Un método Aclaración Nueva visualizar biliar Degeneración Durante Hígado metamorfosis en la lamprea de mar ( Petromyzon marinus)

El objetivo general de este procedimiento es aclarar todo el hígado y la unión con el intestino para análisis globales, estructurales y celulares de la degeneración biliar. En lamprea C metamórfica. Esto se logra fijando primero los tejidos en la solución de monómero de hidrogel.

A continuación, el hidrogel se polimeriza con los tejidos fijos. Luego, se elimina la membrana plasmática del tejido fijado y el tejido se vuelve transparente. Finalmente, se realiza la tinción inmunofluorescente y se utiliza la microscopía confocal para mostrar los cambios estructurales y celulares globales durante la degeneración biliar en lámparas metamórficas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biomédico, como los conectomas en el sistema nervioso central y, en nuestro caso, la degeneración biliar durante la metamorfosis de puntos séricos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de la atresia biliar humana, ya que esta rara enfermedad congénita del lactante comparte características similares con la degeneración aria durante la metamorfosis del punto sérico. Primero tuvimos la idea de este método cuando encontramos un artículo de noticias en Nature y presentamos el video en línea durante nuestra reunión de laboratorio que demuestra el procedimiento será Ann Scott, una estudiante graduada de nuestro laboratorio Después de hacer solución salina tamponada con fosfato y tampón de fosfato o pb, de acuerdo con el protocolo de texto.

En una campana extractora, prepare 400 mililitros de hidrogel combinando agua destilada, 40 % de acrilamida 2 % bis, acrilamida 10 XPBS, 16 % de paraforma, aldehído, saponina y amonio por sulfato. Prepare un litro de solución de limpieza compuesta por 4% de SDS y ácido bórico 0,2 molar, y haga 500 mililitros de 80% de glicerol para preparar el tejido en la campana extractora. Eloqua 10 mililitros de solución de monómero de hidrogel en tubos de centrífuga de 15 mililitros.

Diseccione la muestra de tejido y coloque el tejido en cada tubo de hidrogel a cuatro grados centígrados durante dos días. Después de la incubación bajo una campana extractora, polimerice el tejido fijado agregando cinco microlitros de temid. Luego mezcle bien y deje que las muestras se incuben a temperatura ambiente durante dos o tres horas.

Después de la incubación, retire completamente el exceso de gel para eliminar las muestras de tejido. Coloque cada uno en 15 mililitros de solución de limpieza e incube a 50 grados centígrados y 70 RPM durante varios días hasta que se vuelvan transparentes. Cambie la solución limpiadora al menos una vez al día y elimine el exceso de gel.

Transfiera las muestras en 15 mililitros de PB 0.1 molar con 0.1%Triton X 100 a 37 grados Celsius y 70 RPM durante la noche. Repita la incubación dos veces más con tampón fresco. Ahora que el tejido está limpio y libre de cualquier exceso de gel, sumerja las muestras en el anticuerpo primario en PB tritton X 100 e incube a 37 grados Celsius y 70 RPM durante dos días después de la incubación, use 15 mililitros de PB con 0.1% tritton X 100 para lavar las muestras de tejido a 37 grados Celsius y 70 RPM durante la noche.

Repita el lavado tres veces después de quitar el tampón de lavado final, agregue la solución de anticuerpos secundarios fluorescentes en PB con 0.1% Trix 100 y suero bloqueante e incube en la oscuridad a 37 grados Celsius y 70 RPM durante un día. Después de lavar las muestras tres veces en 10 mililitros de PB tritton X 100 a 37 grados Celsius y 70 RPM durante la noche, realice tres lavados nocturnos en PBS. Finalmente, incubar el tejido clarificado en glicerol al 80% cubierto con papel de aluminio durante la noche.

Las imágenes de microscopía confocal se realizan en luz oscura o tenue, aunque las luces están encendidas en este video con fines de visualización. Varios eventos importantes del desarrollo ocurren en el sistema biliar HEPA durante la metamorfosis de c lampre, por ejemplo, como se muestra aquí, el conducto biliar y la vesícula biliar sufren apoptosis y degeneran. Después de utilizar el método de clarificación modificado y tinción con marcador de células hepáticas citoqueratina 19 marcador anti antiapoptótico, se utilizó microscopía confocal de barrido láser BCL dos para realizar el corte óptico a través del hígado intacto.

La tinción reveló que el proceso degenerativo ocurre en las etapas metamórficas dos a cuatro. Los paneles superiores son del extremo anterior y los paneles inferiores son del extremo posterior. Aquí se muestra el árbol biliar y aquí hay células apoptóticas de aspecto dendrítico oscuro y canalículos circundantes y herramientas de conductos en el hígado.

Esta figura representa imágenes tridimensionales reconstruidas: la serie Z confocal de tres hígados entre las etapas metamórficas dos y tres marcadas con anticuerpos contra la citoqueratina 19 y BCL dos, el árbol biliar y las células apoptóticas de aspecto dendrítico oscuro y los canalículos circundantes y las herramientas de conducto están marcados con flechas blancas y negras respectivamente. Aquí se muestra una sección óptica confocal de los conductos biliares de un espécimen entre las etapas metamórficas dos y tres con gotas de bilis en el lumen. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aclarar todo el tejido para realizar análisis de imágenes adicionales.

No olvide que trabajar con soluciones de paraformes, aldehídos y poliacrilamida puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y el uso de la campana extractora mientras se realiza este procedimiento.