Análisis del daño epitelial Producido por Entamoeba histolytica Infección

El objetivo general de este procedimiento es evaluar las interacciones tempranas entre el huésped y el patógeno y el potencial de invasión de TBA. Histolytica. Primero hacer preparaciones de los trofozoítos intactos, los trofozoítos, los lisados totales o los trofozoítos secretados. A continuación, incubar las células epiteliales del huésped con concentraciones adecuadas de los diferentes trofozoítos.

Ahora, utilizando la inmunofluorescencia AM, analice los cultivos epiteliales tratados para seleccionar proteínas ABA histolytica que interactúan con las uniones estrechas de las células epiteliales y mida las alteraciones de la barrera paracelular por resistencia eléctrica transepitelial. Tomados en conjunto, los resultados pueden demostrar el desensamblaje de uniones estrechas por TBA Histolytica, y también identificar la participación de los complejos seleccionados en este proceso. Las principales ventajas de esta técnica son el uso de diferentes productos del parásito para evaluar la translocación de los factores Eva histo en el epitelio del huésped, así como para demostrar la participación de estos eva.

Sus factores sobre la apertura de la unión de células enteras en momentos muy tempranos de infección. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la amebatividad, como la comprensión de las interacciones moleculares entre el parásito epitelial y el parásito divaisli. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no conocen la proporción adecuada de los tiempos de incubación de las dos células para la coincubación, y también cómo obtener los diferentes productos ELI y cómo medir la TER.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestra terapia de amis, ya que estos factores vir como el complejo E-H-C-P-A-D-H 112 podrían ser explotados como dianas en nuevas estrategias de tratamiento. Cuatro. Este método in vitro puede proporcionar información sobre la participación del factor viral Anica en la interacción inicial del sitio hospitalario. También se puede aplicar a otros sistemas como inbivo, modelos de infección en ratones hámster, conejillos de indias, y también en biopsias intestinales humanas. Cultura.

Las celdas MDCK en 10 mililitros de medio DMEM complementado al 5% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius. Crece auténticamente una vez 10 al quinto trofozoíto de la ameba histolytica en 15 mililitros de TYIS 33, medio a 37 grados centígrados. Para separar los trofozoítos, enfríe el tubo durante cinco a 10 minutos en un baño de agua helada.

A continuación, transfiera el cultivo asépticamente a un tubo cónico y centrifugue a 360 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Ahora, decanta cuidadosamente el sobrenadante. Agregue PBS helado al pellet e invierta el tubo varias veces para dispersar las células después de la centrifugación.

Determine el número de trofozoítos usando un hemocitómetro para colocar los trofozoítos en nitrógeno líquido durante un minuto, descongelarlos a cuatro grados Celsius y vórtice vigorosamente. Ahora active las proteasas presentes en los lisados con 0,02%beta mercaptoetanol. Diluir nueve veces 10 a los seis trofozoítos en tres mililitros de PBS helado y transferir las células a un tubo cónico de 50 mililitros.

Ahora coloque la suspensión de trofología en un ángulo horizontal inclinado de cinco grados en una incubadora de 37 grados centígrados durante dos horas para recolectar los productos secretados, centrifugar el tubo a 360 veces G durante 10 minutos. Utilice una jeringa desechable y estéril para recoger cuidadosamente el sobrenadante, evitando la contaminación de las muestras con trofozoítos del pellet. Luego, para eliminar las células transferidas, pase el sobrenadante a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micras.

Ahora active las proteasas con 0,02%beta mercaptoetanol para el cultivo de inmunofluorescencia. Las células MDCK en una cubierta de vidrio estéril se deslizan dentro de una placa de cultivo celular de 24 pocillos múltiples. Inspeccione las células en el microscopio invertido hasta que alcancen el 100% de confluencia.

Añadir las diferentes condiciones de los trofozoítos diluidos en un mililitro de PBS tibio. Incluyen las condiciones de control de las células MDCK con PBS y sin e histolytica, así como las células MDCK con las diferentes condiciones de los trofozoítos, pero que emiten incubación con anticuerpos primarios. Coloque la placa de cultivo en la incubadora durante dos o 30 minutos.

A continuación, lave las células epiteliales cinco veces con PBS frío para eliminar las moléculas no unidas o trofozoítos. Fije y permea las celdas con un mililitro de etanol al 96% durante minutos a menos 20 grados centígrados en una cámara húmeda. Retire las tapas de los pozos con cuidado.

Retire el exceso de líquido del borde con papel de filtro y sumerja el cubreobjetos con las celdas hacia abajo en una solución de bloqueo de BSA al 0,5%. Incubar las muestras durante una hora a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare una mezcla de anticuerpos primarios en PBS.

Levante los cubreobjetos de la solución de bloqueo. Seque el exceso de líquido en papel de filtro. Transfiera las células a la solución de anticuerpos e incube las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados.

Lave las células cinco veces con un mililitro de PBS para eliminar las moléculas no unidas. Ahora prepare una mezcla de los dos anticuerpos secundarios fluorescentes en PBS. Incubar las muestras en anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad para la tinción nuclear.

Incubar las células durante tres minutos con 200 microlitros de 0,05 milimolares de solución dappy a temperatura ambiente en la oscuridad. Ahora, analizar las preparaciones por microscopía confocal a través de secciones de Zack y planos XZ en experimentos de coincubación. Usando inhibidores de la proteasa o un anticuerpo específico, incubar cada condición experimental durante 20 minutos a cuatro grados Celsius con inhibidores de la proteasa o un cultivo de anticuerpos monoclonales.

Las células MDCK en soportes permeables transwell estériles en el compartimento superior, coloquen 100 microlitros de la suspensión celular y en el compartimento inferior coloquen 600 microlitros de medio DMEM suplementado. Coloque los filtros transwell preparados en la incubadora en un microscopio invertido. Verifique que las celdas sean 100% confluentes.

Recoja y agrupe el medio del compartimento superior de cada pocillo hasta 50 microlitros de esta mezcla de medios. Añadir 50 microlitros de suspensión de trofozoítos o control PBS. Ahora transfiera las mezclas a la cámara superior de cada pocillo que contenga las celdas MDCK.

Sumerja inmediatamente los dos electrodos STX en cada pocillo trans para medir la resistencia eléctrica transepitelial. Asegúrese de que el electrodo más largo toque la parte inferior de la cámara inferior y que el electrodo más corto esté cubierto por medio en el compartimento superior. Las E. histolytica se cultivaron en condiciones de acento y se cosecharon en la fase logarítmica tardía a estacionaria temprana del crecimiento.

Aquí, se utilizó el marcador de unión estrecha cero uno para visualizar los contactos celulares de las células epiteliales que están estabilizadas por uniones estrechas y de adherencia. La inmunofluorescencia con el anticuerpo monoclonal se utilizó para estudiar la interacción del complejo derivado de la ameba con la superficie epitelial. La aplicación de trofozoítos, trofozoítos, lisados totales o productos secretados a la monocapa epitelial dio como resultado la colocalización del complejo con unión estrecha. Después de 30 minutos, se desarrolló una tinción discontinua de ZO one en los bordes celulares e internalización en vesículas.

Esta interrupción fue más prominente en los contactos de las células MDCK con trofozoítos y trofozoítos. La microscopía láser confocal de lisados totales indicó que el complejo de virulencia penetró hacia el espacio intercelular. La colocalización con el contacto interrumpido del parásito con la tinción ze O one, interrumpió la función de la barrera epitelial y dio lugar a una caída del 90% de la resistencia eléctrica transepitelial.

La preincubación de los trofozoítos con un anticuerpo contra el complejo o con inhibidores de la proteasa dio lugar a la protección contra la gota de TER tomada. Junto. Estos datos sugieren que tanto la actividad proteolítica como las propiedades adhesivas son importantes factores de virulencia de este complejo durante la invasión histolítica. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo analizar los mecanismos por los cuales EMBA histolytica viral en factores abren uniones estrechas en momentos tempranos de infección Cuando domina este análisis de daño epitelial se puede hacer en tres horas una vez que los productos de lya y los cultivos celulares están listos.

Al obtener este procedimiento, es importante recordar ceñirse a los tiempos exactos de interacción de los iones después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de inmunoprecipitación, para responder a preguntas adicionales, como las posibles asociaciones entre enba, los factores de violencia histolítica y las proteínas epiteliales después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las interacciones secundarias exploraran la patogénesis de la AMS en ratones hámster, conejillos de indias y en tejidos humanos.