Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial
6 de septiembre de 2014
Un método para el rápido aislamiento de las mitocondrias a partir de biopsias de tejido de mamíferos se describe. Preparaciones de hígado de rata o de músculo esquelético se homogeneizaron con un disociador tejido comercial y mitocondrias se aislaron por filtración a través de filtros diferencial de malla de nylon. Tiempo de aislamiento mitocondrial es <30 min frente a 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.
El objetivo general de este procedimiento es aislar rápidamente mitocondrias puras y con capacidad respiratoria a partir de tejido de rata. Esto se logra primero asociando y homogenizando las muestras de tejido. Los siguientes pasos consisten en mezclar la subin A en el homogenato e incubarlo en hielo.
A continuación, se filtra el homogenato, se mezcla con BSA y se vuelve a filtrar. Los pasos finales consisten en centrifugar el filtrado y resuspender los pellet mitocondriales en tampón de respiración. En última instancia, los resultados pueden demostrar que las mitocondrias aisladas son viables y tienen capacidad respiratoria mediante análisis de respiración y un ensayo de luminiscencia de ATP.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, que reportan tiempos de aislamiento mitocondrial que oscilan entre 60 y cien minutos, es que se pueden aislar mitocondrias viables y con capacidad respiratoria en menos de 30 minutos. Allison Mackay, una técnica de un laboratorio colaborador, demostrará el ensayo de luminiscencia de ATP justo antes de comenzar. Disuelva la subin A en un mililitro de tampón de homogenización y disuelva también la BSA en un mililitro de tampón de homogenización.
Ahora comience recolectando dos muestras de tejido fresco utilizando un punzón de biopsia de seis milímetros, y almacénelas en un XPBS sobre hielo en un tubo de centrífuga de 50 litros. Cuando esté listo, transfiera el tejido a un tubo de disociación C que contenga cinco mililitros de tampón homogeneizante frío. Luego, homogenice el tejido colocando el tubo en el disociador de tejidos y seleccionando el ciclo preestablecido de aislamiento mitocondrial.
Una vez finalizado, coloque el tubo nuevamente en hielo y agregue 250 microlitros de sub a lyin una solución stock. Mezcle invirtiendo el tubo. Cuando la mezcla se vea uniformemente distribuida, incube el homogenizado en hielo durante 10 minutos.
A continuación, coloque un filtro de malla de 40 micrones sobre un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros y coloque este tubo en hielo. Humedezca el filtro con tampón de homogenización y deseche el tampón en un recipiente de desecho. Luego, cuando todo esté listo, vierta el homogenato a través del filtro para obtener el filtrado.
Añada 250 microlitros de la solución stock de BSA y mezcle por inversión. Sin embargo, este paso debe omitirse para el análisis de proteínas mitocondriales. Ahora prepare dos más.
Tubos cónicos de centrífuga de 50 mililitros sobre hielo; coloque uno con un filtro de 40 micrones y el otro con un filtro de 10 micrones. Humedezca ambos filtros con un poco de tampón de homogenización y deseche este tampón. A continuación, vierta el homogenato primero a través del filtro de 40 micrones y luego a través del filtro de 10 micrones.
Estos pasos de filtración mejoran significativamente la pureza de las mitocondrias. Ahora divida el filtrado entre dos tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros previamente enfriados y centrifugue a 9.000 G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Luego retire el sobrenadante y resuspenda y combine los dos pellets mitocondriales purificados.
En un mililitro de tampón de respiración helado, es fundamental que todo el procedimiento se realice a cuatro grados Celsius. Ahora se pueden analizar las mitocondrias purificadas para determinar la actividad metabólica de las mitocondrias aisladas. Puede realizarse un ensayo de luminiscencia de ATP utilizando un kit de ensayo de ATP.
Primero, lleve los reactivos del kit a temperatura ambiente. A continuación, prepare la solución stock de HT P y colóquela en hielo. El siguiente paso es añadir cinco mililitros de tampón de sustrato a la solución de sustrato liofilizada.
Mezcle esto suavemente y coloque en la oscuridad. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de respiración a cada pocillo de una placa de 96 pocillos opaca negra. Agregue 10 microlitros de las mitocondrias preparadas a los pocillos situados debajo de los patrones de ATP.
Cada muestra mitocondrial única debe sembrarse por triplicado, colocando tres pocillos con solo tampón de respiración como control negativo. A continuación, añada 50 microlitros de solución de lisis de células de mamífero a cada pocillo una vez cargado. Incube la placa a 37 grados Celsius durante cinco minutos en un agitador orbital a 120 RPM.
Durante la incubación, prepare diluciones del patrón de ATP que varíen desde un décimo de milimolar hasta un décimo de micromolar. Tras la incubación, agregue 10 microlitros de cada uno de los patrones de ATP a los pozos correspondientes indicados en el mapa de la placa. A continuación, agregue 50 microlitros de la solución de sustrato reconstituida a cada uno.
A continuación, incubar la placa nuevamente, como antes durante cinco minutos. Proceder examinando las placas en el lector de placas. Abrir el software bajo.
Cree un elemento nuevo. Haga clic en experimento. Luego haga clic en el protocolo predeterminado y haga clic en aceptar.
En la columna izquierda, seleccione protocolo. A continuación, procedimiento siguiente. Luego, seleccione retardo y ajústelo a 10 minutos. A continuación, acepte la entrada.
Ahora seleccione, lea y elija luminiscencia en el menú desplegable. Ajuste los demás parámetros como sigue. Tipo de lectura: integración en punto final.
Un segundo. Configure el conjunto de filtros en la posición óptica del orificio de emisión, sensibilidad máxima en 100, y desplazamiento vertical de la sonda superior en un milímetro. Después de realizar estos cambios en la configuración, haga clic en aceptar.
Haga clic en la distribución de la placa y configúrela en consecuencia. Haga clic en aceptar. Ahora que todo está configurado, haga clic en el icono de lectura de placa en la fila superior y luego en leer.
Cuando se abra el espectrofotómetro, coloque la placa en la bandeja con el pocillo A1 en la esquina superior izquierda. Ahora se abrirá un cuadro que muestra la temperatura; haga clic en aceptar y luego continúe con el análisis de los datos. Muestras de músculo esquelético que pesaban aproximadamente 0,18 gramos en estado húmedo rindieron alrededor de 24 mil millones de mitocondrias según el recuento por tamaño de partículas.
Muestras de hígado del mismo tamaño dieron unos pocos miles de millones más. Las lecturas del citómetro de hemoglobina mitocondrial se subestimaron utilizando el contador de partículas. Se obtuvo un trazado representativo, que muestra que las mitocondrias aisladas se localizan bajo un solo pico con un diámetro medio de aproximadamente cuatro décimas de micrón.
Esto está de acuerdo con informes previos que utilizaron el ensayo de ácido biácido. La proteína mitocondrial se midió en unos pocos miligramos por gramo de tejido de músculo esquelético e hígado. El producto fue viable y con capacidad respiratoria.
Mitocondrias aisladas en un período de tiempo compatible con intervenciones terapéuticas clínicas y quirúrgicas. Micrografías electrónicas de transmisión indicaron que las mitocondrias aisladas eran todas densas al electrón, con daño inferior a una de cada 10.000 y contaminación menor a una de cada cien mil en el ensayo de ATP. Los resultados revelaron que las mitocondrias eran viables y que el contenido de ATP era de aproximadamente 11 a 15 nanomoles por miligramo de proteína mitocondrial.
El análisis de la respiración mitocondrial se realizó utilizando un electrodo del tipo Clark y reveló que el consumo de oxígeno fue de aproximadamente 180 MLEs de oxígeno por minuto por cada miligramo de proteína mitocondrial, mientras que los valores de RCI fueron de alrededor de 2,5, con una puntuación ligeramente más alta en el hígado. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de 30 minutos si se lleva a cabo correctamente.
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Descripción general
Este artículo describe un método rápido para aislar mitocondrias puras y con capacidad respiratoria a partir de biopsias de tejido de rata. El procedimiento reduce significativamente el tiempo de aislamiento a menos de 30 minutos en comparación con los métodos tradicionales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación mitocondrial
Antecedentes
- Las mitocondrias son esenciales para la respiración celular y la producción de energía.
- Los métodos tradicionales de aislamiento mitocondrial pueden ser lentos.
- Las técnicas rápidas de aislamiento pueden mejorar la eficiencia experimental.
- Las mitocondrias viables son cruciales para estudios metabólicos precisos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método más rápido para aislar mitocondrias de tejidos de mamíferos.
- Asegurar que las mitocondrias aisladas sean puras y funcionalmente competentes.
- Facilitar análisis posteriores de respiración y ensayos de ATP.
Métodos Utilizados
- Homogeneización de muestras de hígado de rata o músculo esquelético.
- Uso de un disociador de tejidos comercial para una mezcla eficiente.
- Filtración secuencial a través de filtros de malla de nailon.
- Resuspensión de los pellet mitocondriales en tampón de respiración.
Resultados principales
- El tiempo de aislamiento reducido a menos de 30 minutos.
- Las mitocondrias aisladas demostraron viabilidad y capacidad respiratoria.
- Los resultados validados mediante análisis de respiración y ensayos de luminiscencia de ATP.
- El método muestra potencial para aplicaciones más amplias en la investigación metabólica.
Conclusiones
- El método de aislamiento rápido es efectivo para obtener mitocondrias funcionales.
- Esta técnica puede agilizar los procesos de investigación en estudios mitocondriales.
- Estudios futuros podrían explorar su aplicación en diversos tejidos de mamíferos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento rápido de mitocondrias en menos de 30 minutos permite una evaluación funcional oportuna para estudios metabólicos preclínicos y cribados terapéuticos. Este método apoya la validación de objetivos al proporcionar mitocondrias con capacidad respiratoria a partir de biopsias de tejido, reduciendo la variabilidad biológica en las fases iniciales del descubrimiento. El protocolo estandarizado de disociación y filtración del tejido mejora la reproducibilidad entre laboratorios, facilitando la generación de datos consistentes para tomar decisiones de avance o interrupción en programas dirigidos a las mitocondrias.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función mitocondrial como diana terapéutica en modelos de enfermedades metabólicas.
- Valor operativo: Sustituye la homogenización manual por una disociación estandarizada de tejidos para una preparación uniforme de muestras.
- Valor predictivo: Produce mitocondrias viables para ensayos de respiración y ATP, lo que apoya la reducción mecanicista de riesgos de compuestos líderes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona mitocondrias purificadas adecuadas para ensayos de respiración de alto contenido y basados en luminiscencia.
- Valor operativo: Elimina pasos repetitivos de centrifugación mediante filtración diferencial, aumentando el rendimiento.
- Preparación para ensayos: Ofrece rendimientos mitocondriales consistentes (~2x10^10 por 0,18 g de tejido) para cribado confiable de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la integridad mitocondrial y la competencia respiratoria, fundamentales para las pruebas de eficacia preclínicas.
- Valor operativo: Compatible con los plazos clínicos, lo que permite el aislamiento dentro de las ventanas de intervención quirúrgica.
- Continuidad traslacional: Facilita la alineación de biomarcadores mediante mediciones del contenido de ATP y del consumo de oxígeno.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se enmarca en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la evaluación mitocondrial preclínica, ofreciendo un paso rápido y reproducible antes de los estudios de cribado de compuestos o de eficacia.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la disfunción mitocondrial en modelos de enfermedad mediante lecturas funcionales.
- Tamización: Permite obtener preparaciones mitocondriales listas para ensayos con mayor pureza mediante filtración secuencial de 40µm y 10µm.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos para el análisis de la respiración (consumo de oxígeno) y la luminiscencia de ATP, facilitando la comparación entre condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica mediante mitocondrias con capacidad respiratoria adecuadas para pruebas ex vivo.
- Reutilización Empresarial: El protocolo estandarizado que utiliza un disociador de tejidos comercial permite su adopción entre laboratorios e integración en flujos de trabajo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en el compromiso del blanco mitocondrial mediante ensayos validados de respiración y ATP.
- Valor operativo: La reducción del tiempo de aislamiento (<30 min) y la eliminación de los pasos de centrifugación en gradiente aumentan la eficiencia del laboratorio.
- Valor estratégico: Permite una iteración más rápida en la identificación de compuestos activos al proporcionar datos funcionales mitocondriales oportunos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al reducir los falsos positivos en el cribado dirigido a mitocondrias.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos y en técnicas de ensayo mitocondrial.
- Depende del acceso a un disociador de tejidos comercial con ciclo predeterminado de aislamiento mitocondrial.
- Necesita filtros estériles de malla de nailon (40 µm y 10 µm) y centrifugación con control de temperatura (4 °C, 9 000 × g).
- La estandarización entre diferentes tipos de tejidos (por ejemplo, músculo esquelético, hígado) puede requerir la optimización de los parámetros de disociación.
- Limitación práctica: el método ha sido validado en tejidos de rata; la extrapolación a tejidos humanos u otros mamíferos requiere una validación adicional.
