Un Ex vivo Sistema de Cultura para estudiar el desarrollo de la tiroides

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar un cultivo ex vivo, un ratón, implantes de tiroides embrionarios o lóbulos para permitir el estudio de los eventos morfogenéticos y de diferenciación que ocurren durante el desarrollo de la tiroides. Esto se logra extirpando primero la mandíbula superior y la parte inferior del cuerpo del día embrionario. E 12.5 a E 14.5 embriones de ratón para aislar la región del cuello de los embriones.

En el segundo paso, se extirpan el tubo neural, los tejidos laterales y la lengua para exponer la parte superior de la tráquea y el esófago. A continuación, la yema de la tiroides, las regiones o los lóbulos se limpian aún más de cualquier tejido no deseado. En el paso final, los implantes de tiroides se siembran para su cultivo en un micropocillo recubierto o en un filtro.

En definitiva, se pueden realizar imágenes de lapso de tiempo, tinción de inmunos o análisis de expresión génica para estudiar la morfogénesis epitelial, la organización tridimensional y los folículos, la vascularización de los implantes o la diferenciación de los progenitores tiroideos. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave del desarrollo y la diferenciación. Pregunta sobre la organización de las células epiteliales tiroideas en 3D, formación de lúmenes, diferenciación celular, polarización y crecimiento.

Fidel Marcel, estudiante de posgrado, y Myla LaCorte, postdoctoral, ambos de mi laboratorio demostrarán el procedimiento en condiciones estériles en la campana de flujo laminar. Dos horas antes del aislamiento del tejido tiroideo, diluya el colágeno estéril tipo uno a 50 microgramos por mililitro. Concentración final en cloruro de hidrógeno de 10 milimolares, y colocar el colágeno en hielo.

A continuación, cubra cada uno de los pocillos de una cámara de cultivo de plástico con 200 microlitros del colágeno diluido e incube la cámara a temperatura ambiente Después de dos horas, aspire el colágeno. Enjuague los pocillos con medio M1 99 y agregue un volumen mínimo de 200 microlitros de medio de cultivo a cada uno. Coloque las cámaras recubiertas en la incubadora y luego proceda con la disección de la tiroides.

Primero, coloque el útero diseccionado en una placa de 10 centímetros que contenga HBSS. A continuación, utilice fórceps para sujetar una extremidad del útero y luego abra el útero con unas tijeras pequeñas para liberar consecutivamente cada uno de los embriones. Use las tijeras para separar los embriones de la placenta y luego transfiera los embriones dentro de sus membranas embrionarias adicionales a una nueva placa de 10 centímetros que contenga HBSS fresco.

A continuación, continúe la disección bajo un microscopio estereoscópico para cada embrión. En primer lugar, retira el saco vitelino y el amnios. A continuación, sosteniendo agujas de tungsteno en capilares de vidrio como cuchillo y tenedor.

Retira la parte superior de la cabeza, incluyendo la mandíbula superior y las orejas. Sostén el embrión boca arriba. A continuación, se extrae un trozo extra del tubo neural y después se extrae la parte inferior del embrión, justo debajo de las extremidades anteriores y por encima del corazón.

Para orientar el tejido, transfiera el corte de embrión que contiene la lengua de la región del cuello a una nueva placa de 10 centímetros que contenga HBSS fresco y extraiga el tubo neural y los tejidos posteriores al esófago y la tráquea. Ahora seccione suavemente la rebanada de pañuelo a lo largo de ambos lados de la lengua. A continuación, localice el esófago y la tráquea, diseccione la lengua, dejando el retinoide hinchado y el tejido a ambos lados del esófago y la tráquea.

Después de retirar la lengua, diseccione el esófago y coloque la tráquea con el lado ventral hacia arriba. A continuación, diseccione los tejidos no deseados, como el timo y todos los tejidos situados lateralmente a las arterias del arco faríngeo. Luego, para los embriones E 13.5 o E 14.5, visualice los lóbulos tiroideos a cada lado de la tráquea y diseccione aún más los lóbulos de la tráquea.

En el caso de los embriones E 12,5, la disección puede realizarse como se acaba de demostrar hasta después de la extirpación de la lengua y el esófago. Luego, después de localizar las arterias del arco faríngeo, extraiga todos los tejidos laterales como para los embriones E 13.5 a 14.5. Por último, utilizando una punta de filtro prehumedecida en una micropipeta P 200, transfiera el tejido aislado a una placa de cultivo de 35 milímetros que contenga un medio de cultivo precalentado.

Antes de sembrar el E 13.5 a E 14.5 tiroides X explique. Primero, lave el tejido mediante transferencia sucesiva a tres pocillos de una placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de medio de cultivo precalentado para colocar los lóbulos en las cámaras prerrecubiertas. En primer lugar, aspire el medio de cultivo y utilice una micropipeta con puntas filtradas para colocar cuidadosamente un lóbulo tiroideo en cada una de las cámaras de cultivo.

Retire el exceso de medio y luego coloque la cámara de cultivo en una incubadora de cultivo de tejidos para permitir que los explantes se adhieran a la matriz. Luego, después de dos horas, agregue suavemente de 200 a 300 microlitros de medio de cultivo precalentado a cada pocillo y vuelva a colocar las cámaras en la incubadora para colocar la región de la tráquea E 12.5 o los lóbulos tiroideos en filtros semiporosos. Primero, llene los pocillos de una placa de 24 pocillos con ciento 30 microlitros de cultivo precalentado.

Coloque filtros en el medio. Tenga cuidado de evitar atrapar burbujas de aire debajo del filtro de cultivo. A continuación, utilice una micropipeta con puntas filtradas para transferir cuidadosamente el explan o los lóbulos tiroideos, y un volumen mínimo de medio en el centro de cada uno de los filtros hasta un máximo de cuatro x explan por filtro.

Cuando se colocan las X en el filtro, es importante transferirlas al centro del filtro con una cantidad mínima de medio para evitar que el medio entre en contacto y cree meniscos con la pared del filtro. Finalmente, retire el exceso de medio y use una aguja de tungsteno para espaciar esto. A continuación, colóquelos en la incubadora de cultivo de tejidos durante un máximo de siete días, cambiando el medio de cultivo cada dos días bajo la campana de flujo laminar.

Después de un día de cultivo en un filtro, la línea media de laa es visible como un tejido alargado que abarca la longitud superior y forma dos lóbulos a cada lado de la tráquea. Con el cultivo, los lóbulos se expanden experimentando una organización de morfogénesis de las células epiteliales en estructuras foliculares macroscópicamente visibles. Como se demuestra en estas imágenes, la organización y polarización de las células epiteliales coherentes y positivas se pueden visualizar mediante el etiquetado inmunológico ezrin.

Con el tiempo, las estructuras intracelulares positivas para ezrina se fusionaron con el polo de la célula que se convertirá en el polo apical. Durante este proceso, las células endoteliales positivas cuatro pcam proliferan y se organizan alrededor de los folículos en desarrollo para formar unidades angiofoliculares. Para cuantificar la diferenciación de las células thro, citos y C, la expresión génica se puede ensayar mediante R-T-Q-P-C-R de ARN, aislado de los lóbulos tiroideos cultivados.

Mientras que la expresión del factor de transcripción tiroidea, NK X 2.1 no cambia durante el cultivo, la expresión de la tiroglobulina específica y de la calcitonina específica de las células C aumenta drásticamente, lo que indica una diferenciación funcional. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar y cultivar la tiroides explan. No está preparado para realizar un experimento de ganancia y pérdida de función con embriones de tipo salvaje o NOCO.