutos. </li><li> Células Edad cubreobjetos incubando a 65 º C durante 1 hora en un plato de calor. </li><li> Pre-hibridar la sonda FISH con ratón ADN Cot-1 sumando para cada cubreobjetos para ser analizados, 25 l de solución de hibridación de 50 +, 0,5 l ratón ADN Cot-1, 1 l de sonda de Xist marcado con biotina y 1 l de digoxigenina BAC sonda marcada detectar el cromosoma X. Mezclar por agitación, y desnaturalizar a 99 ° C durante 5 min. Incubar inmediatamente a 37 ° C durante 45 min, para permitir Cot-1 de ADN para hibridar a repetir secuencias presentes en las sondas. </li><li> Después del envejecimiento, detectar 50 l de tampón de desnaturalización (que consta de 70% formamide/2x tampón de fosfato SSC/10 mM) en un portaobjetos de vidrio, y poner cubreobjetos en la parte superior con las células frente towarDS El tampón de desnaturalización. Incubar a 65 ° C durante 2 min. </li><li> Añadir cubres la espalda a placas de 6 pocillos y las células post-fix incubando en hielo frío etanol al 70% durante 5 min. </li><li> Deshidratar las células por incubación posterior en etanol 70% durante 3 min, etanol al 90% durante 3 min y etanol al 100% durante 3 min. Retire cubreobjetos de placas de 6 pocillos y dejar secar al aire durante varios minutos. </li><li> Detectar la sonda pre-hibridó en un portaobjetos de vidrio, y se incuba el cubreobjetos en la parte superior. Colocar los portaobjetos en una cámara húmeda llena con 50 ml 50% formamide/2x SSC, y se incuba durante la noche a 37 ° C. </li></ol> 5. Los lavados post-hibridación y detección de anticuerpos mediada por la sonda <ol><li> Rellene placas de 6 pocillos con 2x SSC, y pre-caliente hasta 42 ° C. Añadir cubreobjetos después de la incubación durante la noche, y se incuba a 42 ° C durante 5 min. </li><li> Eliminar 2x SSC, y se incuba cubreobjetos con 50% de SSC formamide/2x durante 10 min a 42 ° C. Repetir un total de 3 veces (30 min de lavado por completo). </li&gt; <li> Retire 50% formamide/2x SSC, y lavar los portaobjetos con Tris-solución salina-Tween (TST) para 2 x 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Punto 50 l Tris-solución salina-BSA (TSBSA) por cubreobjetos sobre las nuevas placas de vidrio, y se incuba cubreobjetos boca abajo para bloquear durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado. </li><li> Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST. </li><li> Punto 50 l de anticuerpo de oveja anti-dig (1:500 en TSBSA) por cubreobjetos sobre las nuevas placas de vidrio y se incuba cubreobjetos revés para el primer paso de la incubación durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado. </li><li> Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST. </li><li> Punto 50 l de anticuerpo de conejo anti-oveja conjugado con FITC (1:250 en TSBSA) por cubreobjetos en nuevos portaobjetos de vidrio, y se incuba cubreobjetos boca abajo para la segunda etapa de incubación durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado . </li><li> Transfer cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST. </li><li> Punto 50 l de anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con FITC (1:250 en TSBSA) por cubreobjetos sobre las nuevas placas de vidrio, y se incuba cubreobjetos boca abajo durante la tercera etapa de incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado . </li><li> Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST. </li><li> Punto 50 l de ratón-anti-biotina de anticuerpos (1:200 en TSBSA) por cubreobjetos sobre las nuevas placas de vidrio y se incuba cubreobjetos boca abajo durante la cuarta etapa de la incubación durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado. </li><li> Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST. </li><li> Punto 50 l de anticuerpo de burro anti-ratón conjugados con rodamina (1:250 en TSBSA) por cubreobjetos sobre las nuevas placas de vidrio y se incuba cubreobjetos boca abajo durante la quinta etapa de la incubación durante 30 min a temperatura ambiente en un chamb oscura humidificado-TSTer. </li><li> Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST. </li><li> Punto 50 l de anticuerpo de cabra-anti-caballo conjugada con rodamina (1:250 en TSBSA) por cubreobjetos en nuevos portaobjetos de vidrio, y se incuba cubreobjetos boca abajo para la sexta etapa de incubación durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara oscura TST-humidificado . NOTA: el anticuerpo de cabra anti-caballo va a reconocer el anticuerpo de burro anti-ratón; cuando esté disponible para el investigador, un anticuerpo de cabra anti-burro funcionará tan bien. </li><li> Transferencia cubreobjetos de nuevo a placas de 6 pocillos y lavar 2 x 5 minutos con TST. Lavar 5 min con Tris-salino (TS). </li><li> Deshidratar las células por incubación posterior en etanol 70% durante 3 min, etanol al 90% durante 3 min y etanol al 100% durante 3 min. Retire cubreobjetos de placas de 6 pocillos y dejar secar al aire durante varios minutos. </li><li> Detectar una gota de medio de montaje con DAPI (ver reactivos) en un portaobjetos de vidrio, y añade cubreobjetos boca abajo en la parte superior. Selle las diapositivas con el barniz de uñas yevaluar los resultados de FISH por microscopía de fluorescencia (Figura 1). </li></ol>

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<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
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<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Combinado de ADN-ARN FISH puede ser técnicamente difícil, ya que las condiciones adecuadas para el ADN FISH pueden ser demasiado fuertes para las moléculas de ARN menos estables. Varios enfoques se han aplicado al estudio de ambos ADN y el ARN en la misma célula, evitando la necesidad de incubación simultánea con sondas de detectar tanto el ADN y el ARN. Por ejemplo, en un enfoque de superposición, se realiza primero FISH ARN y las células son expuestas, y se toman las coordenadas. Posteriormente, los mismos portaobjeto...

El estudio de las células y los tejidos mediante hibridación in situ fluorescente (FISH), desde su introducción a finales de 1970 1, permite a los investigadores estudiar los genes, la organización de la cromatina y la expresión génica a nivel subcelular. FISH ADN se utiliza con frecuencia en citogenética, cariotipo 2, el diagnóstico del cáncer 3 y antes de la implantación de cribado genético 4, y tiene un papel importante en la investigación molecular de 5-6, ya que permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo. Análisis de la expresión de células individuales por ARN FISH puede detectar transcritos primarios nativas y RNAs no codificantes que se transcribe a partir de cromosomas, y ofrece ventajas a otras técnicas que evalúan la expresión génica a nivel de población, incluyendo, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa, análisis de expresión de todo el genoma o transferencia Northern . Mediante la visualización de las transcripciones de ARN procedentes directamente de sus sitios de origen, ha sido, por ejemplo,se dio cuenta de que la expresión génica es estocástico 7, y, a veces puede ser específica de alelo 8. Las mejoras en la técnica incluso han permitido la detección y cuantificación de moléculas de ARNm individuales dentro de las células 9-11. El principio básico de peces consiste en la hibridación de ácidos nucleicos dentro de la célula a una sonda de ácido nucleico por medio de Watson y Crick de apareamiento de bases altamente específica. La sonda puede ser ya sea directa o indirectamente detectado, dando como resultado una señal que puede ser visualizada microscópicamente. Los intentos iniciales consistieron de sondas marcadas radiactivamente, que tenían inconvenientes sobre la base de las cuestiones de seguridad, resolución espacial limitada y la capacidad de detectar sólo un objetivo a la vez 12-14. El desarrollo posterior de las etiquetas no radiactivos, incluidos fluorocromos, haptenos, y enzimas, ha permitido que el uso generalizado de FISH como una técnica de biología molecular de rutina. La sonda FISH o bien se puede marcar directamente con fluorochromes por reticulación química de moléculas fluorescentes a secuencias de ácido nucleico 15 y la integración de los nucleótidos marcados con fluorescencia 16-19, o la sonda puede ser visualizada indirectamente después de la integración de haptenos (incluyendo biotina y digoxigenina) y detección inmunológica de haptenos por anticuerpos específicos conjugados con haptenos reportero fluorescente moléculas 20-21. El último enfoque permite la amplificación de la señal mediante el uso de varias capas de anticuerpos marcados con fluorescencia que se utilizan para mejorar la señal original, y permite la detección de especies de ARN que se expresan en niveles bajos. Mediante la combinación de técnicas de etiquetado directos e indirectos y diversos haptenos, varios objetivos se pueden visualizar simultáneamente dentro de la misma célula. Uno de los pasos más importantes en los protocolos de pescado es la hibridación de la sonda con su diana. Aunque, en teoría, una sonda específicamente se unirá sólo a su objetivo, en la práctica, esta especificidadno siempre es logrado, como sondas pueden unirse a regiones homólogas, y condiciones de hibridación no siempre será ideal para una especie determinada región de ADN o de ARN. Los lavados post-hibridación son por lo tanto de particular importancia, ya que pueden aumentar el rigor del procedimiento de FISH, y pueden prevenir la unión no específica de sondas FISH, que daría lugar a un alto nivel de ruido de fondo. Como las moléculas de ARN son de cadena simple que puede ser fácilmente hibridó con una sonda de FISH. En contraste, la molécula de ADN de doble hebra primero necesita una etapa de desnaturalización, después de lo cual una sonda se puede hibridar. Esto se consigue normalmente por calentamiento de la muestra, lo que resulta en la desnaturalización del ADN. Sin embargo, bajo estas duras condiciones, moléculas de ARN de cadena simple frágiles podrían perderse. Por lo tanto, ADN-ARN combinado FISH requiere la optimización significativa de las condiciones, y es técnicamente más difícil en comparación con la detección separada de sólo ARN o ADN. Aquí Presenta protocolo detallado de combinado, FISH simultánea de ADN-ARN que ha permitido estudiar la inactivación del cromosoma X (XCI) en la diferenciación de células madre embrionarias de ratón hembra 22-24. XCI es un mecanismo epigenético crucial para el desarrollo embrionario hembra 25, y los resultados en heterochromatinization y por lo tanto, el silenciamiento de uno de los dos cromosomas X en individuos femeninos 26-27. Esencial para este proceso es el ARN no codificante de Xist 28-30, que está regulada por los RNF12 22-23 y REX1 24 proteínas. Expresión de Xist se convierte en upregulated en el futuro cromosoma X inactivo (XI) durante el desarrollo embrionario o la diferenciación de células ES in vitro , y pueden expandirse a lo largo del cromosoma X y, por tanto atraer enzimas remodelación de la cromatina que se traducen en el cierre de la transcripción del cromosoma X 31. Esta difusión de Xist ARN pueden ser visualizados por ARN FISH como un revestimiento de la cromosoma Xalgunos, que también se conoce como una nube de Xist. Dado que las células madre embrionarias femeninas pueden perder uno de sus cromosomas X, debido a la inestabilidad genómica, nosotros y otros han empleado combinado de ADN-ARN FISH para estudiar XCI, para asegurarse de que las células sólo cariotípicamente estables son evaluados en el análisis de este importante proceso 22,32 -34. Al igual que con todas las técnicas de la biología molecular, varios protocolos excelentes diferentes han sido publicados 35-38. Aquí presentamos nuestro método, a partir de la inducción de la diferenciación en células ES de ratón, la fijación de las células, el etiquetado de sondas FISH por traslación de mella, el tratamiento previo de las células fijadas para permitir la permeabilización y captación de sonda posterior, la hibridación de la sonda a la objetivo, y finalmente la detección de la sonda por anticuerpos marcados con fluorescencia. El protocolo aquí presentado permite la fiel detección de Xist ARN y el cromosoma X dentro de un período de dos días, y los fundamentos de esta técnica probablemente se puede adaptar a otsus sistemas y áreas de investigación.

<table><tbody><tr>Las células <td></td><td></td><td>madre embrionarias de ratón hembra</td><td>estarán disponibles a pedido</td></tr><tr><td>Los</td><td></td><td></td> fibroblastos embrionarios <td>de ratón pueden derivarse de embriones E13.5 o a través de fuentes comerciales por ejemplo, Medio</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de cultivo celular Millipore ESDMEM, 15% suero fetal de ternero, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, aminoácidos no esenciales, 0,1 mM &#947;-mercaptoetanol y 1.000 U/ml de LIF. Filtre, esterilice y almacene en 4 &#176; C durante un máximo de 2 semanas.</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960085</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ternera fetal</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina&ndash; estreptomicina (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&#947;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>ES medio</td><td></td><td></td> de diferenciación celular <td>IMDM-Glutamax, 15% suero de ternera fetal inactivado por calor, 100 U/ml penicilina, 100 mg/ml estreptomicina, aminoácidos no esenciales, 37.8 &#956; l/L de monotioglicerol y 50 &#956; g/ml de ácido ascórbico</td></tr><tr><td>IMDM-Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico (50 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>monotioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>T25 placas de cultivo celular</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>grado de cultivo celular PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA 0,25% (v/v) de tripsina/0,2% (p/v) de EDTA en PBS</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon Falcon</td><td></td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de 24 x 24 mm</td><td>Menzle</td><td>780882</td><td></td></tr><tr><td>gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>preparar una solución de PBS de gelatina/cultivo celular al 0,2% y autoclave</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7000</td><td>Diluido al 0,2% en 0,01 m de HCl (pH 2,0)</td></tr> <tr><td>absoluto 100% etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2,5L</td><td>utiliza agua absoluta 100% libre de etanol y ARNasa para hacer soluciones de etanol al 70% y al 90%</td></tr> de <tr><td>agua libre de ARNasa</td><td>Puntas</td><td></td> de filtro estériles Baxter TKF7114 <td></td></tr><tr><td>Rainin</td><td>Bio Clean</td><td>GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>kit de etiquetado de digoxigenina (traducción de DIG-Nick)</td><td>Kit</td><td></td> de etiquetado de biotina Roche 11745816910 <td></td></tr><tr><td>(traducción de Biotin Nick)</td><td>Roche</td><td>11745824910</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 2 ml</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>algodón</td><td></td><td></td><td></td>esterilizado</tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>levadura ARNt 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Salmón Esperma ADN 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>ratón cuna-1 ADN 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf Modelo</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>Modelo 5810R</td><td></td></tr><tr><td>2 M NaAc, pH 5.6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>50+ solución</td><td></td><td></td> de <td>hibridación 50% formamida, 2x SSC, 50 mM tampón de fosfato pH 7, 10% sulfato de dextrano pH 7</td></tr><tr><td>formamida</td><td>Acros organics</td><td>3272350000</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de dextrano</td><td>Fluka</td><td>31403</td><td></td></tr><tr><td>10 mM tampón de fosfato, pH 7</td><td></td><td></td><td>añadir 57,7 ml de 1 M Na2HPO4 y 42,3 ml de NaH2PO4 NaH2; use agua tratada DEPC y</td></tr><tr><td>tampón</td><td></td><td></td> de desnaturalización en autoclave <td>70% formamida/2x SSC/10 mM tampón de fosfato pH 7</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris solución</td><td></td><td></td><td></td>de pH 7.5</tr><tr><td>Tris-solución salina-Tween (TST)</td><td></td><td></td><td>100 ml 10x solución salina, 50 ml 2M Tris, 500 &#956; l Tween-20, agregue agua libre de ARNasa hasta que 1 L</td></tr><tr><td>10x solución</td><td></td><td></td> salina <td>disuelva 85 g de NaCl en 1 L de H2O libre de ARNasa, y autoclave</td></tr><tr><td>Tris-saline-BSA (TSBSA)</td><td></td><td></td><td>500 &#956; l 10x solución salina, 250 &#956; l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml libre de ARNasa H2O</td></tr><tr><td>BSA, purificado, 100x</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-excavación para ovejas</td> Roche <td>diagnostics</td><td></td><td>use 1:500 diluido en TSBSA</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-ovejas de conejo conjugado con FITC</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>use 1:250 diluido en TSBSA</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con FITC</td><td>Jackson los</td><td></td> laboratorios <td>utilizan 1:250 diluido en</td></tr><tr><td>el anticuerpo anti-biotina de ratón</td> TSBSA <td>uso de</td><td></td> diagnóstico Roche <td>1:200 diluido en el anticuerpo anti-ratón de burro TSBSA</td></tr><tr><td>conjugado con Rhodamine</td><td>Jackson los laboratorios</td><td></td> utilizan <td>1:250 diluido en TSBSA</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-caballo cabra conjugado con Rhodamine</td><td>Jackson los laboratorios</td><td></td><td>utilizan 1:250 diluido en TSBSA</td></tr><tr><td>Solución de lavado tris-salina (TS)</td><td></td><td></td><td>10 ml de solución salina 10x, 5 ml 2 M Tris, 85 ml de ARNasa libre de H2O Medio de</td></tr> montaje Vectashield con <tr><td>miscroscopio</td><td></td><td></td><td></td> fluorescente</tr> de <tr><td>esmalte</td><td></td><td></td><td></td>de uñas</tr><tr><td>DAPI</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

adn-arn combinado fluorescente<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación (fish) para el estudio de inactivación del cromosoma x en las células madre embrionarias de ratón diferenciada mujer

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica molecular que permite la detección de ácidos nucleicos en las células. FISH de ADN se utiliza a menudo en la citogenética y el diagnóstico del cáncer, y puede detectar aberraciones del genoma, que a menudo tiene importantes implicaciones clínicas. ARN FISH se puede usar para detectar moléculas de ARN en las células y se ha proporcionado información importante en la regulación de la expresión génica. La combinación de ADN y ARN FISH dentro de la misma célula es técnicamente difícil, ya que las condiciones adecuadas para el ADN de pescado podría ser demasiado fuertes para moléculas de ARN de cadena simple frágiles. Damos a conocer un protocolo de fácil aplicación que permite a la combinada, la detección simultánea de Xist ARN y el ADN codificado por los cromosomas X. Este protocolo FISH de ADN-ARN combinado probable que se puede aplicar a otros sistemas en los que necesitan tanto ARN como ADN para ser detectado.

Usando el protocolo antes mencionado para combinado de ADN-ARN FISH, hemos sido capaces de visualizar inactivación del cromosoma X en la diferenciación de células madre embrionarias femeninas. Figura 1 muestra un ejemplo representativo de un experimento FISH de ADN-ARN, donde se detectó tanto Xist (que es visible como una llamada de Xist ARN nube en el cromosoma X inactivo y un puntito basal de transcripción en el cromosoma X activo), y una región del cromosoma X, que es visible como u...

La hibridación fluorescente in situ (FISH) permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo dentro de las células. Se describen un protocolo para el combinado, la detección simultánea de ARN y ADN por medio de pescado, que se puede utilizar para estudiar inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón.

ADN-ARN combinado fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la inactivación del cromosoma X en células madre embrionarias de ratón hembra diferenciadas mediante hibridación fluorescente combinada simultáneamente de ADN y ARN, o FISH de ADN-ARN. Esto se logra primero induciendo la diferenciación en células madre embrionarias de ratón hembra. Dado que durante este proceso, que simula el desarrollo embrionario normal posterior a la implantación, se inicia la inactivación del cromosoma X, lo que resulta en una transcripción aumentada y acumulación de ARN-Xist que codifica el futuro cromosoma X inactivo.El segundo paso consiste en fijar las células madre embrionarias diferenciadas utilizando paraformaldehído. A continuación, prepare las sondas para detectar tanto el ADN del cromosoma X como el ARN del quiste, marcando fragmentos de ADN con biotina o digoxigenina mediante traducción de mella.El paso final consiste en realizar el procedimiento de FISH de ADN-ARN. Las células madre embrionarias diferenciadas se permeabilizan, desnaturan e hibridan con las sondas marcadas, que posteriormente se detectan mediante anticuerpos conjugados con fluorescencia que reconocen la biotina o la digoxigenina en los haptenos. Finalmente, se utiliza la microscopía de inmunofluorescencia para mostrar la ubicación de los dos cromosomas en células femeninas y para visualizar la expresión del ARN del ciste del cromosoma X que sufre inactivación.La principal ventaja de esta técnica en comparación con otros métodos como los métodos FISH, en los que el ARN y el ADN se detectan sucesivamente, es que mediante nuestro protocolo podemos detectar ambos tipos de ácidos nucleicos simultáneamente en la misma muestra en menos de dos días. Aunque la combinación de FISH de ADN y ARN puede ser difícil de realizar, ya que las condiciones óptimas para detectar ADN o ARN difieren significativamente. Utilizando el protocolo aquí presentado, somos capaces de detectar ARN existente y ADN derivados de ambos cromosomas X en prácticamente todas las células analizadas.Esto nos ha permitido estudiar la inactivación del cromosoma X tal como ocurre durante la diferenciación de células madre embrionarias de ratón hembra o el desarrollo anómalo del ratón hembra. Aunque este método puede proporcionar información sobre el proceso de inactivación del cromosoma X, un proceso importante y fascinante que ocurre durante el desarrollo embrionario temprano del ratón, probablemente también pueda aplicarse a otros sistemas biológicos en los que sea fundamental detectar transcritos de ARN derivados de la cromatina nativa, ya que los ARN no codificantes están siendo cada vez más valorados por su importancia en los sistemas biológicos, y con frecuencia se prefieren enfoques a nivel de célula individual frente a enfoques alternativos en los que se evalúan poblaciones enteras de células. Preveemos que este protocolo será útil para una amplia comunidad científica.Las células madre embrionarias de ratón hembra o E ESL se cultivan bajo condiciones estándar de ESL en placas de cultivo recubiertas con gelatina y fibroblastos embrionarios de ratón (ORMs) para iniciar el procedimiento de inducción de diferenciación. Retire el medio de ES de la cultura de ESL y lave dos veces con PBS para cultivo celular. Añada 1.5 mililitros de tripsina-EDTA precalentado a 37 grados Celsius e incube las células a 37 grados Celsius durante siete minutos. Después de 3.5 minutos, agite suavemente la placa para disgregar las colonias.Inactive la tripsina EDTA añadiendo 3,5 mililitros de medio de diferenciación a las células, aspire y expulse las células varias veces para obtener una solución de células individuales y recójalas en un tubo de 15 mililitros. Centrifugue durante cinco minutos a 200 G. Después de recoger las células en 10 mililitros de medio de diferenciación, añada la suspensión celular a una placa de cultivo de 10 centímetros no gelatinizada e incube durante una hora. En un incubador de cultivo celular, las células MES podrán adherirse a la placa de cultivo no gelatinizada, mientras que las células ES permanecerán en suspensión.Mientras tanto, coloque cubreobjetos de vidrio estériles en placas de seis pocillos, agregue gelatina al 0,2 % e incube durante un mínimo de cinco minutos. A temperatura ambiente, después de una hora, recoja el sobrenadante del cultivo de ESL prepl, que consistirá principalmente en ESL no adherentes. Después de diluir los ESL, siembre en placas de seis pocillos que contengan cubreobjetos.Comience este procedimiento eliminando el medio de diferenciación de los cultivos de diferenciación y lavando dos veces con PBS para cultivo celular. Asegúrese de agregar el PBS con cuidado para evitar que las células se arrastren. Fije las células agregando PBS con paraformaldehído al 4% e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.Después de 10 minutos, retire el paraformaldehído y lave las laminillas tres veces con etanol al 70%. Para preparar las sondas de ADN para su marcado, primero diluya un microgramo de cada ADN respectivo en agua hasta un volumen total de 16 microlitros. Luego, agregue cuatro microlitros de solución de marcado con oxigenina o biotina, mezcle por vortex y incube a 16 grados Celsius durante 90 minutos.Esto incorporará los nucleótidos marcados con biotina o digoxigenina mediante la traducción NIC. Mientras tanto, prepare columnas G 50. Para eliminar los nucleótidos no integrados, tome una jeringa de dos mililitros, retire el émbolo y agregue algodón esterilizado dentro de la jeringa.Agregue bolas G 50 y solución para llenar la jeringa. Luego coloque la jeringa en un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrifugue a 642 GS durante un minuto. Después de la centrifugación, aproximadamente el 80 % de la jeringa debería estar lleno con G 50. Después de 90 minutos, agregue 40 microlitros de agua a cada mezcla de reacción de traducción NIC y transfiera la reacción a la columna G 50.Agregue un tubo vacío debajo de la columna y centrifugue a 642 G durante dos minutos. Recopile el flujo obtenido en un tubo de reacción. Mida el volumen del flujo con una pipeta y luego agregue agua para alcanzar un volumen total de 200 microlitros.Para precipitar el flujo pasante, agregue esperma de salmón, ADN de levadura, ARNt de ratón capturado en 1D NA y acetato de sodio 2 M mezclando por vortex. Añada 533 microlitros de etanol al 100% frío en hielo y agite el tubo. Centrifugue a 16.200 Gs durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Al finalizar la centrifugación, retire el sobrenadante y lave el precipitado dos veces con etanol al 70%, centrifugando a 16.200 Gs durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, y seque el precipitado al aire.Cuando el precipitado esté seco, agregue 50 microlitros, una solución híbrida de 50 más e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para facilitar la disolución antes de la permeabilización, rehidrate las células fijadas destapando los cubreobjetos mediante la eliminación del etanol al 70% y agregando PBS para cultivo celular a las células.Incubar durante cinco minutos, repetir un total de tres veces para permeabilizar las células. Eliminar el PBS del cultivo celular y añadir pepsina al 0,2 % a las placas de seis pocillos. Incubar las placas en un baño de agua a 37 grados Celsius durante cuatro minutos.Después de eso, elimine el pepin e inactívelo con agua libre de RNAsa. Postfije las células incubándolas con PBS al 4% de paraformaldehído durante cinco minutos a temperatura ambiente; tras la fijación, lave dos veces con medio de cultivo celular o con PBS durante cinco minutos. Deshidrate las células incubándolas con etanol al 70% durante tres minutos, con etanol al 90% durante tres minutos y con etanol al cien por ciento durante tres minutos.A continuación, transfiera los cubreobjetos fuera de las placas de seis pocillos y seque los cubreobjetos durante varios minutos. Envejezca las células incubando los cubreobjetos a 65 grados Celsius durante una hora en una placa calefactora. Mientras tanto, prehibridar las sondas FISH con ADN de revestimiento de ratón 1D añadiendo conjuntamente por cada cubreobjeto que se analizará.25 microlitros de solución de hibridación 50 plus. Un microlitro de la sonda con etiqueta de biotina Cyst, un microlitro de la sonda BAC marcada con digoxigenina que detecta el cromosoma X y 0,5 microlitros de ADN de cot 1 de ratón mezclados mediante vortex y desnaturalizados a 99 grados Celsius durante cinco minutos. Incubar inmediatamente a 37 grados Celsius durante 45 minutos para permitir que el ADN de cot 1 se hibride a las secuencias repetidas presentes en la sonda.Una vez que las células en las laminillas hayan envejecido, coloque 50 microlitros de tampón de desmaduración sobre una portaobjetos y coloque las laminillas encima de las células con la cara orientada hacia el tampón de desmaduración. Incube a 65 grados Celsius durante dos minutos. Fije las células transfiriendo las laminillas nuevamente a las placas de seis pocillos previamente llenas con etanol al 70 % frío y incube durante cinco minutos.Deshidrate las células mediante incubaciones sucesivas en etanol al 70 % durante tres minutos, en etanol al 90 % durante tres minutos y en etanol al 100 % durante tres minutos. Retire las laminillas de las placas de seis pocillos y déjelas secar al aire durante varios minutos. Coloque la sonda previamente hibridada sobre un portaobjetos y coloque una laminilla encima en el incubador.Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada llena con 50 mililitros de 50% IDE en dos XSSC e incube durante la noche a 37 grados Celsius. Después de la incubación nocturna, transfiera los cubreobjetos de los portaobjetos de vidrio a placas de seis pocillos que hayan sido llenadas con dos XSSC precalentado a 42 grados Celsius. Incube a 42 grados Celsius durante cinco minutos.Retire dos XSSC y agregue 50 %form MI dos XSSC. Incube durante 10 minutos a 42 grados Celsius. Lave con 50 %form IDE dos X-S-S-C-A un total de tres veces durante 10 minutos a 42 grados Celsius por lavado.Después del tercer lavado, elimine el 50 % formiato de dos XSSC y lave las laminillas con tris salino tween o TST dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente. Para el bloqueo, agregue 50 microlitros de tris salino BSA o T-S-P-S-A. Coloque la cubreobjetos sobre nuevas laminillas de vidrio y posicione las cubreobjetos boca abajo sobre la laminilla; incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda y oscura con TST. Después de 30 minutos, transfiera las cubreobjetos nuevamente a las placas de seis pocillos y lávelas dos veces durante cinco minutos con TST. Para la incubación con el primer anticuerpo, agregue 50 microlitros de anticuerpo frente al antígeno de oveja por cubreobjetos sobre nuevas laminillas de vidrio, coloque las cubreobjetos boca abajo sobre la laminilla y incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda y oscura con TST.Posteriormente, se incuban las laminillas con una serie de anticuerpos marcados con fluorescencia para potenciar la señal original, tal como se describe en el manuscrito adjunto. Después de la incubación con una serie de anticuerpos marcados con fluorescencia, deshidrate las células mediante incubación durante tres minutos cada una en etanol al 70%, etanol al 90% y etanol al 100%. Retire las laminillas de las placas de seis pocillos y déjelas secar al aire durante varios minutos.Finalmente, coloque una gota de medio de montaje con dappy sobre cada portaobjetos. Añada un cubreobjetos boca abajo encima y selle los portaobjetos con barniz de uñas. Mediante este protocolo de hibridación fluorescente de ácidos nucleicos combinada ADN-ARN, se puede visualizar la inactivación del cromosoma X en células ES femeninas en diferenciación.Esta figura muestra un ejemplo representativo de un experimento de hibridación FISH de ADN-ARN en el que se detectan simultáneamente el ARN del cist y una región del cromosoma X. El ARN del cist es un ARN no codificante esencial para el proceso de inactivación del cromosoma X. En células madre embrionarias femeninas en diferenciación, el ARN del cist se detecta mediante una sonda de ADN marcada con biotina, que se visualiza usando anticuerpos conjugados con rumina y se indica en rojo.El cromosoma X se detecta utilizando una sonda BAC marcada con xigen, que se visualiza mediante anticuerpos conjugados con FITC indicados en verde; los núcleos se contratinjan con DPI indicado en azul. En casi todas las células, se detectan dos cromosomas X. Se observan tanto las grandes acumulaciones de quistes en los cromosomas X inactivos, o nubes de quistes, como la expresión basal de quistes del cromosoma X activo, o puntos focales de quistes.Los puntos precisos del cist no se detectan en cada núcleo porque, tras la diferenciación, esta expresión basal del cist se detiene en el cromosoma X activo futuro. Téngase en cuenta que algunas de las señales puntuales derivadas del cromosoma X se localizan dentro de las nubes del cist, lo que demuestra que la nube del cist se localiza efectivamente a lo largo del cromosoma X y lo codifica. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de dos días y con un resultado confiable si se lleva a cabo correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir la diferenciación de células madre embrionarias de ratón hembra, cómo fijar estas células y cómo prepararlas para permitirle realizar una hibridación combinada de D-N-A-R-N-A por FISH. Recuerde que es importante para el éxito de sus experimentos mantener constantes las temperaturas y los tiempos de incubación según se indica en este protocolo. Asimismo, es fundamental trabajar en un ambiente limpio.Si está utilizando un tipo celular diferente o estudiando un sistema biológico distinto, podría ser necesario realizar algunos ajustes para obtener un resultado óptimo. Buena suerte con sus experimentos.

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ADN-ARN combinado fluorescente In situ La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer (Video) | JoVE Journal

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