La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

El objetivo general de este procedimiento es detectar células T autorreactivas con un alto grado de especificidad utilizando dextrímeros de clase II del MHC. En este video, se obtiene cerebral del cerebro de un ratón con encefalomielitis autoinmune experimental inducida por proteína lipídica de mielina. Esto se logra primero recolectando cuidadosamente los tejidos y preparando los bloques de aros.

El segundo paso consiste en cortar el tejido embebido en aros en secciones de 200 micrómetros de grosor con un viome. Luego, las secciones se transfieren a cámaras de tejido en una placa de 24 pocillos, donde se tiñen y fijan. El paso final es montar las secciones de tejido sobre portaobjetos microscópicos.

Por último, se utiliza la microscopía confocal para mostrar las células unidas a los dextrómeros y al anticuerpo CD4. Concebimos esta idea por primera vez cuando demostramos que los dextrómeros de MHC clase II eran más sensibles que los tetrámeros convencionales de MHC clase II para detectar las células T CD4 autorreactivas específicas del antígeno. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el corte de tejidos frescos y su manipulación es bastante complicado.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de corte, montaje y análisis son difíciles de aprender debido a su complejidad. Además de Ting, dos investigadores postdoctorales, Chandy y Aaron de mi grupo, y Christian del laboratorio de la Dra. Zoe, demostrarán este procedimiento. Tras la eutanasia de los ratones con encefalomielitis autoinmune experimental o EAE, excave el cráneo cortando el cráneo de forma circular utilizando un par de tijeras curvas y gire cuidadosamente los huesos del cráneo con pinzas. Recolecte el cerebro mediante disección roma utilizando un escalpelo limpio.

Separar el rerum del cerebelo. Coloque el rerum en un tubo que contenga solución salina tamponada con fosfato fría al 1 x o PBS y deje el tubo sobre hielo hasta su procesamiento. Coloque el rerum en una caja histológica desechable con base profunda mantenida sobre hielo.

Luego, vierta agarosa fundida al 4% tamponada con PBS de punto de fusión baja en el casete. Inmediatamente, presione suavemente el cerebro con pinzas para sumergir el tejido y deje el casete sobre hielo hasta que la solidificación esté completa. Una vez solidificado, recorte el exceso de agarosa de todos los lados del tejido incluido y exponga ligeramente la superficie ventral del cerebro.

A continuación, unte el bloque de tejido Vibram con pegamento de contacto y transfiera el tejido embebido en aros sobre la superficie engrasada colocando la superficie ventral expuesta del cerebro sobre el pegamento para el corte transversal. No mueva el tejido una vez que esté colocado sobre el bloque. Coloque el bloque del vibrátomo que contiene el tejido embebido en aros sobre hielo y deje secar el pegamento durante 15 minutos.

Mientras tanto, coloque las cámaras de tejido preparadas en una placa de 24 pocillos, una cámara por pocillo. Llene los pocillos que contienen las cámaras de tejido con un mililitro de PBS 1X frío y deje la placa sobre hielo. Una vez que el pegamento esté seco, baje la cuchilla del vibromilo al nivel de la superficie superior del tejido.

Establezca la velocidad de Vibram en 0,22 milímetros por segundo e inicie el corte con un movimiento hacia adelante para obtener secciones de 200 micrómetros de grosor. Mediante un pincel suave para acuarela, transfiera una sección cerebral a cada cámara de tejido. En la placa de 24 pocillos, mantenga la placa sobre hielo hasta que finalice el corte para prevenir la degradación del tejido.

A continuación, prepare una segunda placa de 24 pocillos añadiendo 300 microlitros de un cóctel que contiene IA de la proteína lipídica proteólica de mielina S 1-39 a 1-51 dextro y anticuerpo CD4 a tres de los pocillos. Luego añada 300 microlitros del cóctel de control IA del virus de la encefalomielitis murina de Tyler S 70-86 dextro y anticuerpo CD4 a otro conjunto de tres pocillos. Proceda a etiquetar los pocillos.

Luego, transfiera tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para teñirse con dex trimers específicos a los tres pozos designados de la placa de 24 pozos, colocando una cámara por pozo. De manera similar, transfiera las tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para teñirse con dex streamers controlados a esos pozos. Coloque la tapa cubriendo los pozos, con una cámara por pozo.

Envuelva la placa con papel de aluminio y colóquela sobre una plataforma oscilante ajustada a una rotación suave durante 1,5 horas en la oscuridad y a temperatura ambiente. Después del período de incubación, lave las secciones de tejido transfiriéndolas a un pocillo nuevo que contenga un mililitro de tampón de lavado PBS 1X frío durante al menos 10 minutos en la plataforma oscilante. Repita el lavado tres veces.

Asegúrese de que los cortes de tejido no se sequen, ya que pueden adherirse a los lados de la cámara. Fije los cortes transfiriendo las cámaras de tejido a un pocillo nuevo. De la placa de 24 pocillos, conteniendo un mililitro de paraformaldehído al 4% tamponado con PBS filtrado, e incube durante dos horas en una plataforma oscilante con rotaciones suaves.

Después de lavar las secciones tres veces adicionales, coloque las secciones teñidas y fijadas sobre un portaobjetos microscópico limpio. Utilizando un pincel suave para acuarela, retire el exceso de agua sin tocar la sección y monte la sección usando un medio de montaje. Cubra con una laminilla microscópica y deje secar las preparaciones a temperatura ambiente durante la noche.

En la sala oscura, utilice un microscopio confocal Nikon A uno Eclipse 90 I para el escaneo rutinario y la adquisición de imágenes. Para comenzar, abra el software NIS elements AR, seleccione los canales tetraetil, rumina, isotiocianato o trit C y cian cinco o SCI cinco desde el panel. Las longitudes de onda de excitación y emisión para los canales trit C y SCI cinco aparecen por defecto.

Asigne el color pseudocolor verde para el canal Trit Sea y rojo para el canal SCI cinco. Coloque el portaobjetos que se va a examinar sobre la platina del microscopio y enfoque manualmente con una magnificación de 100 veces. Ajuste el HV a uno 10 y el desplazamiento a cero, haga clic en enfoque y ajuste el voltaje.

Para optimizar los láseres, haga clic en escaneo de enfoque y examine la sección de arriba abajo, y establezca el nivel Z para la adquisición de imágenes. Luego haga clic en serie CH y adquiera la imagen secuencialmente. Identifique las células T dextrógiras o positivas para CD4 positivas que aparecen como células puntuales amarillas según la colocalización de las señales generadas por ambos canales, rojo y verde.

Utilice un microscopio confocal Olympus FV 500 BX 60 para la enumeración cuantitativa sencilla de células T dextrógiras o positivas para CD4. Para comenzar, abra el software flu ovu. Seleccione los colorantes S SI three y SCI five en el menú desplegable y haga clic en aplicar para cargar los láseres respectivos.

Coloque la lámina que se va a examinar sobre la platina del microscopio y enfoque manualmente con baja ampliación haciendo clic en enfoque mientras el láser SI tres está encendido, y enfoque el foco inflamatorio. Cambie el objetivo a una ampliación de 100 veces. Establezca el tamaño de archivo en cinco 12 sobre cinco 12 desde el menú desplegable, haga clic en enfoque y ajuste los valores de ganancia y desplazamiento del PMT para optimizar por separado el láser para S SI tres y sci cinco, haga clic en la platina Z y luego haga clic en enfoque mientras ambos láseres están encendidos.

Establezca el grosor del eje Z haciendo clic en las flechas hacia arriba y hacia abajo. Establezca el intervalo Z en dos micrómetros. Haga clic en detener y elegir.

Busque 1, 2, 3. Luego haga clic en X, y, Z e inicie la adquisición de imágenes en serie Z para el área seleccionada dentro del foco inflamatorio; guarde las imágenes en serie Z como archivos VI. Para guardar los archivos de imagen, seleccione la imagen de la serie Z y luego guárdela en formato TIFF.

Siempre guarde las imágenes TIFF múltiples. Primero, para proteger los datos; el siguiente paso es examinar tres secciones apareadas que han sido teñidas con ambos juegos de cortadores de dex. En primer lugar, tome las imágenes en serie Z escaneando las láminas en un movimiento horizontal vertical hacia arriba y horizontal vertical hacia abajo, de modo que se evite la repetición de series Z dentro del mismo enfoque.

Una vez que se hayan capturado las imágenes en serie Z, asigne nombres a los archivos identificando los números de portaobjetos, los nombres de las secciones y el número de imágenes en serie Z tomadas. Utilice el software Image J para contar las células T CD4 positivas dextro positivas en relación con el número total de células T CD4 positivas. Seleccione el tipo de contador en Image J, marque mostrar todo e inicie el conteo haciendo clic en el centro de cada célula y continúe contando en diferentes imágenes en serie Z utilizando las flechas laterales.

Después de contar todas las células T CD4, seleccione otro tipo de contador y cuente las células T CD4 positivas dextro positivas. Haga clic en la pestaña de resultados para obtener el número total de células contadas con los dos contadores diferentes. La detección de células T CD4 específicas para la proteína proteolípida de mielina o PLP se realizó utilizando cortes cerebrales frescos derivados de ratones con EAE y teñidos con cócteles que contenían anti-CD4 y Dexters PLP 1-39 a 1-51 o Dexters TMEV 70 a 86 como control mediante LSCM.

El análisis de cortes cerebrales teñidos simultáneamente muestra células positivas para los trímeros PLP 1 39 a 1 51 en rojo y células positivas para el anticuerpo CD cuatro en verde, mientras que las células doblemente positivas aparecieron en amarillo. Las células teñidas simultáneamente mostraron puntos punteados alrededor de la periferia. Tal característica estuvo ausente en los cortes teñidos con el control TMEV 70 a 86.

Se realizó también la detección de linfocitos T CD4 específicos para la miosina cardíaca mediante tinción in situ con el péptido de la cadena pesada alfa de la miosina cardíaca 334-352 conjugado a Dextrómeros. El análisis de estas imágenes mediante microscopía confocal de barrido láser (LSCM) mostró la presencia de células positivas para el dextrómero MYHC 334-352 en rojo, células positivas para CD4 en verde y células unidas tanto al dextrómero como a CD4, que aparecieron como células punteadas amarillas. La tinción de fondo con los dextrómeros de control RNAs 43-56 fue despreciable. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente de ocho a diez horas, en contraste con los tres días requeridos por otros protocolos publicados, siempre que se lleve a cabo adecuadamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar los reactivos con anticipación y seguir los pasos de manera sistemática. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo seccionar y teñir los tejidos para la enumeración de linfocitos T CD4 reactivos a la proteína C reactiva en los objetivos diana.