Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

El objetivo general de este procedimiento es medir la corriente eléctrica a través de un solo canal iónico. Esto se logra expresando primero heterólogo el canal iónico de interés en células que son fáciles de trabajar y que conducen a los objetivos experimentales. El segundo paso es utilizar una pipeta pulida al fuego para obtener un sellado estable en la membrana celular.

A continuación, el experimentador debe determinar el número de canales presentes en el parche, y si se trata de una corriente de registro de un solo canal, el paso final es procesar y analizar los datos. En última instancia, el registro de la corriente de los canales iónicos individuales se utiliza para investigar las propiedades biofísicas por las que actúan estas proteínas de membrana, lo que constituye la base de cómo se comunican las neuronas y otras células excitables. A diferencia de los métodos que le permiten medir corrientes a través de múltiples canales iónicos activos, la ventaja de este enfoque es que la medición de corrientes a través de un canal iónico individual le permite visualizar y separar una amplia gama de patrones de respuesta inherentes a un canal en particular.

Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de la neurociencia, como los moduladores fisiológicos y terapéuticos que influyen en la comunicación entre las neuronas. Por lo general, las personas que son nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque es difícil obtener grabaciones de bajo ruido que contengan un solo canal iónico. Al intentar este método por primera vez, es realmente útil ver a alguien hacerlo porque para obtener un sello realmente estable, que es lo más importante en este método, debe acercarse a la célula suavemente en el ángulo particular y, lo que es más importante, debe ser persistente para prepararse para la transfección.

Las células HEK 2 93 se colocan en placas de 35 milímetros con un día de antelación para que alcancen una confluencia del 50 al 60% en un tubo estéril. Prepara la mezcla de transfección. Agregue un microgramo de cada CDNA de interés, 315 microlitros de agua bidestilada y 350 microlitros de 42 pilas milimolares.

Por último, añade 35 microlitros de cloruro cálcico gota a gota para formar el precipitado. Agite el tubo durante cinco segundos y agregue 175 microlitros de suspensión de transfección a cada uno de los cuatro platos. Emplatado el día anterior.

Incubar las células a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de la incubación, retire el medio y lave con PBS. A continuación, agregue dos mililitros de medio de crecimiento, suplementado con cloruro de magnesio de dos milimolares para prevenir la excitotoxicidad mediada por el receptor MDA.

En primer lugar, extraiga dos pipetas de grabación simétricas de vidrio de silicato masculino con un extractor vertical. A continuación, es necesario el pulido al fuego para obtener el diámetro y la resistencia adecuados. A continuación, configure la grabación abriendo el software de adquisición de datos QUB y seleccionando la ventana de adquisición.

Bajo diseño. Abra un nuevo archivo de datos QUB haciendo clic en nuevos datos e introduzca los parámetros experimentales que se van a utilizar. Ajuste la escala de amplitud a 0,1 voltios por pico amperio haciendo clic con el botón derecho en el archivo de datos, seleccionando propiedades y haciendo clic en la pestaña de datos.

Después de reemplazar el medio con dos mililitros de PBS que contienen calcio y magnesio, monte la placa de células en la platina del microscopio. Concéntrese en el campo celular utilizando microscopía de contraste de fase para evaluar que las células están sanas y bien adheridas a la placa en forma de monocapa. Cambie a la detección de fluorescencia para verificar que la transfección se haya realizado correctamente.

A continuación, configure los parámetros para la grabación de un solo canal. Establezca el modo en pinza de voltaje y el voltaje aplicado a más 100 milivoltios con el comando de retención de voltaje. En la posición de apagado, seleccione el botón de prueba de sellado en función de la fluorescencia y la apariencia general.

Elija una celda para parchear: verifique bajo contraste de fase que la celda esté bien adherida a la placa, que tenga una gran parte de la superficie celular expuesta para la parcheo y, por lo demás, se vea saludable. Llene una pipeta recién pulida con una solución adecuada para receptores NMDA y experimentos con células adheridas y agite suavemente para desalojar las burbujas de aire. Fije la pipeta de grabación en la platina del cabezal del amplificador y asegúrese de que el alambre de plata esté sumergido en la solución de pipeta para evitar que la solución de baño entre en la pipeta.

Durante el abordaje, utilice una pequeña jeringa de plástico conectada al soporte de la pipeta para aplicar suavemente presión positiva. A continuación, utilice el micromanipulador para dirigir la pipeta hacia el baño. Cerrando el circuito eléctrico, colóquelo directamente sobre la celda seleccionada para el parcheo.

Tome nota del osciloscopio al entrar en el baño. La resistencia de la pipeta debe estar dentro del rango óptimo mientras se monitorea la posición del tubo visualmente en el microscopio y su resistencia eléctrica en el osciloscopio. Continúe el enfoque en pequeños incrementos hasta que la pipeta incida suavemente sobre la célula.

La señal de prueba disminuirá ligeramente para indicar un aumento de la resistencia. Para formar un sello, levante la jeringa y aplique suavemente una ligera presión negativa a través del tubo lateral. Al tirar de la jeringa, la formación del sello del émbolo se indica mediante un aplanamiento completo de la forma de onda de la señal de prueba en el osciloscopio.

En el amplificador. Cambie el interruptor de comando externo de prueba de sellado a apagado. Cambie el comando de retención de voltaje de apagado a positivo y aumente la ganancia de 10 x a 100 x.

Observe el osciloscopio para ver la actividad del canal, que si está presente se mostrará como desviaciones cuadradas hacia abajo de la línea de base previamente plana. Si se muestra la actividad del canal en el osciloscopio, comience a adquirir datos en el archivo digital previamente abierto en QUB presionando el botón de reproducción, seguido del botón de grabación. Para detener la adquisición de datos, presione el botón de parada en QUB y guarde el archivo QDF. Una señal que no se aplana completamente, o una línea de base que se vuelve ruidosa e inestable puede indicar un sello débil.

En este caso, retire y deseche la pipeta y repita los pasos siguientes con una pipeta nueva hasta obtener un sellado adecuado. Para comenzar el proceso de análisis de datos, abra el archivo de datos registrado en QUB e inspeccione el seguimiento actual en la preinterfaz. Bajo diseño.

Elimine el filtro digital para mostrar el seguimiento registrado en todo el ancho de banda desmarcando la casilla etiquetada fc. Escanee visualmente el rastro para detectar irregularidades y artefactos. Los picos de corriente se pueden corregir resaltando una región limpia adyacente de la misma clase de conductancia.

Al hacer clic con el botón derecho y seleccionar establecer búfer de borrado primero, amplíe el pico hasta que los puntos de muestra individuales sean visibles. Seleccione la región que se va a reemplazar resaltando solo esta región. Haga clic con el botón derecho y seleccione Borrar para corregir la línea base de todo el registro.

Defina la línea base actual cero seleccionando una primera parte del registro en la que la línea base sea estable. Resalte, haga clic con el botón derecho y seleccione establecer línea base. Cuando aparezca la guía base, confirme mediante inspección visual que representa con precisión el nivel de línea base.

Identifique los puntos del registro en los que la línea de base de datos sin procesar se desvía visiblemente de la línea de base establecida. Corrija esto seleccionando una pequeña sección de línea base dentro de la región desviada. Haga clic con el botón derecho y seleccione el comando agregar un nodo de línea base.

Cuando el registro contiene períodos ocasionales con exceso de ruido o artefactos, que no se pueden corregir fácilmente, estas partes deben eliminarse, pero primero deben dividirse en segmentos consecutivos. Resalte inmediatamente antes de la región que se va a descartar. Haga clic con el botón derecho y seleccione segmento de ruptura.

A continuación, resalte la sección que se va a descartar, haga clic con el botón derecho, seleccione, elimine y pulse Intro para idealizar los registros. Cambie a la interfaz MOD en diseño. En el panel de visualización de datos, seleccione una pequeña parte del registro que contenga eventos cerrados y abiertos.

Mueva el cursor al panel de alta resolución que se encuentra debajo y, dentro del trazado seleccionado, resalte un segmento limpio representativo de la línea de base. Mueva el cursor al panel del modelo a continuación, haga clic con el botón derecho en el cuadrado negro, que representará el estado cerrado y seleccione agarrar. Repita el procedimiento para las aberturas de canal resaltando una parte de los rasgos que representa la conductancia abierta.

Haga clic con el botón derecho en el cuadrado rojo en el panel del modelo y seleccione agarrar. Realice la idealización de la parte seleccionada del registro seleccionando el botón SEL en el origen de datos. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón en la pestaña idealizada situada debajo de la sección de modelado en el panel emergente.

Compruebe que los parámetros deseados para el análisis son correctos y, a continuación, haga clic en ejecutar. El resultado de la idealización, junto con el histograma de amplitud de la parte seleccionada, se superpone con los datos para permitir la inspección visual de la idealización. Si es necesario, ajuste los parámetros de idealización para obtener el mejor resultado y repita, realice la idealización para todo el archivo seleccionando el botón archivo en la fuente de datos.

A continuación, haga clic con el botón derecho en la pestaña idealizada y haga clic en ejecutar. Se muestran los resultados de todo el archivo. Superpuesto con los datos, inspeccione cuidadosamente la coincidencia entre el seguimiento idealizado y los datos registrados.

En ocasiones, se identifican erróneamente eventos que se pueden excluir del seguimiento idealizado. Seleccione el evento falso, haga clic con el botón derecho y seleccione unirse a IDL. Aquí se muestran las corrientes de iones de calcio a través de un solo receptor NMDA en una celda HEK 2 93.

Utilizando la técnica de fijación de parche adjunto a la celda, la idealización de datos produce histogramas de amplitud, que encajan muy bien en dos clases de conductancia distintas en esta celda. Grabación adjunta desde celdas HEK 2 93, un canal sensible a Meno se activa en menos 20 milímetros. Presión de mercurio a través de la pipeta de parche durante la aplicación constante de voltaje.

La línea punteada roja indica el nivel de corriente cero. Estas grabaciones de los canales nativos muestran la actividad continua del receptor NMDA registrada en el soma de una neurona que se disoció de la corteza prefrontal de un embrión de rata y se mantuvo en cultivo durante cinco o 27 días. Una vez masterizado, este procedimiento se puede realizar en 30 minutos a una hora, dependiendo de la duración de la grabación.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis cinético y el modelado de estado para determinar el mecanismo de compuerta de un canal y estimar las velocidades de reacción. Después de ver este video, debería tener una comprensión bastante buena de cómo grabar y comenzar a analizar las corrientes a través de una proteína de canal iónico.