Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P _F) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

El objetivo general del siguiente experimento es aprender sobre la función de las acuaporinas mediante la determinación del coeficiente de permeabilidad osmótica al agua, o PF, de los protoplastos de las plantas. Corta un trozo de una hoja sin epidermis axial y ponlo en una solución isotónica. Transfiera las piezas a una solución enzimática e incube durante 20 minutos a 28 grados centígrados, luego a una solución isotónica fresca.

A continuación, recoja los protoplastos que contienen la solución con una punta recortada. Como segundo paso, prepare una cámara experimental. Fije un cubreobjetos en la parte inferior del portaobjetos con grasa de silicona.

A continuación, cubra el fondo de la cámara con un pegamento portador de carga positiva y llene la cámara con una solución isotónica. A continuación, se añaden protoplastos aislados a la cámara y la cámara se coloca delicadamente en la platina del microscopio. Posteriormente, los protoplastos se exponen a una solución hipotónica mientras se graban videos para capturar su curso de tiempo de hinchazón.

A continuación, se analiza numéricamente la evolución del tiempo de hinchamiento mediante un software que incluye procedimientos de ajuste cur con el fin de determinar la PF de cada uno de los protoplastos en base a los resultados del análisis numérico que se obtienen que muestran diferencias en la PF inducida, por ejemplo, por la expresión de diferentes genes de acuaporina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología de la membrana celular, como la regulación de la función de la acuaporina. Aunque este método puede proporcionar información sobre el agua mática, la permeabilidad de las plantas acuáticas que son nativas o modificadas genéticamente.

También se puede aplicar a otros sistemas como el ide expuesto al origen de interés. Antes de comenzar este procedimiento, prepare las soluciones isotónicas e hipertónicas requeridas y verifique su osmolaridad. Usando un operador OSM, la osmolaridad de cada solución debe estar dentro del 3% del valor objetivo.

Llene una placa de Petri de 10 centímetros con unas seis gotas de solución isotónica. Pelar el sello ABBA o bajar la epidermis de una hoja de conejo opsys y cortar la hoja pelada en cuadrados de unos cuatro por cuatro milímetros. Coloque los trozos pequeños sobre las gotas de solución isotónica con el lado axial expuesto hacia abajo y tocando la solución.

A continuación, disuelva 5,7 miligramos de la mezcla de enzimas en 165 microlitros de solución isotónica en un tubo de 1,5 mililitros y mezcle suavemente pipeteando durante un minuto más o menos hasta que se disuelva. Coloque varias gotas similares de la solución enzimática en la misma placa de Petri. Transfiera los trozos de hoja a la solución enzimática. Gotas.

Cierre el plato y selle la tapa con una ronda de perfil. Haga flotar el plato en un baño de agua a 28 grados centígrados durante 20 minutos. Después de 20 minutos, agregue varias gotas más de la solución isotónica al plato con pinzas.

Levante cada trozo de hoja por su borde para transferirlo a una nueva gota de solución isotónica y luego secuencialmente a una segunda gota. Agite el trozo de hoja en la segunda gota para liberar los protoplastos con una punta de pipeta recortada de 100 microlitros. Recoja las gotas con los protoplastos en un tubo de 1,5 mililitros.

Prepare el sistema de profusión llenando una columna con la solución isotónica y otra columna con la solución hipotónica. Abra la válvula para permitir que fluya una solución hipotónica para llenar el tubo hasta el colector de entrada. Después de asegurarse de que no haya burbujas de aire atrapadas, cierre la válvula.

Repita para la solución isotónica. Selle un cubreobjetos con grasa de silicona para hacer un fondo para la cámara dentro del portaobjetos de plexiglás para hacer que el fondo de la cámara sea pegajoso para los protoplastos, cúbralo con sulfato de protamina que contiene carga positiva o lisina poli L. Utilice una punta de pipeta para esparcir este pegamento sobre el cubreobjetos.

Espere uno o dos minutos. Enjuague de tres a cuatro veces con la solución isotónica y agite la solución restante. Llene la cámara con la solución isotónica.

A continuación, utilice una punta de pipeta recortada para añadir una gota de solución que contenga protoplastos a la cámara. Y espere de tres a cuatro minutos para que los protoplastos se asienten. Cubra la cámara con una cubierta transparente que toque la superficie de la solución.

Evite atrapar burbujas de aire debajo. Coloque un portaobjetos suavemente sobre una mesa de microscopio invertida y conéctelo conectado al sistema de perfusión y a la bomba que protege contra las burbujas de aire en el tubo. Abra el flujo de solución isotónica para una perfusión constante a un mililitro por minuto.

Para registrar los cambios de volumen, elija un campo de visión con tantas celdas como sea posible que tengan forma esférica y con un contorno de celda bien enfocado en su perímetro más grande. Grabe un vídeo número 62 de protoplastos inmóviles seleccionados a una velocidad de una imagen por segundo o un hercio. Inicie la grabación con un lavado de 15 segundos de la solución isotónica y cambie a la solución hipertónica durante 45 segundos.

Guarde la película en formato Tiff en Para analizar una serie de imágenes de una célula hinchada, utilice los complementos Image Explorer y protoplasts analyzer en el software image J. Inicie la imagen J.To abra la película, haga clic en archivo en el panel Imagen J y, a continuación, consecutivamente en los menús desplegables a medida que se despliegan la importación. A continuación, el explorador de imágenes.

Resalte la película elegida. Haga clic derecho sobre él y luego izquierdo. Haga clic en el analizador de protoplastos.

En la primera imagen, utilice el ratón para dibujar círculos alrededor de los protoplastos seleccionados. A continuación, haga clic en Aceptar. En la tabla de parámetros de detección que aparece para iniciar el algoritmo de detección de protoplastos, haga clic en local en el panel superior de la imagen de protoplastos.

A continuación, procese. En el menú desplegable, examine los círculos verdes alrededor de los protoplastos seleccionados a lo largo de la película. Con el control deslizante inferior, guarde los resultados en un archivo de Excel.

El análisis se realiza fotograma a fotograma. Por lo tanto, en el caso de más de una celda, es necesario ordenar para separar las líneas que pertenecen a cada celda aquí. Los tres cursos de tiempo se muestran en una hoja de Excel antes y después de la clasificación con los valores de área convertidos de píxeles a micrómetros cuadrados.

Cada curso de tiempo se exporta a un archivo de texto separado. Para comenzar este procedimiento, conecte la cámara al sistema de perfusión y a la bomba y encienda el indicador de flujo del troquel para una tasa de perfusión constante de un mililitro por minuto, grabe un video número 62 a una velocidad de un hercio. Inicie la grabación con 15 segundos de matriz indicadora y luego cambie a la solución hipertónica Durante 45 segundos, detenga la grabación.

Enrasado con el indicador. Muere de nuevo durante al menos 30 segundos. Antes de comenzar una nueva película, grabe y guarde de cinco a seis películas para analizar las películas.

Para obtener un curso de tiempo promedio de la transmitancia del troquel indicador cambiante, inicie la imagen J haga clic en el archivo. A continuación, abra y busque la película. Para cada película, dibuje un rectángulo vertical de 10 píxeles de ancho en cualquier lugar de la primera imagen de la película, haga clic en la imagen en el panel principal de la imagen J.

A continuación, haz clic en recortar en el menú desplegable. Para alinear los 60 fotogramas en una fila, haga clic en la imagen y luego haga clic consecutivamente en los menús desplegables a medida que despliegan las pilas y hacen el montaje. Dibuje un rectángulo horizontal de un píxel de alto en cualquier lugar a lo largo de toda la fila de imágenes y haga clic en analizar en el panel principal de la Imagen J.

A continuación, haga clic en trazar perfil. En el menú desplegable, copie las listas de los datos de transmitancia en un archivo de Excel. Promedie los cursos de tiempo de transmitancia obtenidos de las películas Sero de las descargas de troqueles del indicador.

Genere una base en tiempo real multiplicando el número secuencial de la imagen por 0,1. Guarde el curso de tiempo promedio en un archivo de texto para calcular los diversos parámetros del curso de tiempo de osmolaridad. Utilice el programa de adaptación PF fit de MATLAB, que está disponible para su uso.

Gratuito. Los detalles sobre la descarga y el uso de este programa están disponibles en el texto del protocolo. En el panel de ajuste del indicador.

Importe los datos del curso del tiempo medio de la transmitancia del tinte indicador. Ingrese manualmente los parámetros del experimento actual, las conjeturas iniciales de los parámetros con ant H. La descripción del curso del tiempo de la concentración de tinte indicadora también se puede cambiar. Haga clic en ejecutar para ver el gráfico de los cursos temporales del indicador de concentración DAI y de la osmolaridad del baño modelada.

Un buen ajuste a los datos es esencial para determinar el coeficiente de permeabilidad al agua. Cambie al panel de ajuste de volumen. Elija para importar el archivo de datos del área.

Elija el último ajuste del indicador como origen del parámetro. Elija la clase de modelo. Empieza con dos.

Los parámetros PF pf slow PF y delay deben inicializarse, por ejemplo, como se muestra, pero también son posibles otros valores. Mark comprueba si se van a instalar los tres parámetros. Haga clic en ejecutar.

A continuación, observe la cifra provisional y ajuste el parámetro de retardo y la longitud del registro si es necesario. Examine el gráfico de resultados para evaluar el ajuste, la calidad y registrar el error de ajuste. Cambie los parámetros de inicialización unas cuantas veces cada uno y vuelva a ejecutar.

Repita este procedimiento varias veces, comenzando con diferentes combinaciones de parámetros de inicialización, buscando el valor más bajo del error de ajuste para determinar el coeficiente de permeabilidad al agua o pf, y compare la actividad de diferentes acuaporinas Mesil Los protoplastos de una hoja de conejo opsys se aislaron y transformaron por separado con tres construcciones génicas con genes de acuaporinas de un conejo, Opsys y Laberinto. Los protoplastos fueron marcados por co-ran con un vector que codifica una proteína fluorescente verde mejorada. Se obtuvieron los cursos temporales de los cambios en el volumen celular tras la exposición al desafío hipotónico para cada célula, así como el curso temporal del cambio en la osmolaridad del baño durante el desafío hipotónico, se derivaron los valores de PF para cada célula.

Utilizando el programa PF FIT, se observó que los valores de PF de los PROTOPLASTOS transformados con cada una de las tres acuaporinas fueron significativamente mayores que los de la PF de la celda control transformada con GFP sola. Una vez dominada, esta técnica puede proporcionar el análisis de unas pocas decenas de células en unos pocos días experimentales si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la permeabilidad al agua de SMO en protoplastos aislados u otras células focales sometidas a un ensayo hipotónico.

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