Name: Un nuevo enfoque para la recuperación Microdissection Mycobacterium tuberculosis Las transcripciones específicas de formalina parafina fijo Embedded pulmón granulomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende la técnica de mesodisección para extraer ARN de tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina. Este método permite analizar la expresión génica de Mycobacterium tuberculosis en granulomas pulmonares.

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Los autores desean agradecer a las siguientes NIH premios / sub-premios para el apoyo de esta investigación: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, y P51OD011104.

1. Calibrar Instrumento Mesodissection con 2ID Imaging Software El software de imágenes 2ID se conoce como el software o el programa para el resto de este artículo. Este paso es necesario para seguir correctamente la imagen, así como alinear varios marcos de diapositivas. <ol><li> Encienda el instrumento y el ordenador. </li><li> Abra el software y seleccione &quot;instrumento de calibración&quot;. </li><li> Calibrar viajes etapa con el joystick. Mueva el escenario a la posición superior izquierda. Pulse el botón &quot;set&quot; en el paso 1 en el programa. </li><li> Mueva el escenario para bajar la posición correcta. Pulse el botón &quot;set&quot; en el paso 2 en el programa. </li><li> Calibrar la aspiración pulsando primero &quot;Z-button&quot; para recaudar conjunto de la cabeza. Pulse el botón &quot;pulso aspirado&quot; y el botón &quot;disección&quot; en la palanca de mando hasta que la varilla de control de émbolo alcanza la primera posición. Pulse el botón &quot;set&quot; en el paso 3 del programa. </li><li> Pulse el botón &quot;reinicio aspirado y# 8221; botón. Una vez que el émbolo se detiene en la posición de la prensa &quot;conjunto&quot; de abajo en el paso 4. </li><li> Haga clic en la pestaña de &quot;escala&quot;. </li><li> Coloque la regla de calibración en el lado blanco. </li><li> Centrarse microscopio si es necesario. </li><li> Dibuja una línea entre las dos barras de escala a través del ratón. </li><li> Introduzca la distancia en el recuadro paso 2 botón. Presione &quot;compute&quot; etiquetados. </li><li> Haga clic en la pestaña de &quot;punto de mira&quot;. Gire la velocidad del motor a 1. </li><li> Inserte xScisor en el conjunto de cabeza. Conjunto de la cabeza inferior en el eje z posición lista pulsando el botón &quot;eje Z&quot;. NOTA: El conjunto de la cabeza es la gran estructura en la parte superior del instrumento de disección. El xScisor se conoce como un poco molino de consumible para el resto de este artículo. </li><li> Haga clic en el botón &quot;disección de participar&quot; en la palanca de mando. NOTA: Este botón se encuentra en la parte superior de la palanca de mando. </li><li> Definir centro de rotación visual. Para ello, mueva centro del punto de mira sobre el centro de giro con definird parámetro en el paso 1 del programa. Use la flechas arriba y abajo en la &quot;x&quot; y los bares &quot;eje y&quot; para ajustar los píxeles para alinear en forma de cruz. Haga clic en la pestaña de &quot;hecho&quot;. </li><li> Haga clic en el icono de &quot;casa&quot;. NOTA: Esto se representa una imagen de la casa ubicada en la esquina superior derecha cerca. </li></ol> 2. Crear Imagen de referencia <ol><li> Coloque H &amp; E diapositivas en el escenario. Coloque la tapa opaca en la parte superior de la diapositiva. Conducir el instrumento moviendo el joystick hacia la zona deseada de la corredera H &amp; E. Guarda la imagen generada. NOTA: Cualquiera de la pestaña &quot;Referencia de captura&quot; o pestaña &quot;diseccionar&quot; se puede utilizar para completar este paso. </li></ol> 3. Alinee Paño para Disección <ol><li> Haga clic en la opción &quot;diseccionar tejido&quot; en la pantalla principal. </li><li> Rellene el &quot;operador&quot;, &quot;número de la disección de la adhesión&quot;, &quot;el número de acceso de referencia&quot;, &quot;número de código de barras xScisor,&quot; &amp; #8220; disección número de lote fluida &quot;,&quot; Tamaño xScisor &quot;y&quot; Descripción &quot;en la pestaña&quot; Configuración &quot;. </li><li> Haga clic en la pestaña de &quot;encontrar el tejido&quot;. </li><li> Importación de imágenes de referencia previamente guardados. </li><li> Coloque una diapositiva FFPE sin manchas de 5 micras de espesor en el escenario. Mueva etapa a la misma zona que el representado en la imagen de referencia. Haga clic en la pestaña &quot;Insertar imagen&quot;. </li><li> Haga clic en la pestaña &quot;align&quot;. Usa el ratón y las flechas asociadas para alinear la imagen de referencia a la imagen sin mancha. </li></ol> 4. Anotar Slide <ol><li> Haga clic en la pestaña de &quot;anotar&quot;. </li><li> Utilice el ratón para dibujar un círculo alrededor del área deseada de la diapositiva que se microdissected. </li></ol> 5. Cargue consumible Mill Bit <ol><li> Rellene consumible poco molino con tampón deseado, aquí búfer PKD, tirando del émbolo hacia arriba y hacia abajo en un movimiento fluido varias veces. Asegúrese de excluir el aireburbujas. </li><li> Levante el eje Z por &quot;botón del eje Z&quot; presionando. </li><li> Cargar consumible poco molino en la máquina. Para ello, deslizando la fresa de consumibles en la parte superior de la máquina para que la línea blanca en las líneas de instrumentos con la línea de negro en la fresa de los consumibles. Pulse el botón de &quot;reinicio de aspiración&quot; para permitir que el émbolo sea bajado a la posición correcta. NOTA: Debe ser fácil para deslizar la fresa de los consumibles. Si no es así, asegúrese de que los indicadores estén alineados correctamente. </li><li> Bajo el eje Z pulsando de nuevo el botón &quot;eje Z&quot;. </li></ol> 6. Disección de tejidos (Figura 4) <ol><li> Abra la pestaña &quot;diseccionar&quot;. </li><li> Gire a velocidades de motor y aspiración a 1. </li><li> Marque la casilla &quot;espectáculo de seguimiento&quot;. Nota: Esto permite al usuario visualizar el área diseccionado durante el proceso de disección. </li><li> Una vez listo para diseccionar, continúe sosteniendo el botón &quot;participar&quot;, así como &quot;el aspirado y #8221; botón mientras se mueve la palanca de mando en una dirección en sentido antihorario para diseccionar el tejido. </li><li> Continuar para diseccionar en una dirección hacia la izquierda hasta el aspirado es pestaña &quot;lleno&quot; se vuelve rojo. </li></ol> 7. Vaciar y quitar consumible Mill Bit <ol><li> Coloque un tubo de microcentrífuga de 0,5 l bajo la punta de la fresa de los consumibles. </li><li> Varilla Press control &quot;aspiración&quot; rápidamente para expulsar la muestra en tubo de microcentrífuga. </li><li> Pulse con el aumento de la fuerza para expulsar usado fresa de consumible. </li><li> Enjuague fragmento de tejido tirando del émbolo hacia atrás. Empuje el émbolo hacia adelante para expresar la muestra restante en consumibles poco molino. El fragmento de tejido será ahora contenido dentro del tubo de microcentrífuga. </li></ol> 8. Muestra Lyse con proteinasa K digestión por un tratamiento térmico <ol><li> Añadir 70 l de TE pH 8,5 que contiene 5 g de proteinasa K a la muestra de tejido recuperada. </li><li> Coloque la muestra en programable calentador de agitador. </li><li> La digestión completa usando programable calentador-agitador a la siguiente configuración: 60 ˚ C durante 30 minutos a 1500 rpm; 82 ˚ C durante 15 min a 1500 rpm; y 25 ˚ C durante 1 minuto a 450 rpm. La muestra está ahora lista para aplicaciones posteriores. </li></ol>

<ol><li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in pathology.</a> J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).</li>
<li>Esposito, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+techniques%3A+laser+capture+microdissection--increasing+specificity+of+gene+expression+profiling+of+cancer+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens.</a> Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).</li>
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<li>Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+comparison+of+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+and+laboratory+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains.</a> J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).</li>
<li>Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis%3A+what+we+don%27t+know+can%2C+and+does%2C+hurt+us%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us.</a> Science. 328 (5980), 852-856 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodissection+of+fibrous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22AvanSciBio%22%5BJournal%5D)">Mesodissection of fibrous tissue.</a> AvanSciBio. , (2013).</li>
<li>Paige, C., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penitentiary+or+penthouse+condo%3A+the+tuberculous+granuloma+from+the+microbe%27s+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view.</a> Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).</li>
<li>Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granuloma+correlates+of+protection+against+tuberculosis+and+mechanisms+of+immune+modulation+by+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).</li>
<li>Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+immunopathology+and+mortality+despite+tissue+persistence+in+a+Mycobacterium+tuberculosis+mutant+lacking+alternative+sigma+factor%2C+SigH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).</li>
<li>Mehra, S., Kaushal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+reveals+extended+roles+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+stress+response+factor+sigmaH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH.</a> J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).</li>
<li>Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+transcriptional+profiles+and+the+physiological+states+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+an+extended+intracellular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection.</a> PLoS Pathog. 8 (6), (2012).</li>
<li>Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mycobacterium+tuberculosis+sigma+factor+sigmaB+is+required+for+full+response+to+cell+envelope+stress+and+hypoxia+in+vitro%2C+but+it+is+dispensable+for+in+vivo+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth.</a> J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).</li>
<li>Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+hypoxic+response+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li>
</ol>

Los autores dan a conocer que no hay intereses financieros en competencia.

Mesodissection es una técnica que puede aplicarse a la extracción de RNA a partir de diapositivas de las lesiones patológicas causadas por una amplia gama de patógenos. Es una necesidad que el usuario sigue el imagen y se alinea la imagen correctamente. Para lograr esto, el instrumento debe ser calibrado siguiendo las instrucciones en el software de imágenes. Cuando la disección, si la diapositiva y área de interés siendo diseccionado no se alinean, el usuario debe volver a calibrar el instrumento. Otro paso crítico en ...

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>.

Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Las muestras han sido tradicionalmente microdissected manualmente, ya sea todo el tejido o diapositivas utilizando una aguja y bisturí. Para ello se requiere una clara separación entre la sección de tejido de interés y los tejidos circundantes secciones 2. Con los avances actuales en la tecnología de perfil molecular, ha habido una creciente necesidad de evaluar tejido a nivel celular. Debido a las limitaciones de microdisección manual, incluyendo técnicas de LCM se establecieron para permitir una mayor precisión de aislamiento. Esta técnica permite al investigador para aislar poblaciones de células específicas de diversos tipos de células y de diapositivas, que luego se pueden utilizar para ensayos de aguas abajo, tales como perfiles de expresión génica. Aunque es muy eficaz para los ensayos posteriores, LCM no está exenta de limitaciones. En primer lugar, LCM es un proceso costoso y consume mucho tiempo. Además, debido a la naturaleza inestable de ARN, que es a menudo un reto para obtener ARN de alta calidad a partir de muestras LCM 2. Debido a la disadvantages de LCM, siguen siendo necesarios nuevos avances en la tecnología de microdisección para hacerlo más accesible a un mayor número de investigadores de una manera sensible asequible y tiempo. Uno de estos avances en la tecnología de microdisección ahora disponible es una técnica conocida como mesodissection. En esta técnica se utiliza una máquina para moler la sección de tejido anotada de interés y aspira en una fresa de consumibles 3. A continuación, esta muestra puede ser aspirado por un tubo de recogida y se utiliza para aplicaciones posteriores. Las ventajas de este sistema son que es significativamente menos costoso y sensible al tiempo. En nuestra experiencia, el sistema permite la disección de una sección de tejido granuloma pulmonar en diez minutos. Por otro lado, LCM tradicional requeriría probablemente horas para completar el proceso. El sistema permite al operador cargar un portaobjetos de referencia a utilizar como una comparación, así como herramienta para la anotación. Además se genera un informe esbozando ªárea e de la diapositiva que se ha diseccionado. Hay dos desventajas principales de mesodissection. Aunque es eficaz en la extracción de varias celdas, es difícil aislar una sola célula. Además, la precisión de la imagen generada no es tan clara como si el uso de otros microscopios de imagen. La tuberculosis (TB) es una importante causa de muerte de la enfermedad infecciosa de la humanidad en todo el mundo y es consecuencia de la infección por Mtb. En la mayoría de los individuos expuestos a aerosoles de Mtb, la infección está latente limitado. En por lo menos 10 millones de personas anualmente, da lugar a la enfermedad de la TB activa 4. Durante la infección latente, Mtb está contenida dentro de las lesiones pulmonares patológicos conocidos como granulomas. Por lo tanto, se ha argumentado que el resultado de la infección por Mtb se decide a nivel del granuloma 5. Aquí demostramos cómo mesodissection se puede utilizar para microdissect granulomas causados ​​por Mtb. Las diapositivas utilizadasson de FFPE tejido pulmonar de los macacos rhesus infectados. Para el propósito de esta demostración, vamos a diseccionar granulomas en su totalidad. También demuestran que el ARN se puede extraer de los tejidos recuperados. Esta técnica se puede aplicar a muestras de tejido de varios otros especímenes y luego se usa para una variedad de ensayos de aguas abajo.

<table><tbody><tr><td>MeSectr</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Mesodissector</td></tr><tr><td>400 nm xScisors</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Otros tamaños disponibles</td></tr><tr><td>THOR</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Calentador-agitador programable</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Kit de extracción FFPE&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq FFPE System&nbsp;</td><td>Nugen</td><td>7150</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

un nuevo enfoque para la recuperación microdissection<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; las transcripciones específicas de formalina parafina fijo embedded pulmón granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection se ha utilizado para el examen de los tejidos en el ADN, el ARN y los niveles de proteína durante más de una década. Microscopía de captura láser (LCM) es la técnica de microdisección más común usado hoy en día. En esta técnica, se utiliza un láser para fundir focalmente una membrana termoplástica que se superpone a una sección de tejido deshidratado 1. La sección de tejido de material compuesto entonces se levanta y se separa de la membrana. Aunque esta técnica puede utilizarse con éxito para el examen del tejido, que consume tiempo y es caro. Además, la finalización con éxito de los procedimientos que utilizan esta técnica requiere el uso de un láser, lo que limita su uso. Un nuevo enfoque de microdisección más asequible y práctica llamada mesodissection es una posible solución a las trampas de la LCM. Esta técnica emplea el sistema de MESO-1/MeSectr moler el tejido deseado a partir de una muestra de tejido montada deslizante, mientras que al mismo tiempo la dispensación y aspiración de fluido para recuperar la muestra de tejido deseada enun poco molino de consumible. Antes de que comience el proceso de disección, el usuario alinea la parafina fijado en formol incorporado (FFPE) deslice con hematoxilina y eosina manchado (H &amp; E) Tobogán de referencia. A partir de entonces, el operador anota el área de la disección deseada y procede a diseccionar el segmento apropiado. El programa genera una imagen archivada de la disección. La principal ventaja de mesodissection es la corta duración necesaria para diseccionar una diapositiva, teniendo un promedio de diez minutos de configurar para probar la generación en este experimento. Además, el sistema es significativamente más rentable y fácil de usar. Una ligera desventaja es que no es tan precisa como la microscopía de captura por láser. En este artículo se demuestra cómo mesodissection puede utilizarse para extraer el ARN a partir de diapositivas de granulomas FFPE causadas por Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

El protocolo mencionado se muestra cómo utilizar una nueva técnica mesodissection para extraer el ARN a partir de diapositivas de tejidos FFPE. La eficacia de este protocolo se muestra a través de diapositivas FFPE de granulomas pulmonares de NHP infectados con Mtb en varias fases infecciosas. Figuras 1-3 son imágenes del instrumento. Figura 4 representa cómo se produce el proceso de disección y la imagen resultante generada por el software. Tabla 1 muestra los...

Microdisección se ha empleado ampliamente para el examen de ADN, ARN, y proteínas dentro del tejido. Microscopía de captura láser (LCM) es el método más comúnmente utilizado, pero una nueva técnica de fresado, mesodissection, es recientemente disponible. Demostramos la extracción de RNA de mesodissected formalina parafina fijo diapositivas de tejidos embebidos de granulomas de Mycobacterium tuberculosis.

Un nuevo enfoque para la recuperación Microdissection<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Las transcripciones específicas de formalina parafina fijo Embedded pulmón granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

El objetivo general de este procedimiento es microdiseccionar tejido de cortes embebidos en parafina fijados y formados. Esto se logra primero creando una imagen de referencia a partir de un corte teñido representativo con hematoxilina y eosina. El segundo paso consiste en colocar un corte embebido en parafina fijado y formado no teñido correspondiente sobre la platina del instrumento y alinear el área de disección deseada con la imagen de referencia.A continuación, se anota el área de disección y se carga una punta desechable para macho con tampón, que luego se inserta en el instrumento. El paso final consiste en diseccionar el tejido anotado. En última instancia, se utiliza una combinación de amplificación y extracción de ARN y R-T-P-C-R para demostrar cómo el tejido diseccionado puede emplearse en el análisis global de la expresión génica de Mycobacterium tuberculosis dentro de los granulomas pulmonares procedentes de Reeses Maca infectados.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de investigación de la tuberculosis, como la identidad de los genes que *Mycobacterium tuberculosis* expresa en nichos in vivo similares al humano durante diferentes estados infectados de la tuberculosis. Además, estos datos ayudarán a explicar la regulación de los patógenos, así como las diferencias metabólicas y fisiológicas dentro de estos estados distintos de la enfermedad. Así se generarán objetivos específicos para fármacos.El instrumento de disección meso está equipado con un microscopio digital integrado con el software de imagenología de dos ID y un joystick para controlar las posiciones del escenario XY. Antes de comenzar este procedimiento, calibre el instrumento con el software de imagenología según se describe en el manuscrito adjunto para crear una imagen de referencia. Primero coloque un portaobjetos teñido con hematina y eosina o con H y E sobre el escenario y coloque una cubierta opaca encima del portaobjetos.Luego, dirija el instrumento moviendo la palanca hacia el área deseada del portaobjetos de h y d. Guarde la imagen generada utilizando la pestaña de captura de referencia para alinear el tejido que se va a disecar. Haga clic en la opción de disecar tejido en la pantalla principal.En la pestaña de configuración, complete el número de acceso del operador para la disección, el número de acceso de referencia exci o el número de código de barras, el fluido de disección, el número de lote, el tamaño exci y la descripción. Haga clic en la pestaña buscar tejido. Importe la imagen de referencia guardada previamente.Coloque un portaobjetos teñido con formalina y embebido en parafina, o FFPE, sin teñir. Deslice uno de cinco micrones de grosor sobre la platina. Mueva la platina hasta la misma zona que aparece en la imagen de referencia.Haga clic en la pestaña de alineación. Utilice el mouse y las flechas asociadas para alinear la imagen de referencia con la imagen sin teñir. Por último, anote la preparación haciendo clic en la pestaña de anotación.Utilice el ratón para dibujar un círculo alrededor del área deseada del portaobjetos que será microdiseccionada. Comience este procedimiento llenando el compartimento desechable con el tampón deseado; en este ejemplo, tampón PKD, tirando del émbolo hacia arriba y hacia abajo varias veces con un movimiento fluido. Asegúrese de excluir las burbujas de aire.Eleve el eje Z presionando el botón del eje Z. Cargue el accesorio macho descartable en el instrumento. Deslice el accesorio macho descartable hacia la parte superior de la máquina de modo que la línea blanca del instrumento quede alineada con la línea negra del accesorio macho descartable.Pulse el botón de reinicio de aspiración para permitir que el émbolo se baje a la posición correcta. Baje el eje Z pulsando nuevamente el botón del eje Z para comenzar la disección del tejido; primero, abra la pestaña de disección. A continuación, ajuste las velocidades del motor y de aspiración a uno.Marque la casilla mostrar seguimiento. Esto permite al usuario visualizar el área disecada durante el proceso de disección. Mantenga presionado el botón de activación junto con el botón de aspiración mientras mueve el joystick en dirección antihoraria.Continúe disecando en sentido antihorario hasta que el aspirado esté completo y la pestaña se vuelva roja. Para recolectar primero la muestra diseccionada, presione el botón del eje Z para elevar el eje, luego coloque un tubo microfuga de 0,5 microlitros debajo de la punta del accesorio macho desechable y presione rápidamente la varilla de control de aspiración para expulsar la muestra dentro del tubo microfuga. El fragmento de tejido quedará ahora contenido dentro del tubo microfuga.Presione la varilla de control de aspiración con mayor fuerza para expulsar el consumible usado del bit malo. El protocolo mostrado en este video se utilizó para microdiseccionar granulomas pulmonares de Resus Maca infectados con Mycobacterium tuberculosis o MTB en diversas etapas infecciosas. La imagen de referencia muestra un granuloma teñido con H y E proveniente de un Resus Maca con infección activa, con el área de interés a disecar delimitada en verde.La imagen central muestra el portaobjetos FFPE sin tinción correspondiente, de cinco micrones de espesor, antes de la disección. Las áreas se alinearon mediante el software, y la región correlacionada de interés se delinea en verde. La imagen de la derecha representa el mismo portaobjetos FFPE sin tinción tras la disección, con el área diseccionada representada en azul.Posteriormente, se extrajo el ARN de los granulomas diseccionados en la meso en cada estado infeccioso, y esta tabla muestra los resultados. La concentración de ARN se obtuvo utilizando un NanoDrop. Luego, el ARN se amplificó, purificó y transcribió a la inversa para obtener los resultados de RT-PCR en relación con la subunidad ribosomal 16 s, lo que confirma la presencia de la subunidad ribosomal 16 s de MTB y, por lo tanto, de MTB.En las muestras microdiseccionadas, se utilizó ADN genómico de la cepa CDC 1551 de MTB como estándar siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la extracción de ADN-ARN y proteínas, pueden realizarse para responder preguntas adicionales sobre genómica, transcriptómica y proteómica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo microdiseccionar muestras de FFPE de granulomas pulmonares.Este procedimiento no se limita únicamente a los granulomas pulmonares infectados por MTB, sino que también puede aplicarse a lesiones causadas por otros patógenos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La infección por tuberculosis humana es un proceso complejo, difícil de modelar in vitro. Aquí describimos un nuevo modelo de tejido pulmonar humano en 3D que recapitula la dinámica que ocurre durante la infección, incluida la migración de células inmunitarias y la formación temprana de granuloma en un entorno fisiológico.

Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infección

Este protocolo modificado de extracción mejora de ARN y ADN rendimientos de las regiones seleccionadas, más precisamente de interés en los bloques de tejido histopatológicos.

Preparación de núcleos de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina para ambos RNA y DNA Extraction

Aquí, describimos un protocolo usando el microdissection de la captura del laser juntada con el análisis por LC/MS para cuantificar espacialmente la distribución de drogas dentro de granulomas de la tuberculosis pulmonar. El enfoque tiene amplia aplicabilidad para cuantificar concentraciones de medicamentos en los tejidos de alto detalle espacial.

Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)

Describimos una prueba de ensayo de carga bacteriana molecular de tuberculosis realizada después de la inactivación térmica del esputo. La inactivación del calor hace que las muestras de esputo no sean infecciosas y evita la necesidad de laboratorios de nivel 3 de contención para las pruebas moleculares de la tuberculosis.

Un ensayo de carga bacteriana molecular de la tuberculosis (TB-MBLA)

Hemos desarrollado una técnica de procesamiento tisular que utiliza un vibratomo y tejido pulmonar incluido en agarosa para generar secciones pulmonares, lo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución de la arquitectura pulmonar. Empleamos la tinción de inmunofluorescencia para observar la expresión espacial de proteínas utilizando marcadores estructurales pulmonares específicos.

Seccionamiento automatizado de vibratomo de tejido pulmonar incluido en agarosa para obtener imágenes de fluorescencia multiplex

Presentamos un método para un modelo de patogénesis fúngica que preserva la posición natural de las esporas de hongos en las vías respiratorias pulmonares para su análisis mediante microscopía fluorescente.

Método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias

La implementación de una técnica de fotoirradiación versátil y de bajo coste con el método manual IBEX permite obtener una imagen óptima del tejido humano con una importante autofluorescencia nativa. Este protocolo detalla cómo obtener imágenes multiplexadas de portaobjetos completos a partir de muestras clínicas archivadas utilizando un microscopio invertido, reactivos ampliamente disponibles y software de código abierto para la alineación y el procesamiento de imágenes.

El flujo de trabajo optimizado para el blanqueo iterativo amplía la obtención de imágenes de multiplexidad de muestras clínicas altamente autofluorescentes

Este protocolo describe métodos para cultivar, manipular y analizar CAF murinos, incluidos ensayos funcionales in vitro/in vivo , transcriptómica y análisis computacional. Además, describe una plataforma basada en la web desarrollada para analizar los transcriptomas disponibles públicamente de los componentes estromales y epiteliales microdisecados de captura láser de una colección de tumores de cáncer de mama humanos.

Fibroblastos asociados al cáncer de tumores mamarios de ratón como herramientas para estudios moleculares y computacionales

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Este protocolo describe un método para aislar ARN de regiones histológicas definidas de tejido hepático de ratón incrustado en compuesto de paraformaldehído y compuesto de Temperatura Óptima de Corte mediante microdissección por captura láser, permitiendo un análisis dirigido de expresión génica posterior.

Microdisección por captura láser de tejido hepático de ratón fijado con paraformaldehído para análisis de ARN

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprende la técnica de mesodisección para extraer ARN de tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina. Este método permite analizar la expresión génica de Mycobacterium tuberculosis en granulomas pulmonares.

Un nuevo enfoque para la recuperación Microdissection Mycobacterium tuberculosis Las transcripciones específicas de formalina parafina fijo Embedded pulmón granulomas (Video) | JoVE Journal

Un nuevo enfoque para la recuperación Microdissection

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