Name: Un método Aclaración Nueva visualizar biliar Degeneración Durante Hígado metamorfosis en la lamprea de mar ( Petromyzon marinus) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende a visualizar la degeneración biliar en lamprea marina mediante el método CLARITY modificado. Esta técnica permite analizar cambios estructurales y celulares durante la metamorfosis de Petromyzon marinus.

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Los autores agradecen la contribución de la Estación Biológica de Hammond Bay, Great Lakes Science Center, Servicio Geológico de EE.UU.. También agradecemos a la Dra. Melinda Frame en el Centro de Microscopía Avanzada de la Universidad del Estado de Michigan por su apoyo técnico en la microscopía confocal de barrido láser. Este estudio es apoyado por becas de la Comisión de Pesca de Lagos a YWCD y WML.

1. Preparación de la Solución <ol><li> Hacer 1 L de 10x 0,1 M solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sodio (monobásico), 115 g de fosfato de sodio (dibásico), y 87,66 g de NaCl. Disolver en aproximadamente 800 ml de H 2 O destilada, ajustar el pH, y llevar el volumen hasta 1 litro con H2O destilada <ol><li> Hacer 1 L de solución salina tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4): Tomar 100 ml de 10x PBS y añadir 900 ml de H2O destilada </li><li> Hacer 1 L de 0,1 M de tampón fosfato salino (pH 7,4) con 0,1% de Triton X-100: Tomar 100 ml de 10x de PBS, añadir 1 ml de Triton X-100, y llevar el volumen hasta 1 L con H2O destilada </li></ol></li><li> Hacer 1 L de 0,1 M de 10x tampón de fosfato (PB, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sodio (monobásico) y 115 g de fosfato de sodio (dibásico). Disolver en aproximadamente 800 ml de H 2 O destilada, ajustar el pH, y llevar el volumen hasta 1 litro con H2O destilada <ol><li> Hacer 1 L 0,1 M tampón fosfato (pH 7,4): Tome 100 ml 10x PB,y añadir 900 ml de agua destilada H 2 O. </li><li> Hacer 1 L 0,1 M tampón fosfato (pH 7,4) con 0,1% Triton X-100: Tomar 100 ml 10x PB, añadir 1 ml de Triton X-100, y llevar el volumen hasta 1 litro con H2O destilada </li></ol></li><li> Hacer solución de 400 ml de monómero de hidrogel (4% de acrilamida, 0,25% de bis-acrilamida, 4% de paraformaldehído, persulfato de amonio 0,0075%, 0,0005% de saponina en PBS 0,1 M): Pesar 0,3 g de persulfato de amonio y 0,2 g de saponina. Añadir 210 ml de H2O destilada, 40 ml de 40% de acrilamida, 10 ml de 2% de bis-acrilamida, 40 ml de 10x de PBS (pH 7,4), 100 ml de 16% de paraformaldehído, y mezclar bien. </li><li> Haga solución clarificadora 4 L (4% SDS en ácido bórico 0,2 M): Pesar 49,464 g de ácido bórico y 160 g de SDS. Disolver en aproximadamente 3,5 l de H 2 O destilada, ajustar el pH a 8,5 con NaOH, y llevar el volumen hasta 4 L. </li><li> Hacer 1 L de solución de glicerol al 80%: Medir 800 ml de glicerol, añadir 200 ml de H 2 O destilada y mezclar bien. </li></ol> 2. Preparación de Tejido <ol><li> Preparar la solución de monómero de hidrogel y 10 ml de alícuota a cada tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Diseccionar todo el tejido y fijar en el hidrogel durante 2 días a 4 ° C. Asegúrese de que la solución de hidrogel es al menos 10 veces el volumen del tejido. </li><li> Llevar el tejido fijado de hidrogel (en el tubo de centrífuga de 15 ml) a una campana de humos. </li><li> Polimerizar el tejido fijado hidrogel añadiendo 5 l de TEMED, mezclar bien y dejar reposar en la campana de extracción a temperatura ambiente durante 2-3 horas. </li><li> Retire el exceso de gel a fondo. Nota: gel extra obstaculizará el proceso de compensación y la penetración de anticuerpos durante la tinción. </li><li> Incubar el tejido fijado en 10 ml de compensación solución en un agitador incubador a 70 rpm y 50 ° C durante varios días hasta que el tejido se vuelve transparente. Cambie solución de limpieza de al menos una vez por día y eliminar el exceso de gel a partir del tejido cuando se cambia la solución de aclarado. </li><li> Enjuague el tejido en 10 ml de PB 0,1 M con 0,1% de Triton X-100 al 70 rpm y de 37 ° C durante la noche. Repita este paso 3 veces y eliminar el exceso de gel a partir del tejido cuando se cambia la solución tampón. </li><li> Incubar el tejido aclarado en la solución de anticuerpo primario en PB con 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm y 37 ° C durante 2 días. Nota: Asegúrese de suficiente solución de anticuerpo primario para sumergir todo el tejido. </li><li> Enjuague el tejido en 10 ml de PB con 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm y 37 ° C durante la noche. Repita este paso 3 veces y eliminar el exceso de gel a partir del tejido cuando se cambia la solución tampón. </li><li> Realice los pasos siguientes en un cuarto oscuro o con poca luz. Cubra las muestras con papel de aluminio para evitar la decoloración foto. </li><li> Incubar el tejido aclarado con la solución de anticuerpo secundario fluorescente en PB con 0,1% de Triton X-100 y el suero de bloqueo a 70 rpm y 37 ° C durante 1 día. </li><li> Enjuague el tejido en 10 ml de PB con 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm y 37 ° C durante la noche. Repita este paso 3 veces y retire el exceso de gel fesde el tejido cuando el cambio de la solución tampón. </li><li> Enjuague el tejido en 10 ml de PBS a 70 rpm y 37 ° C durante la noche. Repita este paso 3 veces y eliminar el exceso de gel a partir del tejido cuando se cambia la solución tampón. </li><li> Incubar el tejido se aclara en 80% de glicerol a 70 rpm y 37 ° C durante la noche. </li><li> Guarde el tejido teñido fluorescente a 4 ° C antes de la microscopía confocal. </li></ol>

<ol><li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+in+Michigan%5BTitle%5D)+AND+%22US+Fish+and+Wildlife+Service+Special+Science+Report+on+Fishery+Service%22%5BJournal%5D)">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li>
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<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+before+and+after+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li>
<li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li>
<li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey%2C+Lethenteron+reissneri%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo se modificó a partir de un nuevo método llamado &quot;claridad&quot; 12, que se reticula tejido intacto con poliacrilamida para formar un hidrogel nanoporoso, y luego despoja de la membrana plasmática del tejido para conseguir la transparencia óptica y la permeabilidad macromolecular. &quot;CLARIDAD&quot; permite obtener imágenes de los tejidos intactos de proyección de largo alcance y el cableado del circuito local en el sistema nervioso. Este nuevo método se puede utilizar para visualizar tod...

Lamprea de mar desarrollarse a través de tres etapas de la vida distinta 1,2. Lamprea marina larvas (L) pasan la mayor parte de tiempo en madrigueras como filtradores bentónicos. Después de pasar por siete etapas metamórficas de cambios drásticos en la morfología externa y la reorganización de los órganos internos 3, a los juveniles (JV) entran en una etapa parasitaria durante el cual se alimentan de sangre y fluidos de los tejidos del pez hospedador, el aumento de la masa corporal de más de 100 veces . 1.0 del a 1,5 años que se alimentan de los peces de acogida en el mar o grandes lagos, los adultos dejan de alimentación durante el comienzo de la primavera y migran hacia los ríos para desovar y luego mueren 1,2. Durante la metamorfosis, el hígado lamprea de mar pierde la vesícula biliar y el árbol biliar, un fenotipo mutante evolutivo que imita la enfermedad infante humano atresia biliar. Atresia biliar infantil es una enfermedad hepática pediátrica rara con complicaciones médicas graves 4,5,6,7, 8.9.10, sin embargo, la patogenia y etiología de la atresia biliar son en gran parte desconocidos 4. Los pacientes con atresia biliar mueren dentro de los dos años después del nacimiento a menos que la intervención quirúrgica (procedimiento de Kasai) se lleva a cabo 5. Posteriormente, estos pacientes requieren un amplio manejo clínico y, a menudo el trasplante hepático 6. Se han propuesto muchas teorías sobre la etiopatogenia atresia biliar, como la infección viral, malformación congénita, enfermedad autoinmune, y el insulto tóxico. Sin embargo, la contribución de cada uno para el desarrollo de la atresia biliar no son concluyentes 7,8,9,10. A diferencia de los niños que sufren atresia biliar patológica, la lamprea de mar se someten desarrollo programado atresia biliar sin una amplia necroinflamación, fibrosis o cirrosis 10. Los animales pueden sufrir colestasis transitoria durante este proceso 10, pero adaptarse a este trastorno del desarrolloa través de la síntesis de novo y de la secreción de sales biliares en el intestino después de la atresia biliar desarrollo, además de los mecanismos conocidos, tales como la reducción de la síntesis de sales biliares en el hígado 11. Este proceso de desarrollo de la lamprea de mar proporciona la única conocida oportunidad de examinar el progreso de la atresia biliar. Un nuevo método desarrollado la llamada &quot;CLARIDAD&quot; permite obtener imágenes de alta resolución en los sistemas nervioso de mamíferos complejos mediante la transformación de tejido intacto en un hidrogel nanoporoso ópticamente transparente 12. El uso de la lamprea de mar hígado y un protocolo CLARIDAD modificada, las imágenes intactas de tejido de la degeneración biliar puede ser documentado a lo largo de la metamorfosis de hígado.

<table><tbody><tr><td>40% acrilamida&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% bis-acrilamida&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>persulfato de amonio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B7901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>saponina &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sodio &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L337-500G</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de sodio (monobásico)</td><td>Sigma</td><td>04269-1KG</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de sodio (dibásico)</td><td>Sigma</td><td>S5136-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>glicerol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehído&nbsp;</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de NaOH&nbsp;</td><td>EMD</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml Herramientas</td> de disección <td>de cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un método aclaración nueva visualizar biliar degeneración durante hígado metamorfosis en la lamprea de mar ( petromyzon marinus)

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

La atresia biliar es una rara enfermedad de la infancia, con un estimado de 1 en 15.000 de frecuencia en el sureste de los Estados Unidos, pero más común en los países del este de Asia, con una frecuencia reportada de 1 en 5000 en Taiwán. Aunque se sabe mucho sobre la gestión de la atresia biliar, su patogenia sigue siendo difícil de alcanzar. La lamprea marina (Petromyzon marinus) ofrece una oportunidad única para examinar el mecanismo y la progresión de la degeneración biliar. Lamprea de mar se desarrollan a través de tres etapas de la vida distintas: larva, parasitarias y adultos. Durante la transición de larvas a juveniles parasitaria, la lamprea de mar sufren metamorfosis con dramática reorganización y remodelación en la morfología externa y los órganos internos. En el hígado, todo el sistema se pierde biliar, incluyendo la vesícula biliar y el árbol biliar. Un nuevo método desarrollado la llamada &quot;CLARIDAD&quot; se modificó para aclarar todo el hígado y el cruce con el intestino en metamórfica lamprea de mar. Laproceso de degeneración biliar fue visualizado y discernido durante la lamprea de mar metamorfosis mediante el uso de microscopía confocal de barrido láser. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar la atresia biliar en un modelo animal único.

Varios acontecimientos importantes del desarrollo se producen en el sistema hepatobiliar durante la lamprea de mar metamorfosis. El conducto biliar y la vesícula biliar sufren apoptosis y degenerado (Figura 1). Combinando el método de clarificación modificado y tinción con hígado marcador de células citoqueratina 19 (CK19, presente en ambos cholangiocytes y hepatocitos antes y después de la metamorfosis 13) y Bcl2 marcador anti-apoptótica usando microscopía confocal, todo el sistema biliar fu...

Lamprea de mar pierde la vesícula biliar y los conductos biliares durante la metamorfosis, un proceso similar a la atresia biliar humano. Un nuevo método de fijación y aclaración (CLARITY) se modificó para visualizar todo el árbol biliar mediante microscopía confocal de barrido láser. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar la degeneración biliar.

Un método Aclaración Nueva visualizar biliar Degeneración Durante Hígado metamorfosis en la lamprea de mar ( Petromyzon marinus)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

El objetivo general de este procedimiento es aclarar todo el hígado y la unión con el intestino para realizar análisis globales, estructurales y celulares de la degeneración biliar en lampreas metamórficas. Esto se logra primero fijando los tejidos en la solución monómera de hidrogel.A continuación, el hidrogel se polimeriza con los tejidos fijados. Luego, se elimina la membrana plasmática del tejido fijado y el tejido se vuelve transparente. Finalmente, se realiza la tinción inmunofluorescente y, en última instancia, se utiliza microscopía láser de piel y microscopía confocal para mostrar los cambios estructurales y celulares globales durante la degeneración biliar en la lamprea metamórfica c.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biomédico, como los conectomas en el sistema nervioso central y, en nuestro caso, la degeneración biliar durante la metamorfosis del punto sérico. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento o diagnóstico de la enfermedad biliar humana o atresia, ya que esta enfermedad congénita rara en lactantes comparte características similares con la degeneración del ary durante la metamorfosis del punto sérico. Tuvim

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Biología

Las lampreas recuperan locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. Sin embargo, algunas neuronas espinales-proyectar regeneradores son buenos y otros no lo son. Este documento ilustra las técnicas de larvas de lamprea de mar vivienda (y adultos recientemente transformadas), la producción de transección completa de la médula espinal y la preparación de los cerebros y las médulas espinales wholemount para la hibridación in situ.

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Para ayudar a evaluar los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración hepática biliar del pez cebra, establecimos un modelo de lesión hepática en el que los hepatocitos que expresan nitroreductasa se ablacionan genéticamente tras el tratamiento con metronidazol.  En este protocolo, describimos cómo manipular, monitorizar y analizar hábilmente la ablación de hepatocitos y la regeneración hepática impulsada por la biliar.

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

El esqueleto branquial, incluyendo branquiespinas, dientes faríngeos y huesos branquiales, sirve como el sitio principal de procesamiento de alimentos en la mayoría de los peces. Aquí describimos un protocolo para diseccionar y montar este esqueleto interno en espinosos de tres espinas. Este método también es aplicable a una variedad de otras especies de peces.

La disección y-montaje plana del esqueleto branquial de tres espinas Stickleback

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y caracterizar la estructura, potencia olfativa y respuesta comportamiento de compuestos de feromonas putativos de lampreas de mar.

La identificación de las feromonas de la lamprea de mar usando fraccionamiento guiado por bioensayo

Presentamos un método bastante simple y sensible para la cuantificación precisa de la densidad de las vías biliares en el hígado del ratón. Este método puede ayudar a determinar los efectos de los modificadores genéticos y ambientales y la eficacia de las terapias potenciales en modelos de ratón de enfermedades biliares.

Determinación de la densidad del conducto biliar en el hígado del ratón

Aquí demostramos un método para cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval, proporcionando una manera de evaluar los efectos de las manipulaciones genéticas y farmacológicas en el crecimiento y desarrollo del hígado.

Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

Este protocolo describe el procedimiento para eliminar el lóbulo ventral del hígado en el pez cebra adulto para permitir el estudio de la regeneración hepática.

Hepatectomía parcial en pez cebra adulto

Aquí, presentamos cómo generar un modelo de pez cebra de carcinoma hepatocelular (HCC) asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) para estudiar el impacto del excedente de colesterol en el microambiente hepático y el paisaje de las células inmunes.

Análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra

Este protocolo describe la recolección y visualización de las escamas elasmoides del pez cebra durante la regeneración in vivo . Además, se presenta el cultivo ex vivo de estas escamas hasta 7 días después de la cosecha.

Regeneración de escamas de pez cebra en cultivo de escamas en su totalidad y ex vivo

Aprende a visualizar la degeneración biliar en lamprea marina mediante el método CLARITY modificado. Esta técnica permite analizar cambios estructurales y celulares durante la metamorfosis de Petromyzon marinus.

Un método Aclaración Nueva visualizar biliar Degeneración Durante Hígado metamorfosis en la lamprea de mar ( Petromyzon marinus) (Video) | JoVE Journal

Un método Aclaración Nueva visualizar biliar Degeneración Durante Hígado metamorfosis en la lamprea de mar ( Petromyzon marinus)

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