Glutamina Flux Imaging utilizando sensores codificados genéticamente

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes del transporte de glutamina mediante un transportador expresado heterólogamente en células vivas, utilizando sensores de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia o sensores FRET. Esto se logra transfectando primero células HEK293 con un sensor de glutamina y un transportador. El sensor consiste en un donador FRET insertado en una proteína bacteriana de unión a glutamina y un aceptor FRET en el extremo C de la proteína de unión a glutamina.

El segundo paso consiste en configurar un sistema de perfusión e imaginar las células en tiempo real utilizando un microscopio fluorescente invertido. El paso final es analizar las imágenes y visualizar la dinámica de la glutamina. En última instancia, las actividades del transportador en una sola célula pueden detectarse utilizando estos sensores FRET.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la medición basada en cromatografía es que se obtiene una resolución espacial y temporal mucho mayor. Esta técnica consta de tres partes: transfección de células con proteínas sensoras, imagen en tiempo real y análisis post-experimental. Se utilizan células HEK293 debido a su baja actividad endógena de transporte de glutamina.

Siembre las células a una confluencia de aproximadamente 70 a 80 % en DMEM más 10 % de suero de ternero cósmico o CCS y 100 unidades por mililitro de penicilina-estreptomicina en un plato de vidrio de ocho pocillos con fondo de vidrio. Incube a 37 grados Celsius, 5 % de CO₂, 100 % de humedad durante 24 horas.

Después de 24 horas, sustituya el medio de crecimiento por DMEM más 10 % CCS sin antibióticos y cultive durante la noche a 37 grados Celsius, 5 % CO₂ y 100 % de humedad en el día de la transfección. Añada 0,4 microgramos de cada uno de los ADN plasmídicos que codifican el sensor de glutamina y el intercambiador obligatorio de aminoácidos etiquetado mCherry A SCT2 a 50 microlitros de medio libre de suero.

Añada un microlitro de reactivo de transfección a 50 microlitros de medio sin suero, mezcle suavemente e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, mezcle la solución que contiene el ADN con el reactivo de transfección diluido e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de 20 minutos, añada suavemente la mezcla del reactivo de transfección encima de las células COS-7 e incube suavemente moviendo suavemente la cámara.

Incubar durante 24 horas a 37 grados Celsius, 5%CO2 y 100% de humedad. Después de 24 horas, reemplazar el medio con DMEM más 10%CCS más 100 unidades de penicilina-estreptomicina. Devolver las células al incubador antes de comenzar la perfusión.

Prepare los tampones de perfusión A a F siguiendo las recetas descritas en el manuscrito adjunto. Coloque cierres de tipo Cox en jeringas de 50 mililitros. Cierre los cierres y llene las jeringas con las soluciones de perfusión.

Abra la llave de paso brevemente para llenar el espacio de cabeza en la llave de paso con el tampón. A continuente, encienda la gravedad de ocho canales. Conecte el sistema de perfusión con un lápiz de perfusión y seleccione el modo manual.

Bajo la opción de función seleccionada. Coloque un recipiente de desecho debajo del lápiz de perfusión. Para el éxito de este experimento, es importante configurar la perfusión de manera que minimice la deriva y la transferencia de solución.

Active manualmente los puertos presionando los números correspondientes y llena los tubos con agua. Utilizando una jeringa de 10 mililitros, cierra los puertos, coloca las jeringas que contienen los tampones A hasta F en los puertos del uno al seis del sistema de perfusión y abre las llaves de paso. Después de eso.

Abra nuevamente los puertos para reemplazar el agua en el tubo con los tampones. La velocidad de flujo debe ser de aproximadamente 0,8 mililitros por minuto. Presione una vez cancelar en el controlador de perfusión para regresar al menú de selección de funciones.

Activa la opción de programa de edición y escribe el protocolo de perfusión indicado en esta tabla. Guarda el programa de perfusión. Las células se imaginan de 48 a 72 horas posteriores a la transfección.

Lave los pocillos del platillo con fondo de vidrio dos veces con el tampón de perfusión A, teniendo cuidado de no eliminar las células. Coloque el platillo con fondo de vidrio sobre la platina del microscopio de fluorescencia. Conecte el sistema de perfusión a la cámara.

Si se utiliza una cámara abierta, configure otra bomba que retire la solución de perfusión de la cámara. Abra el software de adquisición de imágenes del portaobjetos. Inicie un nuevo portaobjetos utilizando la función de enfoque y localice células que expresen conjuntamente el sensor y A SCT two M cherry utilizando los conjuntos de filtros adecuados.

Ajuste la ganancia haciendo clic en la pestaña de la cámara y moviendo la barra deslizante debajo de ganancia. También, ajuste la configuración del filtro de densidad neutra desde el menú desplegable de filtro de densidad neutra. Haga clic en captura de imagen y luego, en la ventana de adquisición, especifique los filtros que se utilizarán.

Las imágenes se adquirirán en tres canales: excitación del donador, emisión del donador, excitación del aceptor, emisión del aceptor, y excitación del aceptor con emisión del aceptor. Haga clic en el botón de prueba para ajustar el tiempo de exposición escribiendo el tiempo deseado en el cuadro. Junto a la configuración de filtros, los tres canales deben exponerse durante el mismo período de tiempo.

Dibuje una región de interés utilizando la herramienta de regiones. Seleccione lapso de tiempo en el cuadro de tipo de captura. Luego especifique el intervalo y los puntos temporales para el experimento.

A continuación, dibuje una región en un área sin células fluorescentes que se utilizará para la sustracción del fondo. Haga clic derecho en la región dibujada y luego establézcala como fondo. Idealmente, deben usarse células que no expresen los sensores como región de fondo, para tener en cuenta tanto la autofluorescencia como la fluorescencia de fondo detectada por la cámara.

Seleccione el programa deseado en la opción seleccionar función ejecutar programas, cambie al programa guardado y luego presione enter en el controlador de perfusión. El programa ahora está cargado y al presionar cualquier tecla se iniciará la perfusión para asegurar que tanto la perfusión como el experimento de imagen comiencen al mismo tiempo. Haga clic en el botón de inicio en la ventana de captura al mismo tiempo que presiona una tecla en el controlador de perfusión.

Se muestran aquí experimentos típicos de curso temporal utilizando células que expresan conjuntamente el transportador a s CT y sensores FRET de glutamina con afinidades de ocho milimolares y 100 micromolares. La entrada de glutamina se detecta como el cambio en las relaciones de intensidad de fluorescencia entre el donador mTFP1 y el aceptor Venus. También se demuestra la entrada de glutamina en presencia de alanina como sustrato.

Las especificidades de los transportadores también se pueden examinar utilizando los sensores. Aquí, las células se cargaron previamente con glutamina y luego se agregaron diversos aminoácidos al perfusado extracelular. Ocho como se esperaba A ct dos sustratos indujeron el flujo de glutamina, mientras que los aminoácidos que no son sustrato no lo hicieron.

La ausencia de cambios en la eficiencia de transferencia de resonancia de energía por fluorescencia (fret) tras la adición de un sustrato puede deberse a varias razones, como la baja capacidad de captación del sustrato que se está probando, tal como se observa en células que expresan el sensor de ocho milimolares o el sensor de 100 micromoles. Pero que no expresan el transportador a s CT dos, para confirmar que el cambio en la eficiencia de fret se debe al cambio real en el sustrato y no a variaciones en otros parámetros. Se realiza el mismo protocolo de perfusión utilizando células que expresan un sensor que se espera que esté saturado bajo las condiciones experimentales.

Y en este ejemplo, la afinidad del sensor es de 1,5 micromolar. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la dinámica de los metabolitos utilizando sensores FRET. No olvide que el cultivo celular debe manejarse adecuadamente siguiendo los procedimientos operativos estándar para minimizar el riesgo de exposición.