Un método Aclaración Nueva visualizar biliar Degeneración Durante Hígado metamorfosis en la lamprea de mar ( Petromyzon marinus)

El objetivo general de este procedimiento es aclarar todo el hígado y la unión con el intestino para realizar análisis globales, estructurales y celulares de la degeneración biliar en lampreas metamórficas. Esto se logra primero fijando los tejidos en la solución monómera de hidrogel.

A continuación, el hidrogel se polimeriza con los tejidos fijados. Luego, se elimina la membrana plasmática del tejido fijado y el tejido se vuelve transparente. Finalmente, se realiza la tinción inmunofluorescente y, en última instancia, se utiliza microscopía láser de piel y microscopía confocal para mostrar los cambios estructurales y celulares globales durante la degeneración biliar en la lamprea metamórfica c.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biomédico, como los conectomas en el sistema nervioso central y, en nuestro caso, la degeneración biliar durante la metamorfosis del punto sérico. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento o diagnóstico de la enfermedad biliar humana o atresia, ya que esta enfermedad congénita rara en lactantes comparte características similares con la degeneración del ary durante la metamorfosis del punto sérico. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando encontramos un artículo informativo en Nature y presentamos el video en línea durante nuestra reunión de laboratorio, que demostrará el procedimiento será Ann Scott, una estudiante de posgrado de nuestro laboratorio, después de preparar la solución salina tamponada con fosfato y el tampón fosfato o pb, según el protocolo descrito en el texto.

En una campana extractora, prepare 400 mililitros de hidrogel combinando agua destilada, acrilamida al 40 %, bisacrilamida al 2 %, PBS 10X, paraformaldehído al 16 %, saponina y persulfato de amonio. Prepare un litro de solución de limpieza compuesta por SDS al 4 % y ácido bórico 0,2 molar, y prepare 500 mililitros de glicerol al 80 % para tratar el tejido en la campana extractora. Aliquote 10 mililitros de la solución monómera de hidrogel en tubos cónicos de 15 mililitros.

Disecar la muestra de tejido y colocar el tejido en cada tubo con fijador de hidrogel a cuatro grados Celsius durante dos días. Tras la incubación bajo una campana extractora, polimerizar el tejido fijado añadiendo cinco microlitros de temid. A continuación, mezclar bien y dejar que las muestras se incuben a temperatura ambiente durante dos a tres horas.

Después de la incubación, retire completamente el exceso de gel para aclarar las muestras de tejido. Coloque cada una en 15 mililitros de solución de aclarado e incube a 50 grados Celsius y 70 RPM durante varios días hasta que se vuelvan transparentes. Cambie la solución de aclarado al menos una vez al día y retire cualquier exceso de gel.

Transfiera las muestras en 15 mililitros de PB 0,1 molar con 0,1 % de Triton X-100 a 37 grados Celsius y 70 RPM durante la noche. Repita la incubación dos veces más con tampón fresco. Ahora que el tejido está despejado y libre de cualquier gel en exceso, sumerja las muestras en anticuerpo primario en PB con Triton X-100 e incube a 37 grados Celsius y 70 RPM durante dos días. Después de la incubación, use 15 mililitros de PB con 0,1 % de Triton X-100 para lavar las muestras de tejido a 37 grados Celsius y 70 RPM durante la noche.

Repita el lavado tres veces; tras eliminar el último tampón de lavado, agregue la solución de anticuerpo secundario fluorescente en PB con 0,1 % de Triton X-100 y suero bloqueante, e incube en la oscuridad a 37 grados Celsius y 70 rpm durante un día. Después de lavar las muestras tres veces en 10 mililitros de PB con Triton X-100 a 37 grados Celsius y 70 rpm durante la noche, realice tres lavados nocturnos en PBS. Finalmente, incube el tejido clarificado en glicerol al 80 % cubierto con papel de aluminio durante la noche.

Posteriormente, se realiza la imagen mediante microscopía confocal en la oscuridad o con luz tenue, aunque en este video las luces estén encendidas con fines de visualización. Durante la metamorfosis de la lamprea, ocurren varios eventos de desarrollo importantes en el sistema biliar HEPA; por ejemplo, como se muestra aquí, el conducto biliar y la vesícula biliar experimentan apoptosis y degeneran. Tras emplear el método de aclarado modificado y teñir con el marcador de células hepáticas citokeratina 19 y el marcador antiapoptótico BCL2, se utilizó microscopía confocal de barrido láser para realizar secciones ópticas a través del hígado intacto.

La tinción reveló que el proceso degenerativo ocurre en las etapas metamórficas dos a cuatro. Los paneles superiores corresponden al extremo anterior y los paneles inferiores al extremo posterior. Aquí se muestra el árbol biliar y aquí hay células apoptóticas oscuras con aspecto dendrítico y canalículos circundantes y conductos hepáticos en el hígado.

Esta figura representa imágenes tridimensionales reconstruidas a partir de series Z confocales de tres hígados entre las etapas metamórficas dos y tres, marcadas con anticuerpos contra citokeratina 19 y BCL2, donde el árbol biliar y las células apoptóticas oscuras con aspecto dendrítico y los canalículos y conductos circundantes están indicados por flechas blancas y negras, respectivamente. Aquí se muestra una sección óptica confocal de los conductos biliares de un espécimen entre las etapas metamórficas dos y tres, con gotas de bilis en la luz. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aclarar todo el tejido para análisis de imágenes posteriores.

No olvide que trabajar con soluciones de paraform, aldehído y poliacrilamida puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar guantes y utilizar la campana extractora al realizar este procedimiento.