En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

El objetivo general de este procedimiento es obtener pilas 3D de alta resolución que contengan células madre y progenitoras hematopoyéticas, y monitorearlas a lo largo del tiempo a través de imágenes de lapso de tiempo multipunto. Esto se logra marcando primero las células madre hematopoyéticas y progenitoras o HSC con un tinte lipofílico. A continuación, las HSC se inyectan en un ratón receptor.

El ratón está preparado para la microscopía utilizando un casco personalizado y un soporte de muestras para el posicionamiento de los animales estables. A continuación, se obtienen las pilas de alta resolución de nichos de células madre hematopoyéticas y progenitoras y se realizan imágenes de lapso de tiempo de múltiples ubicaciones de médula ósea que contienen HS PC, en última instancia, confocal intravital y se utilizan microscopías de dos fotones para mostrar la localización y el movimiento de las HSC en el espacio de la médula ósea. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la inmunofluorescencia en cortes de médula ósea, es que somos capaces de capturar información a escala de cuatro dimensiones, tres dimensiones más tiempo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de las enfermedades hematológicas porque ayuda a entender dónde debemos dirigir las células madre hematopoyéticas dentro de la médula ósea para garantizar su correcto funcionamiento. La primera vez que tuvimos esta idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de lo crucial que era poder seguir los PC HS a lo largo del tiempo. Este método nos ayuda a responder cualquier pregunta que tengamos sobre el campo del nicho de las células madre donde queremos saber dónde residen las células madre y cómo se comportan a lo largo del tiempo.

Para comenzar, se recolectan las células madre y progenitoras hematopoyéticas como lo demostró este laboratorio en un video geográfico anterior y se referenciaba en el protocolo de texto. A continuación, agregue el colorante lipofílico DID a la suspensión celular a una concentración final de cinco micromolares. Agita la suspensión inmediatamente para asegurarte de que el tinte no se precipite fuera de la solución y no etiquete las células.

Incubar las células durante 10 minutos a 37 grados centígrados para lavar las células. Primero gire a 500 veces G durante cinco minutos y decantar el líquido. A continuación, vuelva a suspender las células en 200 microlitros de PBS y recolóquelas en una jeringa de insulina.

Se recomienda una jeringa de insulina en lugar de una jeringa convencional porque no tiene espacio muerto en la aguja. Permitir la administración de toda la suspensión celular al ratón para inyectar células en un ratón letalmente irradiado a través de la inyección en la vena de la cola. Primero coloque el mouse en una cámara tibia.

Una vez que aparezca la vena de la cola, vasodilatada, mueva el ratón hacia el restricción. Deslice con cuidado la aguja en la vena de la cola. Inyecta las células en la vena.

No se debe encontrar resistencia a la inyección. Deja el ratón toda la noche. Para permitir que las células migren a los espacios de la médula ósea, anestesiar al ratón y controlar el inicio de la anestesia profunda a través del reflejo pétalo.

Frote la parte superior del cuero cabelludo con etanol al 70% en un pañuelo de papel. Teniendo cuidado de que no entre etanol en los ojos del ratón. Para exponer el área del pantorral que se va a fotografiar, haga una pequeña incisión en la parte posterior de la cabeza, entre las orejas, levantando la piel con las pinzas mientras sostiene la piel hacia arriba.

Deslice las tijeras debajo de la piel y corte suavemente a lo largo del exterior del área de imagen deseada. Limpie el hueso expuesto con un bastoncillo de algodón estéril humedecido con PBS estéril para mantener el hueso húmedo. Esto evita el secado excesivo y la formación de cicatrices, que pueden afectar a la calidad de la imagen.

A continuación, mezcle una cantidad adecuada de cemento dental en un bote de suero hasta que se convierta en una pasta. Aplícalo rápidamente en la superficie inferior del cabezal del autoclave que se fijará al cráneo. Antes de que el cemento se asiente, coloque el casco en el cráneo del ratón, asegurándose de que no caiga ningún cemento dental en el área de la imagen y espere a que se asiente.

Aplique una pequeña cantidad de hidrogel intra, que mantiene el cráneo húmedo, teniendo cuidado de no alterar el cemento mientras se seca. A continuación, fije el casco al soporte y asegúrelo en su lugar. Usando el tornillo asegurándose de que las ranuras encajen dentro de las muescas del soporte.

Retire el hidrogel con bastoncillos de algodón estériles antes de transferirlo al microscopio. A continuación, inserte el soporte en la platina del microscopio y coloque la alfombrilla calefactora debajo del ratón. Inserte la sonda del termómetro rectal y asegure todo en su lugar en el escenario con cinta adhesiva.

Coloque una pequeña gota de ungüento oftálmico en los ojos del ratón para asegurarse de que no se sequen mientras están bajo anestesia. El ratón no debe dejarse desatendido en ningún momento durante el proceso de obtención de imágenes mientras esté bajo anestesia. Para enfocar el cráneo a través de los oculares.

Primero, llene la ventana de imágenes del cráneo con agua estéril purificada usando una lente de inmersión en agua. Bájalo para que toque la gota de agua. Concéntrese en la parte superior del cráneo con los oculares del microscopio.

Coloque el área de imagen en la sutura central y muévase hacia la parte posterior de la cabeza para encontrar la sutura coronal. Como posición inicial, coloque el software en un modo para capturar imágenes XY, así como en una pila de tres DZ. Establezca la velocidad de imagen en 400 hercios y la resolución en 512 por 512 píxeles.

Configure el software para que se capturen varios canales y configure el método de recopilación para cambiar la configuración entre pilas o entre fotogramas. Configure tres configuraciones de captura independientes. Apagar la iluminación láser al final de la adquisición de cada pila.

A continuación, configure el primer escaneo secuencial para la señal ósea de generación de dos fotones de segundo armónico. Abra el obturador para el láser multifotónico y asegúrese de que la ganancia y el desplazamiento del láser multifotónico estén configurados correctamente. Además, asegúrese de que la potencia del láser sea del 12,5 al 25% y que el láser esté encendido.

Seleccione un PMT apropiado como único detector y cambie el color a blanco. Repita el procedimiento de configuración de canales para la combinación de autofluorescencia y DID en la segunda configuración. Escanee utilizando dos p mts apropiados.

Cambie el color del canal a verde para la autofluorescencia y a rojo para el DID. Por último, configure el tercer y último análisis para la detección de GFP. Ajuste la potencia del láser de la línea láser de 488 nanómetros a alrededor del 15%Seleccione un tubo fotomultiplicador o PMT apropiado como único detector activo y cambie su pseudo color a verde.

Active un modo de imagen en vivo para comenzar una vista previa del canal seleccionado y ajustar la ganancia y el desplazamiento del detector para una exposición óptima. Repita esto para cada escaneo en la ventana secuencial y guarde la configuración de estos escaneos multicanal para facilitar su reutilización. A continuación, active la captura de múltiples posiciones, denominada marcar y encontrar en este software, y restablezca los puntos de coordenadas.

A continuación, explora el área de imagen ósea a partir de la intersección entre la sutura central y la coronal. Escanee la profundidad del área de la médula ósea utilizando autofluorescencia y DID con una vista compuesta. Cuando se detecte una celda, márquela como una nueva posición de coordenadas haciendo clic en el icono de agregar nueva posición en el lado izquierdo de la marca y la ventana.

Cuando se haya examinado el campo de visión actual, mueva el escenario a la distancia de un campo de visión. Repita este proceso para cada campo de visión. Trabajando gradualmente alrededor de toda la ventana de imagen a la izquierda de la sutura central, moviéndose hacia la nariz del ratón.

Una vez que la bifurcación central de la sutura esté a la vista, muévase al lado derecho de la sutura y repita el procedimiento. Escaneando el lado izquierdo en la dirección inversa. Marque las coordenadas de cualquier nueva celda de interés con la herramienta de marcar y buscar.

Para revisar los puntos, establezca la parte superior e inferior de una pila de Zs alrededor de cada celda para cada posición. Para cada punto, concéntrese hacia arriba y hacia abajo y establezca las posiciones Z superior e inferior para la captura de tres pilas DZ. Actualice el punto individual en la marca y la búsqueda, establezca el intervalo de Zack en cinco micrómetros y el promedio de cada canal de escaneo secuencial a una calidad adecuada.

Adquiera una pila de referencia de alta calidad para cada punto de interés iniciando todo el procedimiento de escaneo. Una vez que haya terminado con el escaneo de alta calidad, active una configuración de lapso de tiempo para la captura y la configuración de lapso de tiempo. Establezca el intervalo de tiempo en cinco minutos y el tiempo de ejecución total en la duración deseada.

Aplique esta configuración al análisis general. Este ejemplo muestra cómo se puede realizar la adquisición de más de tres puntos: Al modificar esta configuración, el tiempo de escaneo se puede reducir para permitir un intervalo de lapso de tiempo de cinco minutos al reducir el número de escaneos utilizados para promediar la resolución a 512 por 512 píxeles. Convirtiendo el escaneo a bidireccional y/o aumentando la velocidad de escaneo a 600 hercios o más, comience la imagen como antes haciendo clic en el botón de inicio y en el software demostrado.

Una vez completadas las imágenes, realice la eutanasia del ratón como se detalla en el protocolo de texto. El soporte de ratón de alta precisión hecho a medida, que incluye una ventana de imágenes de calvario, permite la obtención de imágenes prolongadas de PC HS marcadas inyectadas en ratones receptores irradiados letalmente. Aquí se muestran cortes 2D de pilas 3D de HSPC con resolución de una sola celda que contienen áreas de médula ósea de aproximadamente 90 a 120 micrómetros de espesor señal de colágeno. El hueso se muestra en blanco, las células marcadas con DID se muestran en rojo.

Las células autofluorescentes se muestran en amarillo y las células osteoblásticas se muestran en verde. Aquí se muestra una película de lapso de tiempo de 40 de las PC HS identificadas que muestran A DID etiquetado como HSC en rojo, migrando en la proximidad de las células osteoblásticas en verde una vez dominado. Esta técnica debe poder realizarse en aproximadamente una hora para la cirugía y la imagen inicial, seguida del tiempo adecuado para la imagen de lapso de tiempo.

Una vez que haya visto este video, debería estar bastante seguro de poder configurar la imagen del parálido del mouse y mirar varias PC HS a lo largo del tiempo.