Análisis del daño epitelial Producido por

El objetivo general de este procedimiento es evaluar las interacciones iniciales entre el hospedador y el patógeno, así como el potencial de invasión de TBA.Histolytica. Primero, prepare los trofozoítos intactos, los lisados totales de trofozoítos o los trofozoítos secretados. A continuación, incube las células epiteliales del hospedador con concentraciones adecuadas de los diferentes trofozoítos.

Ahora, mediante inmunofluorescencia con AM, analice las culturas epiteliales tratadas en busca de proteínas selectas de ABA histolytica que interactúan con las uniones estrechas de las células epiteliales, y también mida alteraciones en la barrera paracelular mediante la resistencia eléctrica transepitelial. En conjunto, los resultados pueden demostrar el desensamblaje de las uniones estrechas por TBA Histolytica, así como precisar la participación de los complejos selectos en este proceso. Las ventajas clave de esta técnica son el uso de diferentes productos del parásito para evaluar la translocación de factores Eva histo al epitelio del huésped, así como demostrar la participación de estos eva.

Sus factores en la apertura de uniones de células completas en momentos muy tempranos de la infección. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la invasividad amebiana, como comprender las interacciones moleculares entre las células epiteliales y el parásito *diva isli*. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque desconocen los tiempos de incubación adecuados, la proporción apropiada de los dos tipos celulares para la coincubación, así como la forma de obtener los diferentes productos ELI y cómo medir la TER.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestro tratamiento de infecciones, ya que factores virales como el complejo E-H-C-P-A-D-H 112 podrían aprovecharse como dianas en nuevas estrategias terapéuticas. Este método in vitro puede proporcionar información sobre la participación del factor viral Anica en la interacción con el sitio inicial de colonización. Asimismo, puede aplicarse a otros sistemas, como modelos de infección in vivo en hámsteres, ratones, conejillos de indias y también en biopsias intestinales humanas.

Las células MDCK en 10 mililitros de medio DMEM complementado a 5% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius. Crecer auténticamente una vez 10 a la quinta trofozoítos de *Entamoeba histolytica* en 15 mililitros de medio TYIS 33, a 37 grados Celsius. Para desprender los trofozoítos, enfríe el tubo durante cinco a 10 minutos en un baño de hielo y agua.

Luego, transfiera la cultura asépticamente a un tubo cónico y centrifugue a 360 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Ahora, deseche cuidadosamente el sobrenadante. Añada PBS frío con hielo al sedimento e invierta el tubo varias veces para dispersar las células tras la centrifugación.

Determine el número de trofozoítos utilizando un hemocitómetro para lisar los trofozoítos; congele rápidamente en nitrógeno líquido durante un minuto, descongele a cuatro grados Celsius y vortexe vigorosamente. Ahora active las proteasas presentes en los lisados con beta-mercaptoetanol al 0,02 %. Diluya nueve veces 10 a la seis trofozoítos en tres mililitros de PBS frío con hielo y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros.

Ahora coloque la suspensión de trofo en un ángulo horizontal inclinado de cinco grados en un incubador a 37 grados Celsius durante dos horas para recolectar los productos secretados; luego centrifugue el tubo a 360 ×g durante 10 minutos. Utilice una jeringa desechable y estéril para recolectar cuidadosamente el sobrenadante, evitando la contaminación de las muestras con trofozoítos del sedimento. A continuación, para eliminar cualquier célula transferida, pase el sobrenadante a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micrones.

Ahora active las proteasas con beta-mercaptoetanol al 0,02 % para el cultivo de inmunofluorescencia. Las células MDCK sobre cubreobjetos de vidrio estériles dentro de un plato de cultivo celular de 24 pocillos. Inspeccione las células en el microscopio invertido hasta que alcancen una confluencia del 100 %.

Agregue las diferentes condiciones de trofozoítos diluidas en un mililitro de PBS tibio. Incluya las condiciones de control de células MDCK con PBS y sin *E. histolytica*, así como células MDCK con las diferentes condiciones de trofozoítos, pero omitiendo la incubación con los anticuerpos primarios. Coloque la placa de cultivo en el incubador durante dos o 30 minutos.

A continuación, lave las células epiteliales cinco veces con PBS frío para eliminar moléculas no unidas o trofozoítos. Fije y permeabilice las células con un mililitro de etanol al 96 % durante minutos a menos 20 grados Celsius en una cámara húmeda. Retire cuidadosamente las laminillas de los pozos.

Retire el exceso de líquido del borde utilizando papel de filtro e introduzca la laminilla con las células hacia abajo en la solución de bloqueo con BSA al 0,5%. Incube las muestras durante una hora a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare una mezcla de anticuerpos primarios en PBS.

Levante las laminillas de la solución bloqueadora. Seque cualquier exceso de líquido sobre papel filtro. Transfiera las células a la solución de anticuerpos e incube las muestras durante la noche a cuatro grados Celsius.

Lave las células cinco veces con un mililitro de PBS para eliminar las moléculas no unidas. Prepare ahora una mezcla de los dos anticuerpos secundarios fluorescentes en PBS. Incube las muestras en los anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente y en la oscuridad para la tinción nuclear.

Incube las células durante tres minutos con 200 microlitros de una solución de dappy 0,05 milimolar a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, analice los preparados mediante microscopía confocal a través de cortes de Zack y planos XZ en experimentos de coincubación. Utilizando inhibidores de proteasas o un anticuerpo específico, incube cada condición experimental durante 20 minutos a cuatro grados Celsius con inhibidores de proteasas o un cultivo de anticuerpo monoclonal.

Células MDCK sobre soportes permeables estériles en placas transbien en el compartimento superior, coloque 100 microlitros de la suspensión celular y en el compartimento inferior coloque 600 microlitros de medio DMEM suplementado. Coloque los filtros transbien preparados en el incubador sobre un microscopio invertido. Verifique que las células sean 100 % confluentes.

Recolecte y reúna el medio del compartimento superior de cada transwell hasta obtener 50 microlitros de esta mezcla de medio. Añada 50 microlitros de suspensión de trofozoítos o control de PBS. A continuación, transfiera las mezclas al compartimento superior de cada transwell que contiene las células MDCK.

Sumerja inmediatamente los dos electrodos del STX en cada transwell para medir la resistencia eléctrica transepitelial. Asegúrese de que el electrodo más largo toque el fondo de la cámara inferior y de que el electrodo más corto quede cubierto por el medio en el compartimento superior. Las E histolytica se cultivaron en condiciones de estrés y se recolectaron en fase de crecimiento tardía logarítmica a temprana estacionaria.

Aquí, el marcador de uniones estrechas ZO-1 se utilizó para visualizar los contactos celulares de las células epiteliales que son estabilizados por uniones estrechas y de adherencia. Se empleó inmunofluorescencia con el anticuerpo monoclonal para estudiar la interacción del complejo derivado del ameba con la superficie epitelial mediante la aplicación de trofozoítos, lisados totales o productos secretados sobre la monocapa epitelial, lo que resultó en la colocalización del complejo con la unión estrecha. Tras 30 minutos, se desarrolló una tinción discontinua de ZO-1 en los bordes celulares y la internalización en vesículas.

Esta alteración fue más notable en los contactos celulares MDCK con trofozoítos y trofozoítos. Los lisados totales mediante microscopía láser confocal indicaron que el complejo de virulencia penetró hacia el espacio intercelular. La co-localización con la tinción del parásito en el punto de contacto alterado, la función de barrera epitelial interrumpida y un descenso del 90 % en la resistencia eléctrica transepitelial.

La preincubación de los trofozoítos con un anticuerpo contra el complejo o con inhibidores de proteasas resultó en protección frente a la disminución de la resistencia transepitelial (TER). En conjunto, estos datos sugieren que tanto la actividad proteolítica como las propiedades adhesivas son factores de virulencia importantes de este complejo durante la invasión por E. histolytica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar los mecanismos mediante los cuales los factores virales de E. histolytica abren las uniones estrechas en las primeras etapas de la infección. Una vez dominado este análisis, el daño epitelial puede evaluarse en tres horas, siempre que los productos lisados y los cultivos celulares estén listos.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener tiempos de interacción exactos para los iones siguiendo este protocolo. Se pueden realizar otros métodos, como ensayos de inmunoprecipitación, para responder preguntas adicionales, como posibles asociaciones entre factores de virulencia de E. histolytica y proteínas epiteliales tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las interacciones intestinales exploraran la patogénesis de la AMS en hámsteres, ratones, cobayas y tejidos humanos.