Name: Análisis de alto rendimiento de los mamíferos receptores olfativos: Medición de la activación del receptor a través de actividad luciferasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprende a medir la activación de receptores olfativos mediante ensayo de luciferasa en células H3A. Este método de alto rendimiento permite cuantificar respuestas a olores y facilita la identificación de ligandos específicos.

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Esta labor fue apoyada por R01 DC013339, R03 DC011373, y Ruth L. Kirschstein Servicio Nacional de Investigación Premio T32 DC000014. Una parte del trabajo se ha realizado mediante el Monell quimiosensorial Receptor Signaling Core, que es apoyada, en parte, con fondos del NIH P30 DC011735-NIDCD Core Grant. Los autores agradecen a C. Sezille para ayudar con la recolección de datos.

1. Cultivo de células Hana3A <ol><li> Preparar los medios de comunicación de M10 completándolo medio esencial mínimo (MEM) con 10% (v / v) de FBS. </li><li> Mantenimiento Cultura <ol><li> Mantener las células en medios de M10. NOTA: Los vectores de expresión para RTP1L, RTP2, REEP1, y G αolf confieren resistencia a la puromicina a las células Hana3A, pero el mantenimiento de las células con este antibiótico no afecta significativamente a los resultados del ensayo. </li><li> El subcultivo en una proporción de 01:08 en 10 cm de platos cada 2-3 días. </li><li> Incubar a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Las células Plating para la transfección <ol><li> Aspirar los medios de un 100% de confluencia 10 cm placa de células Hana3A. </li><li> Lavar las células mediante la adición de 10 ml de PBS, girando el plato, y aspirar el PBS. </li><li> Añadir 3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA y esperar para que las células se disocian (aproximadamente 1 min). </li><li> Inactivar la tripsina añadiendo 5 ml M10 y romper los grumos de células mediante trituración o menos 10 veces y# 160; con una pipeta de 10 ml. Pipeta con cuidado para evitar la introducción de burbujas de aire en los medios de comunicación. </li><li> Para cada placa de 96 pocillos, de transferencia de 1 ml de células en un tubo cónico de 15 ml, centrifugar a 200 xg durante 5 min, y aspirar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. </li><li> Resuspender las células en 6 ml de M10 por 1 ml de células transferidas en el paso 2.5. </li><li> Pipetear 50 l de células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se incuba durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol> 3. La transfección de olfativas Receptores <ol><li> Preparación de ADN plásmido <ol><li> Preparar ADN plásmido a través de un protocolo libre de endotoxinas. NOTA: Los juegos de preparación de ADN plásmido Uso designados como &quot;libre de endotoxina&quot;, o agregar una etapa de extracción con fenol-cloroformo para el protocolo de preparación de ADN plásmido. </li><li> Diluir el ADN a una concentración de 100 ng / l en tampón TE. </li></ol></li><li> Observar las células chapada (Paso 2.7) para asegurar una adecuada confluencia de aproximacióndamente 30-50% por pozo y volver a la incubadora. NOTA: Mientras esta confluencia no es óptimo para el reactivo de transfección de lípidos, una confluencia del 30-50% en este paso es óptima para la medición de la actividad de luciferasa 24 horas después de la transfección. </li><li> Preparación de la mezcla de transfección <ol><li> Pipetear RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc y pSV40-RL plásmidos en medio MEM por los volúmenes que se detallan en la Tabla 1 para hacer la mezcla de plásmido (volúmenes indicados son por placa de 96 pocillos). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> Mezcla de plásmido </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> por pocillo </td><td> por placa de 96 pocillos </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 l </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S pCI </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-pCI </td><td> 2,5 ng </td><td> 240 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> pCRE-luc </td><td> 10 ng </td><td> 960 ng </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr></tbody></table> Cuadro 1. Componentes de la mezcla de plásmidos. Per así y por volúmenes de placas de 96 pocillos de RTP1S pCI, M3-R-PCI, pCRE-luc y pSV40-RL, y el MEM. </li><li> Para cada placa de 96 pocillos, diluya 18 l de reactivo de transfección de lípidos en medio MEM 450 l. </li><li> Pipeta plásmido mezcla (de la etapa 3.3.1), receptor olfativo rodopsina-etiquetados en el plásmido pCI (Rho-O-PCI), y la mezcla de transfección de lípidos (del Paso 3.3.2) para hacer que el complejo detallada en <strong&gt; Tabla 2. Mezclar la solución por trituración y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min. Detener la reacción añadiendo M10 de acuerdo con la Tabla 2 NOTA:. Esta reacción es sensible al tiempo y no se debe permitir que continúe durante más de 30 min. El cálculo así + 10% es importante para asegurar un volumen suficiente para las etapas posteriores. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> Complejo </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> por pocillo </td><td> por pocillo + 10% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Mezcla de plásmido </td><td> 4.2 l </td><td> 4,58 l </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rho-OR-PCI </td><td> 0,05 ng </td><td> 0,06 ng </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> Mezcla de transfección de lípidos </td><td> 4.2 l </td><td> 4,58 l </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41,7 l </td><td> 45.83 l </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Componentes complejos. Por pocillo y por así + 10% de los volúmenes de mezcla de plásmido (Tabla 1), el plásmido receptor olfativo (Rho-O-PCI), y la mezcla de transfección de lípidos. M10 se añade para extinguir la reacción tras una incubación de 15 min a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Toque en el medio en las placas de células. </li><li> Pipetear 50 l de complejo a cada pocillo e incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol> 4. Olor Estimulación <ol><li> Observar las células transfectadas para asegurar una adecuada confluencia de 50-80% por pocillo y retorno a la incubadora. NOTA: Si las células son menos de 50Lecturas% confluentes, luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla pueden ser demasiado bajos para la medición de la activación del receptor. Considere la posibilidad de descartar la placa. </li><li> Preparar 1 M soluciones madre de cada olor en DMSO. </li><li> Preparar soluciones olor de estimulación en medio CD293. <ol><li> Para los experimentos de cribado, diluir la solución madre de olor a 100 mM. También hay que preparar un control sin olor (CD293 solamente) con el fin de controlar o activación de fondo. NOTA: Para los experimentos de detección, cada par O / olor se prueba sólo una vez por experimento. Debido a que algunos de difusión de olores a través de los pozos es posible, se recomienda para estimular con un odorante para cada placa. </li><li> Para los experimentos de respuesta a la dosis, prepárame siete de 10 veces diluciones seriadas de solución olor de stock por triplicado a partir de 1 mM para cada receptor. También hay que preparar las mismas diluciones de olor en triplicado para las células transfectadas con el vector vacío con el fin de controlar para la activación olor fondo. NOTA: Para los experimentos de respuesta a la dosis, cada una oTratamiento con una concentración dor debe llevarse a cabo por triplicado. </li></ol></li><li> Toque en el medio en las placas de células. </li><li> Pipeta 25 l de solución de estimulación olor a cada pocillo e incubar durante 4 horas. </li></ol> 5. Medición o actividad a través de ensayo de luciferasa <ol><li> Resuspender sustrato de luciferasa de luciérnaga según las instrucciones del fabricante y almacenarlos a -80 ° C. </li><li> Descongelar 1 ml de sustrato de luciferasa de luciérnaga por placa de 96 pocillos. </li><li> Preparar la reacción luciferasa de luciérnaga fresco extintor y el reactivo de sustrato de luciferasa de Renilla (5 l luciferasa extintor / sustrato de luciferasa de Renilla por 1 ml de tampón). NOTA: se necesita aproximadamente 1 ml de reactivo por placa de 96 pocillos. </li><li> Prepare el lector de microplacas luminiscente. Abra el software de lector de microplacas. Dentro del icono del sistema: <ol><li> Bajo el &quot;precalentamiento&quot; Tab, marque la casilla de &quot;ON&quot; y ajuste la temperatura de la máquina a 25 °; C. </li><li> Bajo la pestaña &quot;Dispenser&quot;, acondicionar cada dispensador con 1.000 l de etanol al 70% seguido por 1000 l de agua destilada. NOTA: Use alícuotas separadas de alcohol y agua para cada distribuidor. El etanol se utiliza para la desinfección de los dispensadores, y el agua elimina el etanol residual. </li><li> Primer cada dispensador con 1.500 l de aire (quitar dispensadores de líquido). NOTA: imprimación con aire asegura que los sustratos de luciferasa no se diluyen con agua residual. </li><li> Primer dispensador 1 con 1080 l de sustrato de luciferasa de luciérnaga (de la Etapa 5.2). Primer dispensador 2 con sustrato de luciferasa de Renilla (de la Etapa 5.3). NOTA: Tenga cuidado de no contaminación cruzada de los sustratos de luciferasa. Cebado con sustratos de luciferasa llena el espacio muerto en los dispensadores de reactivos. </li></ol></li><li> Configure el protocolo siguiente para leer tanto luciérnagas y Renilla luciferasa luminiscencia. Dentro del software asociado con el lector de microplacas, de las Naciones Unidasder el menú &quot;Archivo&quot;, haga clic en &quot;Nueva tarea&quot;. Resalte &quot;Protocolos&quot; y hacer clic en &quot;Crear nuevo&quot;. En la siguiente ventana, el círculo al lado de &quot;protocolo estándar&quot; debe ser seleccionado. Haga clic en &quot;Aceptar&quot;. Haga doble clic en &quot;Procedimiento&quot; en el lado izquierdo de la pantalla. <ol><li> Dispensar 10 l de sustrato de luciferasa de luciérnaga a todos los pozos utilizando dispensador 1. En el menú &quot;Actions&quot;, haga clic en &quot;Dosificación&quot;. En la ventana &quot;Dispense Paso&quot;, establezca: &quot;Dispenser&quot; a 1 &quot;Cebado&quot; ninguno, &quot;Volumen de dispensación&quot; a 10 l y &quot;Cambio&quot; a 225 l / seg. Haga clic en &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Agitar la placa durante 30 segundos. Bajo el menú &quot;Actions&quot;, haga clic en &quot;Shake&quot;. En la ventana de &quot;Shake Paso&quot;, ajuste &quot;Intensidad&quot; a medio y &quot;Duración&quot; a doce y media MM: SS. Haga clic en &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Leer la luminiscencia de todos los pozos de 0,5 segundos por pocillo. Bajo el menú &quot;Actions&quot;, haga clic en &quot;Leer&quot;;. En la ventana &quot;Leer Step&quot;, establezca: &quot;Método de detección&quot; de luminiscencia, &quot;Leer Type&quot; al punto extremo, &quot;Tiempo de integración&quot; a 0:00:50 MM: SS: ss &quot;Filter Sets&quot; a 1 &quot;Emisión&quot; a Hole, &quot;Óptica posición&quot; hacia arriba &quot;Gain&quot; a 135, y &quot;Leer Altura&quot; a 1,00 mm. Haga clic en &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Dispensar 10 l de sustrato de luciferasa Renilla a todos los pozos utilizando dispensador 2. Establecer las condiciones que en el Paso 5.6.1, excepto set &quot;Dispenser&quot; a 2. </li><li> Agitar la placa durante 30 segundos. Establecer las condiciones que en el paso 5.6.2. </li><li> Leer luminiscencia de todos los pozos de 0,5 segundos por pocillo. Establecer las condiciones que en el paso 5.6.3. </li></ol></li><li> Retire la tapa de la placa de 96 pocillos y colocar la placa en el lector de microplacas. Inicie el programa creado en el paso 5.5 para leer la placa de luminiscencia. </li><li> Limpie las bombas de distribución de reactivos. Desde el icono de sistema en la pestaña &quot;dispensador&quot;: <ol><li> Purgar 1.000 l de fsustrato de luciferasa irefly desde el dispensador de la luciferasa de luciérnaga en un tubo de recuperación. NOTA: la luciferasa de la luciérnaga puede ser almacenado a -80 ° C y se reutiliza. </li><li> Primer cada dispensador con 1.000 l de agua destilada, seguido de 1,000 l de etanol al 70%, y finalmente 1500 l de aire (quitar dispensadores de líquido). NOTA: El agua elimina sustratos de luciferasa de las bombas de reactivos, desinfecta etanol, y deje secar al aire toda etanol residual. </li></ol></li></ol> 6. Análisis de Datos <ol><li> Exportación de datos <ol><li> En el software de lector de microplacas, haga doble clic en &quot;Constructores Reportar / Exportar&quot; en el lado izquierdo de la pantalla. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Nuevo Exportar a Excel&quot; y haga clic en &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Resalte Export1 y haga clic en &quot;Editar&quot;. <ol><li> En la sección &quot;Contenido&quot; check &quot;Descripción del Sistema&quot;, &quot;procedimiento&quot;, &quot;Plate Descripción&quot; y &quot;Plate Layout Matrix&quot;. Incluir &quot;Datos sin formato&quot; unnd &quot;Calculado de datos&quot;. </li><li> En la sección &quot;Flujo de trabajo&quot;, marque &quot;autoexecute al finalizar el procedimiento.&quot; En el modo de exportación, compruebe &quot;Todas las placas en el mismo libro&quot; y &quot;Como una nueva hoja de cálculo&quot;. </li><li> En &quot;Archivo&quot; elegir el formato de nombre de archivo y ubicación del archivo y haga clic en &quot;OK&quot;. </li><li> Cierre la ventana &quot;Report / Exportar Constructores&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Para obtener valores de luciferasa normalizada, divida la lectura luciferasa de luciérnaga luminiscencia para cada pozo (Paso 5.6.3) por la lectura de luminiscencia Renilla para cada pozo (Paso 5.6.6). </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Identidad odorante es codificada por los patrones de activación de receptores olfativos, pero los patrones de activación del receptor, incluyendo el que los receptores se activan y en qué grado, son conocidos por menos del 6% de los receptores olfativos humanos 1-11. Los esfuerzos para caracterizar receptores olfativos han sido limitados por sus métodos o aplicabilidad de mano de obra intensiva para sólo un subconjunto de la familia de receptores olfativos 17,23,24,33,34. El sistema de expresión he...

El sistema olfativo de los mamíferos tiene la capacidad de responder a un gran número de estímulos olorosos, lo que permite la detección y la discriminación de miles de sustancias odoríferas. Los receptores olfativos (OR) son los sensores moleculares expresadas por las neuronas sensoriales olfativas en el epitelio olfatorio 12. Mamíferos reconocimiento de olores se produce a través de la activación diferencial de las RUP por olores, y la familia de genes OR es extensa, con aproximadamente 1.000 murino y 400 receptores humanos 12-16. Análisis funcionales anteriores de RUP en las neuronas olfativas y en células heterólogas han demostrado que distintas sustancias odoríferas son reconocidos por único, pero los conjuntos de las RUP 10,17-20 superpuestas. Coincidencia de ligandos para las RUP es fundamental para entender el código olfativo y esencial para la construcción de modelos viables de la olfacción. Debido a las dificultades que expresan RUP en sistemas heterólogos, así como el gran número de ambos odorantes y OR, estos datos ha sido en gran parte ausente de la field; de hecho, menos del 6% de los humanos RUP tienen un ligando publicada 1-11. Este protocolo describe el uso de un ensayo de luciferasa para caracterizar odorantes / o interacciones. Este ensayo permite la caracterización de alto rendimiento de las RUP, una tarea que es esencial para entender odorante / o interacciones, así como el desarrollo de un modelo de codificación de olores. Estudios de alto rendimiento de las RUP se enfrentan a tres grandes retos. En primer lugar, RUP expresados ​​en células heterólogas se mantuvieron en la sala de emergencia y posteriormente degradados en el proteasoma 21,22, la prevención de las RUP de la interacción con los odorantes en el sistema de ensayo de 23-25. Este problema fue abordado por el descubrimiento de proteínas accesorias que facilitan la expresión estable de la superficie celular de una amplia gama de RUP 19,26,27. Receptor-transportador de proteínas 1 y 2 (RTP 1 y 2) promover o expresión de la superficie celular y la activación en respuesta a la estimulación olor 19. Basándose en este trabajo, las células HEK293T fueronmodificado para expresar de forma estable a largo RTP 1 (RTP1L) y RTP 2, la expresión de proteína para mejorar el receptor de 1, y G αolf, lo que resulta en la línea celular Hana3A 19,27. Además, el tipo 3 del receptor de acetilcolina muscarínico (M3-R) interactúa con RUP en la superficie celular y aumenta la activación en respuesta a odorantes 26. La co-transfección de un OR con RTP1S y M3-R en Hana3A células da como resultado la expresión robusta, coherente, y funcional de una amplia gama de SRO en la superficie de la célula 27. En segundo lugar, los mamíferos O repertorios son bastante grandes. En los seres humanos, por ejemplo, el repertorio O es un orden de magnitud más numerosos que el repertorio de receptores gustativos, y 2 órdenes de magnitud más numerosos que el repertorio de receptores visual. Aunque la clonación de una sola O es un protocolo relativamente sencillo, se requiere un esfuerzo significativo por adelantado para generar una completa biblioteca. En tercer lugar, aunque sabemos que en la visión, la longitud de onda se traduce en color yen la frecuencia de la audición se traduce en el tono, la organización de los olores es poco conocida, por lo que es difícil para los investigadores interpolan a partir de una muestra representativa de los odorantes. Aunque se han hecho algunos progresos en este frente 10,28, el mapa del paisaje olfativo sigue siendo incompleta. La evaluación de decenas de miles de moléculas en contra de cientos de las RUP es una tarea de enormes proporciones; pantallas de alto rendimiento en este ámbito requieren campañas cuidadosamente definidas. Los principales retos que quedan son las de logística y costo en lugar de los problemas inherentes a la técnica. Aunque selección heteróloga no ha sido ampliamente utilizada para identificar ligandos por grupos académicos, una empresa privada ha usado la misma técnica para identificar ligandos para 100 humanos RUP 29. Desafortunadamente, estos datos siguen siendo propietaria. El ensayo de luciferasa de alto rendimiento descrito aquí tiene varias ventajas sobre los métodos alternativos utilizados para evaluar o activación. Aunque la responses de las neuronas sensoriales olfativas nativas se han medido utilizando electrofisiología y de imágenes de calcio, estas técnicas tienen dificultades bromas aparte que O conduce a la respuesta de una neurona debido a la superposición de propiedades de respuesta de las neuronas olfativas. Aunque golpear-en un tipo de receptor de GFP marcada con 30,31, la entrega de receptores específicos a través de adenovirus a murino neuronas olfativas 32,33, o la realización de la RT-PCR después de grabaciones 17,24,33 puede ligarse grabaciones a tipos de receptores individuales, estos métodos son bajo rendimiento y no es adecuado para pantallas de gran escala. Sistemas de detección heterólogos son más escalables, y dos formas principales se encuentran en la literatura: los reporteros de la vía cAMP y el inositol trifosfato (IP3) de los reporteros de la vía. Al olor estimulación, RUP activan una cascada de señalización T transducción αolf que resulta en la producción de AMP cíclico (AMPc) 12. Por co-transfección de un gen reportero de luciferasa de luciérnaga bajo el control de ACElemento de respuesta a AMP (CRE), la producción de luciferasa se puede medir como una función de la respuesta de olor, lo que permite la cuantificación de o activación. O de activación también puede vincularse a la vía IP3 por la co-expresión de las proteínas G como G α15/16 o un G-α15 olf quimera 24,25,34. Hemos elegido el ensayo que aquí se presenta sobre la base de tres factores: (1) la co-expresión de RTP1 con receptores olfativos etiquetados-Rho mejora la expresión de los receptores olfativos en la superficie celular 19,27; (2) uso de un gen reportero-AMPc de respuesta permite la medición de la o activación a través de la ruta del segundo mensajero canónica; y (3) el ensayo se adapta bien a las pantallas de alto rendimiento. Este ensayo de luciferasa de alto rendimiento es aplicable a una variedad de estudios valiosos en el campo del olfato. En primer lugar, un gran número de RUP puede cribarse contra un único odorante con el fin de determinar el patrón de activación del receptor para un SPodorante ecific. Este tipo de estudio identificó OR7D4 como el OR responsable de responder a la androstenona odorante esteroide 8. Por el contrario, uno o se pueden cribar contra un panel de olores con el fin de determinar el perfil de la respuesta del receptor 10. Cuando el candidato olfativa odorante / o pares se identifican a través de estas pantallas, la interacción se puede confirmar mediante la realización de un experimento de respuesta a la dosis de examinar la respuesta de la O a concentraciones crecientes de odorante. Curvas de respuesta a la dosis también pueden evaluar cómo la variación genética en una OR afecta en respuesta odorante vitro 8,9,11,35, y estos estudios pueden ampliarse a interespecíficos o variación, lo que permite el examen de la evolución del receptor a través de especies y mutaciones causales en la evolución 36,37, Por último, este ensayo puede ser utilizado para seleccionar antagonistas de olor que son capaces de antagonizar o respuesta a un odorante particular para un par odorante / receptor conocido 38,39. En resumen, este altoEnsayo de luciferasa rendimiento es aplicable a una gama de estudios que ayudarán a caracterizar o patrones de activación y proporcionar una mejor comprensión de olor de codificación en el sistema olfativo.

<table><tbody><tr><td>Células Hana3A</td><td>Disponibles en el Laboratorio Matsunami a petición</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTP1S-pCI</td><td>Disponibles en el Laboratorio Matsunami a petición</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M3-R-pCI</td><td>Disponibles en el Laboratorio Matsunami a petición</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCRE-luc</td><td>Agilent</td><td>219076</td><td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td></tr><tr><td>pSV40-RL</td><td>Promega</td><td>E2231</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td></tr><tr><td>Medios esenciales mínimos, Eagle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4655</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp; region=US">MEM</a></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044? ICID=search-16000044">FBS</a></td></tr><tr><td>PBS (sin Ca2+ y Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><<td>a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td></tr><tr><td>Tripsina (0.05% Tripsina EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>25300</td><td><a href="¿https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054? ICID=producto-de-búsqueda">Tripsina</a></td></tr><tr><td>CD293</td><td>Life Technologies</td><td>11913-019</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019? ICID=search-11913019">CD293</a</td></tr><tr><td>>96-pocillos PDL blanco/transparente</td><td>BD BioCoat</td><td>356693</td><td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">placas</a></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección de lípidos: Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019? ICID=search-11668019">Lipofectamina</a></td></tr><tr><td>Sustrato de luciferasa de luciérnaga, extinguidor de luciferasa de luciérnaga de luciérnaga/Renilla sustrato de luciferasa: Ensayo de doble glo</td><td>Promega</td><td>E2980</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&__utmx=-&__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td></tr><tr><td>Synergy S2&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>SLAD</td><<td>a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td></tr><tr><td>Software de lectura de microplacas: Gen5 Software de análisis de datos BioTek</td><td></td><td>Gen5</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td></tr><tr><td>BIOSTACK</td><td>BioTek</td><td>BIOSTACK2WR</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td></tr><tr><td>Multiflo</td><td>BioTek</td><td>MFP</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4414</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips ViaFlo96</td><td>Integra</td><td>6433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips 384 XYZ</td><td>Integra</td><td>6403</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td></tr><tr><td>384ViaFlo</td><td>Integra</td><td>6030</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Macherey Nagel</td><td>740797.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp; region=US">DMSO</a></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN100-0010</td><td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td></tr></tbody></table>

análisis de alto rendimiento de los mamíferos receptores olfativos: medición de la activación del receptor a través de actividad luciferasa

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorantes crear patrones únicos y solapados de la activación del receptor olfativo, lo que permite una familia de aproximadamente 1.000 murino y 400 receptores humanos de reconocer miles de sustancias odoríferas. Ligandos odorizantes se han publicado para menos de 6% de los receptores humanos 1-11. Esta falta de datos se debe en parte a las dificultades que expresan funcionalmente estos receptores en sistemas heterólogos. Aquí, se describe un método para la expresión de la mayoría de la familia del receptor olfativo en las células Hana3A, seguido de evaluación de alto rendimiento de la activación del receptor olfativo usando un ensayo de indicador de luciferasa. Este ensayo se puede utilizar para (1) paneles de la pantalla de odorantes contra paneles de receptores olfativos; (2) confirmar la interacción odorante / receptor a través de las curvas de dosis-respuesta; y (3) comparar los niveles de activación del receptor entre variantes del receptor. En nuestros datos de la muestra, 328 receptores olfativos se proyectaron contra 26 odorantes. Pares Odorante / receptor con puntuaciones de las respuestas fueron variadas selecciónTed y probado en respuesta a la dosis. Estos datos indican que una pantalla es un método eficaz para enriquecer para los pares de odorante / receptor que pasarán un experimento de respuesta a la dosis, es decir, los receptores que tienen una respuesta de buena fe a un odorante. Por lo tanto, este ensayo de luciferasa de alto rendimiento es un método eficaz para caracterizar los receptores olfativos-un paso esencial hacia un modelo de olor de codificación en el sistema olfativo de los mamíferos.

Una pantalla primarios probados 328 RUP contra olores 26 a una concentración de 100 mM. Esta concentración de olor ha sido demostrado para activar eficazmente una gran proporción de las RUP con ligandos conocidos 10. En primer lugar, la actividad de la luciferasa normalizada se calculó dividiendo la lectura de luciferasa de luciérnaga por la lectura de luciferasa de Renilla. A continuación, los valores baselined se calcularon restando las lecturas de luciferasa normalizada para el control si...

Los patrones de activación de receptores olfativos codifican identidad olor, pero la falta de datos publicados identificar ligandos de olor para los receptores olfativos de mamíferos dificulta el desarrollo de un modelo integral de olor de codificación. Este protocolo describe un método para facilitar la identificación de alto rendimiento de ligandos de receptores olfativos y cuantificación de la activación del receptor.

Análisis de alto rendimiento de los mamíferos receptores olfativos: Medición de la activación del receptor a través de actividad luciferasa

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

El objetivo general del siguiente experimento es realizar una medición de alto rendimiento de la activación del receptor olfativo a través de un ensayo de luciferasa. Esto se logra seccionando H tres células A con vectores que contienen proteínas accesorias, luciferasa de luciferasa de luciérnaga y vainilla y receptores olfativos para expresar un receptor olfativo diferente. En cada pocillo de una placa de 96 pocillos.Como segundo paso, las células se estimulan con olores. A continuación, se añade un sustrato de luciferasa que hace que las células que produjeron la enzima luciferasa se luminiscen, funcionando así como un indicador de la activación del receptor olfativo. En última instancia, los resultados muestran las respuestas de la población de receptores olfativos a los olores en función de la luminiscencia de cada pocillo de la placa.Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como el adenoviral, la transducción de neuronas nativas o la obtención de imágenes de calcio, es que esta técnica se escala a pantallas de alto rendimiento y utiliza la vía del segundo mensajero mediada por CM nativo para examinar la activación del receptor olfativo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del olfato, como la coincidencia de ligandos de olor, es decir, receptores olfativos, y el examen del efecto de la variación genética en la activación de los receptores olfativos. Las células Hanna tres A utilizadas en este protocolo se mantienen en medios M 10 a 37 grados Celsius con 5% de CO2, y deben ser 100% confluentes para que las células se formen para los medios de aspiración de transfección de una placa de 10 centímetros de células de lavado.Al agregar 10 mililitros de PBS, girando el plato y aspirando el PBS, agregue tres mililitros de 0.05% trips en EDTA y espere aproximadamente un minuto para que las células se disocien a temperatura ambiente. Inactive la tripsina agregando cinco mililitros de medio M 10 y rompa los grupos de células mediante una clasificación triple aproximadamente 10 veces con una pipeta de 10 mililitros. Pipetear con cuidado para evitar introducir burbujas de aire en el medio.Por cada placa de 96 pocillos, transfiera un mililitro de células a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar a 200 veces la gravedad durante cinco minutos y aspirar el sobrenadante sin perturbar la resolución de los pellets de la célula. Suspender las células en 12 mililitros de pipeta M 10, 50 microlitros de células en cada pocillo de las placas de 96 pocillos e incubar durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de CO2.Antes de comenzar este procedimiento, observe las celdas sembradas el día anterior para asegurar una fluidez adecuada de aproximadamente 30 a 50% por pocillo. Regrese las placas a la incubadora y continúe. Para preparar la transfección, mezcle los plásmidos para expresar proteínas accesorias.La luciferasa de luciérnaga y la luciferasa de vainilla se han diluido cada una a una concentración de 100 nanogramos por microlitro en tampón TE para hacer que la mezcla de plásmidos pipetee los plásmidos en medio mem según los volúmenes indicados en esta tabla. Por cada placa de 96 pocillos, diluya 18 microlitros de reactivo de transfección de lípidos en 450 microlitros de medio mem para hacer la mezcla de transfección de lípidos. A continuación, pipetea el plásmido.Mezcle el plásmido con el receptor olfativo marcado con opsina y la mezcla de transfección lipídica hasta obtener una placa MICROTITER limpia. Para hacer el complejo detallado en esta tabla, el pozo más el 10% de cálculo es importante para garantizar un volumen suficiente para los pasos siguientes. Mezcle la solución por triple curación e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.Detenga la reacción agregando M 10 de acuerdo con la tabla. Para el éxito de este procedimiento, es importante que las células nunca se queden sin medios durante más de dos minutos. Mientras se agregan las soluciones a los pozos.Retire las células de la incubadora e invierta la placa celular y saque la pipeta de medios 50 microlitros de complejo en cada pocillo e incube durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de CO2 al día siguiente de la transfección de los receptores olfativos. Observe las células transfectadas para asegurar una fluidez adecuada del 50 al 80% por pocillo y devuelva las células a la incubadora. El olor se ha diluido a una concentración de un molar y el DMSO para los experimentos de cribado diluye cada solución madre de olor a 100 micromolares.Además, prepare un control sin olor que contenga solo medio CD 2 93 para controlar la activación del receptor olfativo de fondo. Retire las células de la incubadora y extraiga los medios de las placas de las células. Pipetear 25 microlitros de solución de estimulación de olores en cada pocillo e incubar a 37 grados centígrados con 5%CO2 durante cuatro horas.Comience este procedimiento. Descongelación de un mililitro de sustrato de luciferasa luciérnaga por cada 96. La placa de pozo prepara el extinguidor de la reacción de luciferasa de luciferasa de luciérnaga de fuego y el reactivo de sustrato de luciferasa de vainilla corrido.Se necesita aproximadamente un mililitro de reactivo por placa de soldadura 96. A continuación, prepare el lector de microplacas luminiscentes dentro del icono del sistema en la pestaña de precalentamiento. Marque la casilla de encendido y ajuste la temperatura de la máquina a 25 grados centígrados en la pestaña del dispensador.Prepare cada dispensador con 1000 microlitros de etanol al 70%, seguidos de 1000 microlitros de agua destilada. Use alícuotas separadas de alcohol y agua para cada dispensador. Prepare cada dispensador con 1.500 microlitros de dispensador de cebado de aire.Uno con 1080 microlitros de dispensador de sustrato de luciferasa de luciérnaga. Dos con sustrato de luciferasa ranil. Tenga cuidado de no contaminar de forma cruzada los sustratos de luciferasa.Configure el siguiente protocolo para leer la luminiscencia de luciferasa de luciferasa de luciérnaga de luciérnaga y luciferasa de vainilla dentro del software. En el menú de archivos. Haga clic en nuevos protocolos de resaltado de tareas y haga clic en crear nuevo.En la siguiente ventana, se debe seleccionar el círculo junto al protocolo estándar. Haga clic en Aceptar. Haga doble clic en el procedimiento.En el lado izquierdo de la pantalla, dispense 10 microlitros de sustrato de luciferasa de luciferasa de luciérnaga de luciérnaga a todos los pocillos usando el dispensador uno en el menú de acciones, haga clic en dispensar en la ventana de paso de disipación. Coloque el dispensador en uno. No cebando a ninguno.Dispense el volumen a 10 microlitros y la tasa a 225 microlitros por segundo, haga clic en OK. Agite el plato durante 30 segundos en el menú de acciones, haga clic en agitar en la ventana del paso de agitación. Establezca la intensidad en media y la duración en 30 clics. Bien.Lea la luminiscencia de todos los pocillos durante 0,5 segundos por pocillo en el menú de acciones. Haga clic en leer en la ventana de paso de lectura, establezca el método de detección en luminiscencia, el tipo de lectura en el tiempo de integración del punto final a 50, los conjuntos de filtros a una emisión a la óptica completa, la posición a la ganancia superior a 1 35 y la altura de lectura a 1,00 milímetros. Haga clic en Aceptar.Dispensar 10 microlitros de sustrato de luciferasa ran a todos los pocillos utilizando el dosificador dos. Configure las condiciones como se muestra para usar el dispensador. Uno, excepto el dispensador establecido en dos.Agite el plato durante 30 segundos. Lea la luminiscencia de todos los pocillos durante 0,5 segundos por pocillo. Retire la tapa de la placa de 96 pocillos y colóquela en el lector de microplacas.Inicie el programa previamente configurado para leer la luminiscencia de la placa una vez completada la lectura. Limpie las bombas del dispensador de reactivos desde el icono del sistema debajo de la pestaña del dispensador. Purgue 1000 microlitros de sustrato de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciérnaga de luciérnaga en un tubo de recuperación.Cada dispensador con 1000 microlitros de agua destilada seguidos de 1000 microlitros de etanol al 70%. Y, por último, los 1.500 microlitros de aire que se muestran aquí son los resultados de una criba primaria que probó 328 receptores olfativos o OR contra 26 olores a una concentración de 100 micromolares. Este histograma muestra la frecuencia o el recuento de los valores basales de luciferasa calculados para cada odorante o par en la pantalla, ya que los pares de activación del receptor de odorantes son escasos.La mayoría de los valores están centrados en cero y la distribución central grande estima la distribución del ruido para este ensayo. Se realizaron curvas de dosis-respuesta en 48 odorantes o pares distribuidos aleatoriamente a lo largo del rango de valores basales indicados por las barras de colores. Las barras azules son pares que se clasificaron como agonistas en función de la respuesta a la dosis completa, y las barras rojas son pares que no se clasificaron como agonistas.A continuación, la tasa de verdaderos positivos se representó con la tasa de falsos positivos utilizando el paquete estadístico R. El área bajo la curva o un CU es 0,68, lo que indica que el odorante o los pares con valores más altos de luciferasa tienen más probabilidades de transmitir la respuesta a la dosis que aquellos con valores más bajos. Estos datos sugieren que el cribado primario es un método útil para enriquecer en busca de odorantes o pares que se clasificarán como agonistas en un experimento de respuesta a dosis completa.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente seis horas durante 5 placas de 96 pulgadas, excluyendo el tiempo de incubación si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis de alto rendimiento de los receptores olfativos mediante la estimulación de olores por transfección y la medición de la activación con el ensayo de luciferasa.

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Investigación

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Neurociencia

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