Name: Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a realizar un ensayo de adherencia estática para cuantificar la adhesión de linfocitos T humanos usando marcadores fluorescentes CFSE. Este método permite evaluar efectos de tratamientos sobre la activación de integrinas en células inmunitarias.

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Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Scholars fondos de investigación, y la participación de la NYU Whitehead apoya este trabajo.

1. Revestimiento de la microplaca Wells Nota: El objetivo de este paso es a las superficies de poliestireno capa con la ICAM-1 para servir como ligandos para células T de LFA-1. <ol><li> Preparar las siguientes soluciones: <ol><li> Preparar la solución de recubrimiento mediante la resuspensión recombinante de ICAM-1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) enriquecida con calcio (1 mM CaCl2) y magnesio (2 nM de MgCl 2). Asegúrese de que la concentración final de ICAM-1 es de 10 g / ml, elaborados a partir de una solución madre de 0,7 mg / ml y se mantuvieron en un -80 ° C congelador. </li><li> Preparar la solución de la adhesión mediante el enriquecimiento de PBS con 0,5% humana (o bovina) de albúmina de suero (HSA / BSA), 2 mM de MgCl 2, y 1 mM de CaCl2. </li><li> Prepare la solución de lavado añadiendo 2 mM MgCl 2 y 1 mM CaCl 2 a PBS. Calentar todas las soluciones a 37° C antes de su uso. </li></ol></li><li> Lávese 24 pozos con 50 l de solución de lavado. Esto incluirá pozos sin lavar (células tratadas con PMA) positivos, y (pozos sin revestimiento) de los controles negativos. Para cada condición establecida por lo menos tres pozos (por triplicado). </li><li> Añadir 50 l de solución de revestimiento a cada pocillo. No agregue a los pocillos de control sin revestir. Incubar durante una hora en el interior 37 ° C incubadora. </li><li> Aspirar la solución de recubrimiento suavemente, sin permitir que la punta toque el fondo de los pocillos. Lavar una vez con 50 l de solución de lavado. </li><li> Añadir 50 l de solución de adherencia y se incuba la microplaca durante una hora en el interior 37 ° C incubadora. </li><li> Aspirar con cuidado y lavar una vez con 50 l de solución de lavado. Utilice la placa en el mismo día, sin embargo es posible que la mantenga a 4 ° C durante la noche, y usarlo al día siguiente. </li></ol> 2. T aislamiento de células de la sangre <ol><li> Añadir humana T cóctel de enriquecimiento de células a 50 l / ml de of sangre entera (por ejemplo, para 3 ml de anticoagulante (heparina, EDTA o citrato) de sangre entera, añadir 150 l de cóctel). Mezclar bien. </li><li> Incubar 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Para un tubo de centrífuga de 50 ml añadir 3 ml de sangre tratada y un volumen igual de PBS (sin calcio y magnesio) enriquecida con 1% de D-glucosa a temperatura ambiente. Mezclar suavemente con una pipeta Pasteur. </li><li> Añadir 15 ml de Ficoll-Paque PLUS al tubo de centrífuga. </li><li> Capa con cuidado los 6 ml diluidos muestra de sangre en el medio de aislamiento de linfocitos. </li><li> Se centrifuga a 400 × g durante 20 min a 20 ° C con rotura de apagado. </li><li> Trasvasar la capa superior con una pipeta Pasteur limpia, dejando la capa de linfocitos imperturbable en la interfase. La capa superior de plasma se puede guardar para su uso posterior. Con una pipeta Pasteur limpia transferir la capa de linfocitos a un tubo de centrífuga limpio. </li><li> Añadir 3 volúmenes (9 ml) de PBS para los linfocitos. Suspender las células suavemente por la Dra.ala ellos dentro y fuera de una pipeta Pasteur. </li><li> Se centrifuga a 400 × g durante 5 min a 20 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Los linfocitos ahora deben ser suspendidos en el medio apropiado para la aplicación. Transferir las células a un frasco de cultivo T-75 en 20 ml de RPMI 1640 que contenía 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina. </li></ol> 3. Preparación de las células Nota: Un requisito previo es que las células se pueden etiquetar con un reactivo fluorescente. En este protocolo utilizar carboxi éster de succinimidilo de fluoresceína (CFSE), proteína fluorescente sin embargo verde (GFP) son células que expresan una alternativa aceptable. <ol><li> Cuente 2,4 x 10 6 células T (1 x 10 5 para cada pocillo) usando un hemocitómetro. </li><li> Resuspender las células en medios de cultivo que carece de suero (privación de suero). Se incuban las células durante 2 horas en la incubadora a 37 ° C. </li><li> Centrifugar las células durante 5 min (400 xg). Aspirar los medios de comunicación yresuspender en 1 ml de PBS. </li><li> Añadir CFSE a 1:1000 dilución (caldo hecho con 5 mM). Cubra la luz y se incuba durante 8 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Se detiene la reacción mediante la adición de 10 ml de 37 ° C PBS y centrifugar a 400 xg durante 5 min. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento celular con 1,2 ml de solución de adherencia precalentado (1 x 10 5 células por 50 l). </li></ol> 4. Estimulación de las células Nota: Con el fin de iniciar la adhesión, las células deben ser estimulados. En el siguiente experimento, las células son estimuladas a través del TCR usando anticuerpos anti-CD3 de reticulación, sin embargo solubles SDF-1 podría servir como una alternativa. Dependiendo del objetivo de los experimentos, varios reactivos farmacológicos podrían añadirse antes o durante la estimulación para estudiar el impacto de la adhesión celular. Forbol miristato acetato (PMA) es un éster de forbol que es estructuralmente similar a la segunda diacil-glicerol mensajero (DAG) y por lo tanto activa múltiples quinasas en sentido descendente del TCR (principalmente la proteína quinasa C); Aquí se usa como un control positivo. <ol><li> Calentar la microplaca a 37 ° C. </li><li> Dividir las células en 8 vacíos tubos de 1,5 ml (150 mu l en cada tubo), un tubo para cada condición. </li><li> Tratar a las células en consecuencia: <ol><li> Estimular un tubo con PMA a 10 ng / ml para servir como control positivo. Mantenga tres tubos sin tratar, para servir como control para la estimulación (&quot;sin estimulación&quot;), el control de la carga sin lavar (&quot;sin lavado&quot;), y el control de ICAM-1 capa (&quot;sin recubrimiento&quot;). </li><li> Estimular cuatro tubos con diferentes concentraciones de anticuerpos anti-CD3 (0,1, 1, 5, y 10 mg / ml). Continúe en el siguiente paso sin retrasos. </li></ol></li><li> Alícuota de 50 l de mezcla de células estimuladas en cada pozo vacío. El número final de células por pocillo es 1 x 10 5. </li><li> Coloque la microplaca en el 37 ° C incubadora durante 15 min. Nota: Algunas líneas de células T requieren estimulación más corto<html> tiempo ción. Durante este tiempo, las células se establecerán a la parte inferior de los pocillos y se adhieren a los ligandos diana. </li></ol> 5. Lavamiento células no adherentes Nota: El objetivo de este paso es eliminar las células que no eran capaces de formar contactos estrechos con las superficies recubiertas con ligando. Utilizar una pipeta multicanal para este paso con el fin de garantizar que las mismas fuerzas físicas se aplican a todos los pocillos. Es importante mantener los pocillos de control indicados sin lavar para ayudar en el cálculo del porcentaje de células adherentes. <ol><li> Añadir 150 l de solución de adherencia caliente para cada uno pozos. Agitar suavemente la placa durante unos segundos antes de retirar el medio de los pocillos. No toque el fondo de los pozos con las puntas. </li><li> Repita este paso tres veces. Cambie la dirección de la pipeta al pipetear el buffer de entrada y salida. </li></ol> 6. La determinación del porcentaje de células adherentes _content &quot;&gt; Nota: En este paso un lector de placas fluorescente se utiliza para medir la intensidad de fluorescencia dentro de cada pocillo La intensidad está en correlación directa con el número de las células adherentes.. <ol><li> Encienda el lector de placas. Abra el software de lector de placas haciendo clic en el icono de acceso directo en el escritorio. <ol><li> En el menú &quot;Tareas&quot;, haga clic en &quot;Nuevo&quot; para crear un nuevo protocolo. </li><li> En el menú &quot;Actions&quot; elija la opción &quot;Leer&quot;. Haga clic en &quot;intensidad fluorescente&quot; y pulsa la pestaña &quot;Ok&quot;. </li><li> Desde el menú desplegable, seleccione &quot;longitud de onda de excitación 485&quot; y &quot;longitud de onda de emisión 528&quot;. Pulse la pestaña &quot;Ok&quot;. </li><li> En el menú de opciones &quot;óptica&quot;, seleccione &quot;Bottom&quot; y pulsa la pestaña &quot;Ok&quot;. Volver al menú &quot;Actions&quot; y ajustar la temperatura a 37 ° C y haga clic en &quot;Ok&quot;. </li><li> Inserte la microplaca en el lector de placas yhaga clic en &quot;Ejecutar&quot;. El resultado se puede exportar a hoja de cálculo Excel. </li></ol></li><li> Calcular el porcentaje de células adherentes utilizando la siguiente fórmula: Porcentaje de células adherentes = (intensidad de fluorescencia media leer en los pocillos lavados) / (intensidad de fluorescencia media de leer en las células sin lavar) x 100%. </li></ol>

<ol><li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li>
<li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li>
<li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-triggered+leukocyte+arrest%3A+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li>
<li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cells+in+motion%3A+migrating+toward+improved+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li>
<li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li>
<li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li>
<li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li>
<li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+adhesion+of+CD4%2B+T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li>
<li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li>
<li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios ensayos para estudiar las señales a la LFA-1 de activación y adhesión de células T 12. La citometría de flujo se utiliza para medir la LFA-1 estados de afinidad en las células vivas utilizando anticuerpos monoclonales que se unen selectivamente a cualquiera de doblado o extendido de LFA-1. Una de las limitaciones de este método es que no tiene en cuenta la avidez de las integrinas. Migración ensayos son herramientas útiles, pero miden la migración, y no la adhesión miserable en un punto de tiempo e...

Adhesión de los linfocitos T es un proceso fundamental en la respuesta inmune 1. Se requiere para la interacción de células T con células endoteliales decoración de las paredes de los capilares, para el antígeno de células presentadoras de barrido (APC) dentro de los ganglios linfáticos, y para la formación de sinapsis inmunológica (IS) con las células diana 2. Estos requisitos son funcionalmente y cinéticamente distintas. El proceso de la extravasación de linfocitos consiste quimioatracción, laminados, la adhesión firme y la transmigración. La transición de la rueda a la adhesión firme requiere que las células T para responder a una señal de receptor acoplado a proteína G rápidamente. Esta respuesta se obtiene una interacción ligando integrina que ralentiza y detiene la célula de rodaje 3. Un cambio inmediato en la avidez de la integrina medie este proceso. La migración requiere interacciones betweenTcells dinámicas y las células endoteliales con la formación de adherencias en el &#39;front-end&#39; y la rotura de adherencias en la &quot;parte trasera&quot;con un intervalo de aproximadamente un minuto entre la formación y la ruptura 4. El IS forma inminutes, pero debe permanecer intacto durante horas 6. Curiosamente, una molécula de adhesión, la función de los linfocitos miembro de la familia de integrinas antígeno asociado (LFA) - 1, es esencial para todos estos procesos 5. LFA-1 media la adhesión a través de interacciones con varios miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. El ligando más ampliamente estudiado con la mayor afinidad a la LFA-1 es la molécula de adhesión intercelular (ICAM) -1. Linfocitos circulantes no activadas expresan baja afinidad de LFA-1 en la superficie celular, y por lo tanto son incapaces de adherirse a la ICAM-1 recubiertos superficies. LFA-1 afinidad es variable y regulada por varios eventos de señalización tales como la activación de la proteína G de receptores acoplados, la estimulación de citoquinas, y las señales mediadas por receptores de células T (TCR). La forma de alta afinidad resultante de la LFA-1 transmite la activación intracelular al espacio extracelular tediante interacciones con la ICAM-1. Esta vía se denomina dentro-fuera de señalización 7. Del mismo modo, la señalización a través de LFA-1 desde el espacio extracelular se llama fuera-en la señalización. La cascadas de señalización intracelular que participan en el interior-y exterior-en la señalización son un foco importante de la investigación actual. La pequeña GTPasa Rap1 ha surgido recientemente como el componente clave de dentro a fuera de señalización que es común tanto a la ligadura de TCR y la señalización de citoquinas 8. El papel crítico de Rap1 en activación de la integrina se pone de relieve por el descubrimiento de que la sobreexpresión de Rap1 estimula la adhesión dependiente de integrina de las células T, mientras que la adhesión de células T está bloqueada por la expresión de dominante negativo Rap1 9. Estos avances en nuestra comprensión de la regulación de la integrina por Rap1 han llevado a cabo utilizando herramientas vitro. Entre ellos se encuentra el ensayo de adhesión estática se describe aquí. El objetivo general de este método es el estudio de Tadhesividad de células a la ICAM-1 las superficies recubiertas. Más específicamente, se utiliza para medir y cuantificar objetivamente la LFA-1 afinidad hacia sus ligandos contador en células vivas en tiempo real, bajo diferentes condiciones. Esta técnica utiliza pocillos de poliestireno recubiertas con ICAM-1 para imitar las superficies celulares que las células T interaccionan con. Muchos ensayos de adhesión de células T estáticos descritos anteriormente fueron experimentalmente complejo. Estos ensayos a menudo necesarios para las células T que se marcaron radiactivamente, utilizan células corneales bovinas cultivadas para crear una matriz extracelular como el sustrato para la adhesión de las células T, o llamados para no fisiológica estimulación de células T durante una duración prolongada para promover la adhesión de células T 10. El uso de la medición fluorométrica para cuantificar las células T después de la incubación de adherencia es un método más sensible y precisa de la cuantificación en comparación con la citometría de flujo y microscopía, como se utilizan en muchos otros sistemas de ensayo 11. Además, solo microscópicas de célulasIC análisis de la localización de la integrina no permite el análisis amplio, la población basada en la misma forma que la medición fluorométrica. Mientras que la activación de LFA-1 anticuerpos específicos de cada estado están disponibles comercialmente, estos anticuerpos ofrecen baja sensibilidad en relación con el método descrito aquí. La principal ventaja sobre las técnicas alternativas es su simplicidad y la capacidad de examinar múltiples condiciones experimentales simultáneamente. Al considerar este método para una aplicación específica, se debe tener en cuenta que las células T deben ser seleccionados negativamente, recién aisladas, y se etiquetan con un marcador fluorescente.

<table><tbody><tr><td>Lector de placas</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Pipeta híbrida</td><td></td></tr><tr><td>multicanal</td><td>Fisher</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 pocillos con fondo óptico</td><td>Corning Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>ADP4-050</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-CD3</td><td>Ancell</td><td>144-020</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sondas moleculares</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DPBS que contienen calcio y magnesio</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>Linfocitos periféricos</td><td>< > ejemplo ratón o humano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Open Gen 5 Software</td><td>BioTek</td><td>Versión 2.01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 y 50 ml</td><td>Fisher</td><td>352099, 352070</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de plástico desechables</td><td>Matraces</td> de cultivo Fisher <td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>T-75</td><td>Fisher</td><td>50-754-1366</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Kit de enriquecimiento de células T</td><td>StemCell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de adherencia estática para el estudio de la integrina activación en linfocitos t

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Se requiere la adhesión de linfocitos T para múltiples funciones de las células T, incluyendo la migración a los sitios de inflamación y formación de sinapsis inmunológica con células presentadoras de antígeno. Células T lograr la adhesión regulada mediante el control de las propiedades adhesivas de las integrinas, una clase de moléculas de adhesión celular que constan de pares de proteínas transmembrana heterodiméricas que interactúan con moléculas diana en las células asociadas o matriz extracelular. El más prominente de la integrina células T es función de los linfocitos antígeno asociado (LFA) -1, compuesto por subunidades αL y β2, cuyo objetivo es la molécula de adhesión intracelular (ICAM) -1. La capacidad de una célula T para controlar la adherencia se deriva de la capacidad de regular los estados de afinidad de las integrinas individuales. Dentro de señalización de salida describe el proceso por el cual las señales dentro de una célula causan los dominios externos de las integrinas para asumir un estado activado. Mucho de nuestro conocimiento de estos complejos fenómenos se basa en mecanicistaLos estudios realizados en simplificación en sistemas de modelos in vitro. El ensayo de adhesión de linfocitos T se describe aquí es una excelente herramienta que permite a las células T para que se adhieran a las moléculas diana, en condiciones estáticas, y luego utiliza un lector de placas de fluorescencia para cuantificar la adhesividad. Este ensayo ha sido útil en la definición de sustancias-estimulador o inhibidor de adhesión que actúan sobre los linfocitos, así como la caracterización de los eventos de señalización implicadas. Aunque se ha descrito aquí para la LFA-1 - ICAM-1 de adhesión mediada; este ensayo puede ser fácilmente adaptado para permitir el estudio de otras interacciones adhesivas (por ejemplo, VLA-4 - fibronectina).

A continuación se muestra un ejemplo de ensayo de adhesión usando células T primarias estimuladas con diversas concentraciones de anticuerpos anti-CD3. Es útil conocer la fluorescencia de las células sin lavar (es decir, la carga total). Células no estimuladas sirven como un control negativo y las células tratadas de PMA son el control positivo para anticuerpos anti-CD3. Las células sembradas en pocillos no recubiertos sirven como un control para la ICAM-1. En un experimento típico, el porcentaje de células tra...

Ensayo de adhesión estática es una herramienta poderosa que se puede utilizar para modelar las interacciones entre los linfocitos T y otros tipos de células. Interacciones se generan mediante la inyección de células T marcadas en pocillos recubiertos con moléculas de adhesión, mientras que un lector de placas se utiliza para cuantificar el número de células adherentes después de lavados de serie.

Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la adhesión celular. Esto se logra primero recubriendo una microplaca de 96 pocillos con moléculas de adhesión en el segundo paso. Los linfocitos T humanos primarios se aíslan de la sangre y se marcan con CFSE.A continuación, los linfocitos T se estimulan con tratamientos para afectar su adhesividad. En el último paso, se añaden las células tratadas a la microplaca y se permite que ocurra la adhesión. Finalmente, se puede medir la cantidad de fluorescencia por pocillo para determinar el porcentaje de células adheridas por condición de tratamiento.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la adición de linfocitos T para modelar el anterio, es que no se requiere el cultivo conjunto de linfocitos T y células erl. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como por ejemplo cómo afectan fármacos específicos a la adhesión de los linfocitos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología del pie de línea, también puede aplicarse a otros tipos de células madre, como los neutrófilos.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos son difíciles de dominar y requieren precisión y habilidad. Para recubrir una microplaca con moléculas de adhesión, comience lavando 24 pocillos de una placa de 96 pocillos con 50 microlitros de solución de lavado; luego, incube cada pocillo, excepto los pocillos control sin recubrir, con 50 microlitros de solución de recubrimiento durante una hora a 37 grados Celsius. A continuación, aspire suavemente la solución de recubrimiento sin permitir que la punta de la pipeta toque el fondo de los pocillos. Después, tras lavar los pocillos con otros 50 microlitros de solución de lavado, incube la microplaca con 50 microlitros de solución de adhesión por pocillo.Nuevamente, a 37 grados Celsius. Después de una hora, aspire suavemente la solución de adhesión y lave los pocillos una vez más con 50 microlitros de solución de lavado. Para aislar los linfocitos T, primero mezcle completamente 50 microlitros de cóctel de enriquecimiento de linfocitos T humanos por cada mililitro de sangre total, y luego incube la sangre tratada durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue seis mililitros de la sangre tratada y un volumen igual de PBS sin calcio ni magnesio enriquecido con 1% de glucosa a un tubo cónico de 50 mililitros a temperatura ambiente y mezcle la solución suavemente.Luego, agregue 15 mililitros de lympho prep a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros y, cuidadosamente, superponga la muestra de sangre diluida sobre el medio de aislamiento de linfocitos. Separe las capas celulares durante 20 minutos a 400 veces G y 20 grados Celsius con el freno desactivado. Luego, utilice una pipeta Pasteur nueva para retirar la capa superior, dejando la capa de linfocitos intacta en la interfase.Transfiera la capa de linfocitos a un tubo cónico nuevo utilizando una pipeta Pasteur nueva. Añada nueve mililitros de PBS a los linfocitos y luego distribuya uniformemente las células a través de la suspensión al aspirarlas y expulsarlas suavemente. Centrifugue las células y luego resuspenda el precipitado en medio de cultivo.Luego, dispense las células en un matraz de cultivo T 75. Añada 20 mililitros de medio de cultivo para estimular las células tras el período de cultivo adecuado. Primero, agregue medio sin suero a 2,4 veces 10 a la seis células T, y luego prive de suero a las células en un incubador a 37 grados Celsius.Después de dos horas, centrifugar las células y resuspender el precipitado. En un mililitro de PBS, etiquetar las células con un marcador fluorescente a oscuras durante ocho minutos a temperatura ambiente, y luego detener la reacción añadiendo 10 mililitros de PBS a 37 grados Celsius. A continuación, tras centrifugar las células, resuspender el precipitado en 1,2 mililitros de solución de adhesión precalentada.Caliente la microplaca recubierta a 37 grados Celsius, luego divida las células en ocho alícuotas de 150 microlitros en tubos de 1,5 mililitros. Estimule un tubo con PMA a 10 nanogramos por mililitro para servir como control positivo. Deje tres tubos sin tratar para servir como control de estimulación, control de carga sin lavar y control para el recubrimiento de ICAM-1, y estimule cuatro tubos con diferentes concentraciones de anticuerpos anti-CD3.Luego, alícuota inmediatamente 50 microlitros de una vez 10 a la quinta células por pocillo de las mezclas celulares estimuladas en los pocillos correspondientes de la placa de microtitulación e incuba la placa a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Para determinar el porcentaje de células adherentes, primero lava cada pocillo con 150 microlitros de solución de adhesión tibia. Agita suavemente la placa durante unos segundos y luego aspira cuidadosamente el medio de cada pocillo sin tocar el fondo de los pocillos con las puntas de pipeta.Repita el lavado tres veces, cambiando el ángulo de la pipeta en cada aspiración. Luego encienda el lector de placas y abra el software de lectura de placas en el menú de tareas. Haga clic en nuevo para configurar un nuevo protocolo.Luego, en el menú de acciones, seleccione la opción de lectura. Haga clic en intensidad fluorescente y luego en aceptar. Ingrese la longitud de onda de excitación como 485 y la longitud de onda de emisión como 528.Luego, en el menú de opciones ópticas, seleccione inferior y haga clic en Aceptar. A continuación, regrese al menú de acciones y establezca la temperatura en 37 grados Celsius y haga clic en Aceptar. Finalmente, cargue la microplaca y haga clic en ejecutar.Después de exportar los resultados a una hoja de cálculo, utilice la fórmula para calcular el porcentaje de células adheridas en estas imágenes. Se muestra un ejemplo de un ensayo de adhesión utilizando linfocitos T primarios, estimulados con diversas concentraciones de anticuerpos anti CD tres. Las células no estimuladas sirven como control negativo.Las células tratadas con PMA sirven como control positivo. Para los anticuerpos anti-CD3, la tabla muestra las intensidades de fluorescencia relativas de CFSE. Células T primarias marcadas estimuladas con diferentes dosis de anticuerpos anti-CD3 solubles y sembradas en pozos recubiertos con IAM1. Para cada condición, se puede calcular la intensidad promedio de los pozos en triplicado y convertirse en el porcentaje relativo del total de células cargadas.En un experimento típico, el porcentaje de células tratadas con PMA adherentes oscila entre el 40 y el 50 %, mientras que el porcentaje de células no estimuladas oscila entre el cinco y el 10 %. Tenga en cuenta que el porcentaje de células adherentes aumenta conforme aumenta la concentración de anticuerpos anti-CD3 utilizados para la estimulación. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de tres horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar medir la fluorescencia de un pocillo sin lavar para determinar la entrada de fluorescencia.Un valor crítico en el análisis de datos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la adhesión celular estática. No olvide que trabajar con muestras de sangre humana puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar una bata de laboratorio y guantes al realizar este procedimiento.

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