Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la adhesión celular. Esto se logra recubriendo primero una microplaca de 96 pocillos con moléculas de adhesión en el segundo paso. Las células T humanas primarias se aíslan de la sangre y se marcan con CFSE.

A continuación, se estimulan las células T con tratamientos para afectar a su adhesividad. En el paso final, las células tratadas se añaden a la microplaca y se permite la adhesión. En última instancia, se puede medir la cantidad de fluorescencia por pocillo para determinar el porcentaje de células adherentes por condición de tratamiento.

La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente, como la adición de células T al modelo y al anterio, es que no se requiere el cocultivo de células T y células erl. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como por ejemplo, ¿cómo afectan los fármacos específicos a la adhesión de los linfocitos? Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología del pie lineal, también se puede aplicar a otras células maie como los neutrófilos.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos son difíciles de dominar y requieren precisión y habilidad. Para codificar una microplaca con las moléculas de adhesión, comience lavando 24 pocillos de una placa de 96 pocillos con 50 microlitros de solución de lavado, luego incube cada pocillo, excepto los pocillos de control sin recubrimiento, con 50 microlitros de solución de recubrimiento durante una hora a 37 grados Celsius. A continuación, aspire suavemente la solución de recubrimiento sin permitir que la punta de la pipeta toque el fondo de los pocillos. Luego, después de lavar los pocillos con 50 microlitros más de solución de lavado, incubar la microplaca con 50 microlitros de solución de adhesión por pocillo.

De nuevo, a 37 grados centígrados. Después de una hora, aspire suavemente la solución de adherencia y lave los pocillos una vez más con 50 microlitros de solución de lavado Para aislar las células T, primero mezcle bien 50 microlitros de cóctel de enriquecimiento de células T humanas por cada mililitro de sangre entera y luego incube la sangre tratada durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada seis mililitros de la sangre tratada y un volumen igual de PBS libre de calcio y magnesio enriquecido con glucosa al 1%D en un tubo cónico de 50 mililitros a temperatura ambiente y mezcle la solución suavemente.

A continuación, añada 15 mililitros de preparación linfolinfológica a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros y coloque cuidadosamente la muestra de sangre diluida en el medio de aislamiento de linfocitos. Separe las capas de celdas durante 20 minutos a 400 veces G y 20 grados Celsius con la ruptura. A continuación, utilice una pipeta de pasta nueva para eliminar la capa superior, dejando la capa de linfocitos intacta en la interfaz.

Transfiera la capa de linfocitos a un tubo cónico nuevo con una pipeta pester nueva. Agregue nueve mililitros de PBS a los linfocitos y luego distribuya uniformemente las células por toda la suspensión atrayéndolas suavemente hacia adentro y hacia afuera. Gire las celdas y luego vuelva a suspender el pellet en el medio.

A continuación, dispense las células en un matraz de cultivo T 75. 20 mililitros de medio de cultivo para estimular las células después del período de cultivo adecuado. Primero, agregue medios libres de suero a 2,4 veces 10 a las seis células T, y luego prive de suero a las células en una incubadora a 37 grados Celsius.

Después de dos horas, gire las celdas y vuelva a suspender el pellet. En un mililitro de PBS, etiquete las células con un marcador fluorescente en la oscuridad durante ocho minutos a temperatura ambiente, y luego detenga la reacción agregando 10 mililitros de PBS de 37 grados Celsius. Luego, después de girar las celdas, vuelva a suspender el pellet en 1,2 mililitros de solución de adhesión precalentada.

Caliente la microplaca recubierta a 37 grados centígrados, luego divida las celdas en ocho alícuotas de 150 microlitros en 1,5. Los tubos de mililitros estimulan un tubo con PMA a 10 nanogramos por mililitro para que sirva como control positivo. Deje tres tubos sin tratar para dar servicio al control de estimulación, el control de carga sin lavar y el control de ICAM un recubrimiento y estimule cuatro tubos con diferentes concentraciones de anticuerpos anti CD tres.

A continuación, alícuota inmediata 50 microlitros de uno por 10 a la quinta célula por pocillo de las mezclas de células estimuladas en los pocillos apropiados de la microplaca e incubar la placa a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Para determinar primero el porcentaje de células adheridas, lave cada pocillo con 150 microlitros de solución de adhesión tibia. Agite la placa suavemente durante unos segundos y luego aspire con cuidado el medio de cada pocillo sin tocar el fondo de los pocillos con las puntas de pipeta.

Repita el lavado tres veces, cambiando el ángulo de la pipeta con cada aspiración. A continuación, encienda el lector de placas y abra el software de lectura de placas en el menú de tareas. Haga clic en nuevo para configurar un nuevo protocolo.

A continuación, en el menú de acciones, seleccione la opción de lectura. Haga clic en intensidad fluorescente y haga clic en Aceptar. Introduzca la longitud de onda de excitación como 485 y la longitud de onda de emisión como 528.

A continuación, en el menú de opciones ópticas, seleccione la parte inferior y haga clic en Aceptar. Luego regrese al menú de acciones y configure la temperatura a 37 grados centígrados y haga clic en Aceptar. Finalmente cargue la microplaca y haga clic en ejecutar.

Después de exportar los resultados a una hoja de cálculo, utilice la fórmula para calcular el porcentaje de celdas de adherencia en estas imágenes. Se muestra un ejemplo de un ensayo de adhesión utilizando células T primarias, estimuladas con varias concentraciones de anticuerpos anti CD 3. Las células no estimuladas sirven como control negativo.

Las células tratadas con PMA sirven como control positivo Para los anticuerpos anti CD tres, la tabla muestra las intensidades relativas de fluorescencia de CFSE. Células T primarias marcadas estimuladas con diferentes dosis de anticuerpos solubles anti CD tres y sembradas en pocillos recubiertos de IAM uno. Para cada condición, se puede calcular la intensidad promedio de los pozos triplicados y convertirla en el porcentaje relativo del total de celdas cargadas.

En un experimento típico, el porcentaje de células adherentes tratadas con PMA está entre el 40 y el 50%, mientras que el porcentaje de células no estimuladas está entre el 5 y el 10%. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar medir la fluorescencia de un pocillo sin lavar para determinar la entrada de fluorescencia.

Un valor crítico en el análisis de datos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la adhesión celular estática. No olvide que trabajar con muestras de sangre humana puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar una bata de laboratorio y guantes mientras se realiza este procedimiento.