Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial
6 de septiembre de 2014
Un método para el rápido aislamiento de las mitocondrias a partir de biopsias de tejido de mamíferos se describe. Preparaciones de hígado de rata o de músculo esquelético se homogeneizaron con un disociador tejido comercial y mitocondrias se aislaron por filtración a través de filtros diferencial de malla de nylon. Tiempo de aislamiento mitocondrial es <30 min frente a 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.
El objetivo general de este procedimiento es aislar rápidamente las mitocondrias puras y competentes para la respiración del tejido de rata. Esto se logra asociando y homogeneizando primero las muestras de tejido. Los siguientes pasos son mezclar la subina A en el homogeneizado e incubarla en hielo.
A continuación, se filtra la mezcla homogeneizada en BSA y se vuelve a filtrar. Los pasos finales son reducir el filtrado y volver a suspender los gránulos mitocondriales en el tampón de respiración. En última instancia, los resultados pueden mostrar que las mitocondrias aisladas son viables y competentes para la respiración a través del análisis de la respiración y un ensayo de luminiscencia A TP.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes que informan de tiempos de aislamiento mitocondrial que oscilan entre 60 y cien minutos, es que las mitocondrias viables y competentes para la respiración pueden aislarse en menos de 30 minutos. Allison Mackay, una técnica de un laboratorio colaborador hará una demostración del ensayo de luminiscencia A TP justo antes de comenzar. Disuelva la subina A en un mililitro de tampón homogeneizador y disuelva el BSA también en un mililitro de tampón homogeneizador.
Ahora comience con la recolección de dos muestras de tejido fresco con un punzón de muestras de biopsia de seis milímetros y guárdelas en un XPBS en hielo en un tubo de centrífuga de 50 litros. Cuando esté listo, transfiera el tejido a un tubo C de disociación que contenga cinco mililitros de tampón homogeneizador helado. A continuación, homogeneizar el tejido ajustando el tubo a la disociación del tejido y seleccionando el ciclo de aislamiento mitocondrial preestablecido.
Una vez terminado, vuelva a colocar el tubo en hielo y agregue 250 microlitros de sub para reposar en una solución madre. Mezcla esto por inversión. Cuando la mezcla se vea distribuida uniformemente, incube el homogeneizado en hielo durante 10 minutos.
A continuación, coloque un filtro de malla de 40 micras en un tubo de centrífuga cónico de 50 mililitros y empaquételo en el hielo. Humedezca el filtro con tampón homogeneizador y deseche el tampón en un contenedor de residuos. Luego, una vez que todo esté listo, vierta el homogeneizado a través del filtrado.
Agregue 250 microlitros de solución madre BSA y mezcle por inversión. Sin embargo, este paso debe omitirse para el análisis de proteínas mitocondriales. Ahora prepara dos más.
Los tubos de centrífuga cónicos de 50 mililitros sobre hielo se ajustan a uno con un filtro de 40 micras y al otro con un filtro de 10 micras. Humedece ambos filtros con un poco de tampón homogeneizador y desecha este tampón. Luego vierta el homogeneizado primero a través del filtro de 40 micras y luego a través del filtro de 10 micras.
Estos pasos de filtración mejoran significativamente la pureza de las mitocondrias. Ahora divida el filtrado entre dos tubos de micro fuga preenfriados de 1,5 mililitros y centrifugue a 9.000 Gs durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender y combinar los dos gránulos mitocondriales purificados.
En un mililitro de tampón de respiración helada, es vital que todo el procedimiento se realice a cuatro grados centígrados. Las mitocondrias purificadas ahora se pueden analizar para determinar la actividad metabólica de las mitocondrias aisladas. Un ensayo de luminiscencia A TP se puede realizar utilizando un kit de ensayo A TP.
Primero, lleve los reactivos del kit a temperatura ambiente. A continuación, prepare la solución madre HT P y colóquela en hielo. El siguiente paso es añadir cinco mililitros de tampón de sustrato a la solución de sustrato liofilizado.
Mezcle esto suavemente y colóquelo en la oscuridad. Luego agregue 100 microlitros de tampón de respiración a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que es de color negro opaco. Agregue 10 microlitros de las mitocondrias preparadas a los pocillos por debajo de los estándares A TP.
Cada muestra mitocondrial única debe colocarse en una placa triplicada de tres pocillos de tampón de respiración solo como control negativo. Continúe agregando 50 microlitros de solución de lisis de células de mamíferos a cada pocillo una vez cargado. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante cinco minutos en un agitador orbital a 120 RPM.
Durante la incubación, prepare diluciones del patrón A TP que van desde un 10º milimolar hasta un 10º micromolar. Después de la incubación, agregue 10 microlitros de cada uno de los patrones A TP a los pocillos correspondientes indicados en el mapa de placas. A continuación, agregue 50 microlitros de la solución de sustrato reconstituido a cada uno.
Pues bien, vuelve a incubar la placa, como antes, durante cinco minutos. Proceda examinando las placas en el lector de placas. Abra el software en.
Cree un nuevo elemento. Haga clic en experimentar. Luego haga clic en protocolo predeterminado y haga clic en Aceptar.
En la columna de la izquierda, seleccione protocolo. A continuación, seleccione el retraso y configúrelo en 10 minutos. Entonces está bien, la entrada.
Ahora seleccione, lea y elija luminiscencia en el menú desplegable. Ajuste los demás ajustes de la siguiente manera. Tiempo de integración del punto de conexión de tipo de lectura.
Un segundo. El filtro establece una posición óptica de orificio de emisión, sensibilidad superior 100, desplazamiento vertical de la sonda superior un milímetro. Después de realizar estos cambios en la configuración, haga clic en Aceptar.
Haga clic en el diseño de la placa y configúrelo en consecuencia. Haga clic en Aceptar. Ahora, con todo configurado, haga clic en el icono de la placa de lectura en la fila superior y haga clic en leer.
Cuando se abra el espectrofotómetro, coloque la placa en la bandeja con el pocillo A uno en la esquina superior izquierda. Ahora se abrirá un cuadro que muestra la temperatura, haga clic en Aceptar y luego continúe con el análisis de los datos. Las muestras de músculo esquelético que pesaban alrededor de 0,18 gramos húmedas produjeron alrededor de 24 mil millones de mitocondrias según el recuento del tamaño de las partículas.
Las muestras de hígado del mismo tamaño dieron unos pocos miles de millones más. Las lecturas del hemocitómetro mitocondrial se subestimaron utilizando el contador de partículas. Se obtuvo un trazado representativo, que muestra que las mitocondrias aisladas se localizan bajo un pico con un diámetro medio de aproximadamente cuatro décimas de micra.
Esto concuerda con informes previos que utilizan el ensayo biácido. La proteína mitocondrial se midió a unos pocos miligramos por gramo de tejido del músculo esquelético y el hígado. El producto era viable y respiratorio competente.
Mitocondrias aisladas en un plazo compatible para la intervención terapéutica clínica y quirúrgica. Las micrografías electrónicas de transmisión indicaron que las mitocondrias aisladas eran todas dentadas electrónicas con daños en menos de una en 10.000, la contaminación era de menos de una en cien mil A TP ensayo. Los resultados revelaron que las mitocondrias eran viables y que el contenido de TP era de alrededor de 11 o 15 nanomoles por miligramo de proteína mitocondrial.
El análisis de la respiración mitocondrial se realizó utilizando un electrodo tipo Clark y reveló que el consumo de oxígeno era de aproximadamente 180 MLEs de oxígeno por minuto. Por cada miligramo de proteína mitocondrial, mientras que los valores de RCI estaban en torno a 2,5 con una puntuación hepática ligeramente más alta. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 30 minutos si se realiza correctamente.
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Descripción general
Este artículo describe un método rápido para aislar mitocondrias puras y con capacidad respiratoria a partir de biopsias de tejido de rata. El procedimiento reduce significativamente el tiempo de aislamiento a menos de 30 minutos en comparación con los métodos tradicionales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación mitocondrial
Antecedentes
- Las mitocondrias son esenciales para la respiración celular y la producción de energía.
- Los métodos tradicionales de aislamiento mitocondrial pueden ser lentos.
- Las técnicas rápidas de aislamiento pueden mejorar la eficiencia experimental.
- Las mitocondrias viables son cruciales para estudios metabólicos precisos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método más rápido para aislar mitocondrias de tejidos de mamíferos.
- Asegurar que las mitocondrias aisladas sean puras y funcionalmente competentes.
- Facilitar análisis posteriores de respiración y ensayos de ATP.
Métodos Utilizados
- Homogeneización de muestras de hígado de rata o músculo esquelético.
- Uso de un disociador de tejidos comercial para una mezcla eficiente.
- Filtración secuencial a través de filtros de malla de nailon.
- Resuspensión de los pellet mitocondriales en tampón de respiración.
Resultados principales
- El tiempo de aislamiento reducido a menos de 30 minutos.
- Las mitocondrias aisladas demostraron viabilidad y capacidad respiratoria.
- Los resultados validados mediante análisis de respiración y ensayos de luminiscencia de ATP.
- El método muestra potencial para aplicaciones más amplias en la investigación metabólica.
Conclusiones
- El método de aislamiento rápido es efectivo para obtener mitocondrias funcionales.
- Esta técnica puede agilizar los procesos de investigación en estudios mitocondriales.
- Estudios futuros podrían explorar su aplicación en diversos tejidos de mamíferos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento rápido de mitocondrias en menos de 30 minutos permite una evaluación funcional oportuna para estudios metabólicos preclínicos y cribados terapéuticos. Este método apoya la validación de objetivos al proporcionar mitocondrias con capacidad respiratoria a partir de biopsias de tejido, reduciendo la variabilidad biológica en las fases iniciales del descubrimiento. El protocolo estandarizado de disociación y filtración del tejido mejora la reproducibilidad entre laboratorios, facilitando la generación de datos consistentes para tomar decisiones de avance o interrupción en programas dirigidos a las mitocondrias.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función mitocondrial como diana terapéutica en modelos de enfermedades metabólicas.
- Valor operativo: Sustituye la homogenización manual por una disociación estandarizada de tejidos para una preparación uniforme de muestras.
- Valor predictivo: Produce mitocondrias viables para ensayos de respiración y ATP, lo que apoya la reducción mecanicista de riesgos de compuestos líderes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona mitocondrias purificadas adecuadas para ensayos de respiración de alto contenido y basados en luminiscencia.
- Valor operativo: Elimina pasos repetitivos de centrifugación mediante filtración diferencial, aumentando el rendimiento.
- Preparación para ensayos: Ofrece rendimientos mitocondriales consistentes (~2x10^10 por 0,18 g de tejido) para cribado confiable de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la integridad mitocondrial y la competencia respiratoria, fundamentales para las pruebas de eficacia preclínicas.
- Valor operativo: Compatible con los plazos clínicos, lo que permite el aislamiento dentro de las ventanas de intervención quirúrgica.
- Continuidad traslacional: Facilita la alineación de biomarcadores mediante mediciones del contenido de ATP y del consumo de oxígeno.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se enmarca en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la evaluación mitocondrial preclínica, ofreciendo un paso rápido y reproducible antes de los estudios de cribado de compuestos o de eficacia.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la disfunción mitocondrial en modelos de enfermedad mediante lecturas funcionales.
- Tamización: Permite obtener preparaciones mitocondriales listas para ensayos con mayor pureza mediante filtración secuencial de 40µm y 10µm.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos para el análisis de la respiración (consumo de oxígeno) y la luminiscencia de ATP, facilitando la comparación entre condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica mediante mitocondrias con capacidad respiratoria adecuadas para pruebas ex vivo.
- Reutilización Empresarial: El protocolo estandarizado que utiliza un disociador de tejidos comercial permite su adopción entre laboratorios e integración en flujos de trabajo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en el compromiso del blanco mitocondrial mediante ensayos validados de respiración y ATP.
- Valor operativo: La reducción del tiempo de aislamiento (<30 min) y la eliminación de los pasos de centrifugación en gradiente aumentan la eficiencia del laboratorio.
- Valor estratégico: Permite una iteración más rápida en la identificación de compuestos activos al proporcionar datos funcionales mitocondriales oportunos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al reducir los falsos positivos en el cribado dirigido a mitocondrias.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos y en técnicas de ensayo mitocondrial.
- Depende del acceso a un disociador de tejidos comercial con ciclo predeterminado de aislamiento mitocondrial.
- Necesita filtros estériles de malla de nailon (40 µm y 10 µm) y centrifugación con control de temperatura (4 °C, 9 000 × g).
- La estandarización entre diferentes tipos de tejidos (por ejemplo, músculo esquelético, hígado) puede requerir la optimización de los parámetros de disociación.
- Limitación práctica: el método ha sido validado en tejidos de rata; la extrapolación a tejidos humanos u otros mamíferos requiere una validación adicional.
