Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica

El objetivo del siguiente experimento consiste en generar una réplica de carbono y platino de materiales biológicos u otros para su examen mediante microscopía electrónica de transmisión. Para lograrlo, las muestras preparadas como réplicas dobles y simples se someten a velocidades de congelación ultrarrápidas para limitar la formación de cristales de hielo. Luego, la muestra congelada se fractura mediante manipulación remota a temperaturas criogénicas de nitrógeno líquido y bajo alto vacío, lo que divide la membrana a través de la bicapa lipídica, produciendo una cara extracelular y una cara próxima al aspecto citoplasmático.

Como paso adicional opcional. Las características subyacentes pueden revelarse cuando el agua se elimina por sublimación de la superficie de la muestra fracturada al colocar el brazo del micrótomo refrigerado sobre la platina de la muestra para crear un gradiente de temperatura, lo que provoca que el agua sublime desde la superficie. A continuación, se genera una réplica mediante la evaporación de carbono y platino sobre la superficie fracturada.

El espécimen original se digiere a partir de la réplica, que se recupera sobre una rejilla para microscopía electrónica de transmisión. En última instancia, la fractura por congelación y el grabado por congelación se utilizan para mostrar detalles estructurales tridimensionales de membranas celulares, arreglos moleculares y nanomateriales al examinarlos mediante microscopía electrónica de transmisión. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el examen de secciones ultradelgadas, es que los objetos de interés pueden observarse en tres dimensiones con resolución de microscopía electrónica.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología celular y molecular y la nanotecnología, como las características dimensionales y estructurales de las membranas celulares y la organización de matrices moleculares y de nanomateriales. Tuve por primera vez la idea de este método cuando reconocí que se habían realizado estudios similares en protistas eucariotas con descubrimientos importantes, pero que se había prestado poca atención a temas relevantes en la salud humana. Comience este procedimiento con la preparación de especímenes biológ游戏副本 para fractura por congelación y borde congelado, como se describe en el protocolo del texto.

Seleccione portaobjetos de oro o cobre del tamaño y forma adecuados para la muestra que se va a procesar, utilizando pinzas de grado fino y/o agujas de jeringa de calibre pequeño. Coloque fragmentos pequeños de la muestra sobre la parte superior de un portaobjeto metálico. Reduzca el contenido líquido de la muestra hasta una consistencia pegajosa, ligeramente similar a la de una cola, retirando el líquido desde el borde del portaobjeto con papel de filtro para réplicas individuales.

Utilice agujas de jeringa de pequeño calibre para crear un montículo de tejido sobre el soporte para réplicas dobles. Invierta otro soporte, colóquelo exactamente sobre el soporte y colóquelo ligeramente sobre la superficie de la muestra. Formando un sándwich.

No presione la muestra para sacarla de entre los dos soportes. A continuación, llene dos recipientes duales aislados con nitrógeno líquido. El primer recipiente aloja un poste metálico que contiene un pequeño pozo, el cual se utiliza para licuar un pequeño volumen de gas propano procedente de un cilindro comercialmente disponible.

El segundo recipiente es un depósito de almacenamiento con compartimentos para mantener brevemente especímenes congelados bajo nitrógeno líquido. Utilice propano únicamente en una campana química certificada para dicho fin. Tenga cuidado de evitar fuentes de ignición accidentales, use prendas protectoras contra temperaturas más bajas y mantenga una ventilación adecuada, ya que el propano es explosivo.

Puede causar lesiones por congelación al contacto y es un agente asfixiante. Con la boquilla del cilindro colocada en el propano, abra bien la válvula del cilindro y permita que el gas fluya hacia el pocillo del primer recipiente, donde se licuará lo más rápidamente posible. Tome el portaobjetos con pinzas de grado fino y sumérjalo en el gas licuado del primer recipiente durante varios segundos.

Luego, transfiera rápidamente al segundo recipiente de retención con nitrógeno líquido. Una vez que las muestras estén congeladas, guárdelas bajo nitrógeno líquido hasta que estén listas para transferirlas a la unidad de fractura por congelación. Cargue los portamuestras dorados en un portamuestras o dispositivo de sujeción tipo cuaderno para réplica doble, bajo nitrógeno líquido, y manténgalos allí hasta que estén listos para colocarlos en la cámara de muestras.

Cuando la cámara haya alcanzado alto vacío y la etapa haya alcanzado la temperatura de nitrógeno líquido, apague la bomba, abra la cámara y coloque rápidamente los portaobjetos con las muestras montadas sobre la mesa de muestras. Luego encienda la bomba para restablecer el alto vacío y utilice los controles electrónicos de temperatura de la etapa y del brazo para ajustar la temperatura de la mesa de muestras a menos 100 grados Celsius. También dirija nitrógeno líquido hacia el brazo del micrótomo para llevarlo a la temperatura de nitrógeno líquido.

Una vez alcanzado el vacío alto, establezca una temperatura de la etapa de menos 100 grados Celsius y, con el brazo del micrótomo a la temperatura del nitrógeno líquido, abra remotamente el portamuestras de réplica doble, fracturando así las muestras sobre los soportes. Como paso opcional adicional, las muestras pueden ser grabadas para revelar las estructuras subyacentes tras la fractura. Para realizar el grabado, utilice una cuchilla de afeitar mantenida en una pinza sobre el brazo del micrótomo para raspar la superficie de las muestras. Coloque el brazo frío del micrótomo sobre las superficies fracturadas durante uno o varios minutos para sublimar el agua y revelar así las verdaderas superficies celulares, la matriz extracelular y/o los ensamblajes moleculares.

A continuación, active el cañón de electrones o de resistencia de platino carbonado y permita que evapore una capa delgada de platino carbonado sobre la superficie fracturada desde un ángulo de 30 a 45 grados. Esto generalmente requiere aproximadamente de 15 a 20 segundos; active el cañón de electrones o de resistencia de carbono de la misma manera y evapore una capa delgada de carbono sobre la superficie de la muestra fracturada directamente desde arriba, a 90 grados, para dar soporte a la réplica. Esto también generalmente requiere aproximadamente de 15 a 20 segundos tras completar la replicación, la sombra y la estabilización con carbono.

Apague la bomba de vacío y la cámara, y retire el soporte de la muestra del instrumento. Utilizando un par de pinzas de grado fino, retire cada portaobjetos de oro con muestra del sujetador de libro de réplica doble y permita que se descongele durante varios segundos antes de bajar suavemente el portaobjetos sobre una superficie de agua en una placa de pocillos. Manipule las réplicas utilizando ya sea un lazo de alambre fino o una rejilla convencional de cobre para microscopio electrónico sostenida con pinzas de grado fino, y transfiéralas a otra placa de pocillos que contenga dicromato de sodio al 5% en ácido sulfúrico al 50% durante una a varias horas. Este baño digiere el material biológico real de la réplica.

Una vez finalizada la digestión, transfiera la réplica de nuevo a una superficie de agua limpia y recupérela sobre una rejilla estándar de cobre para microscopía electrónica. Almacene las rejillas portadoras de réplicas en cajas para rejillas disponibles comercialmente, donde permanecerán estables durante años. Con manipulación cuidadosa o para el examen ultraestructural de réplicas por fractura por congelación y ataque, observe las réplicas en un microscopio electrónico de transmisión a un voltaje de aceleración, típicamente entre 50 y 80 kilovoltios.

Registre las imágenes relevantes en una película estándar de microscopía electrónica de transmisión (TEM) o con una cámara digital de alta resolución presente en la membrana celular en la base de cada cilium y flagelo eucariota. El cilium y el flagelo presentan un arreglo de partículas asociadas a la membrana organizadas en hebras ENC que rodean el eje del cilium, conocido como collar ciliar. Arreglos especializados de partículas de membrana aparecen en el borde luminal de las células epiteliales que experimentan ciliogénesis.

Estas matrices de partículas representan collares ciliares incipientes, que se ubican en la base de los cilios emergentes y maduros. Diversos estudios de fractura por congelación en epitelios revelan una organización sofisticada de estructuras anastomosadas de cordones y surcos que rodean el aspecto apical de los bordes basolaterales. La fractura a través de las membranas celulares epiteliales revela caras de fractura plasmáticas de uniones estrechas que aparecen como cordones, mientras que las caras de fractura extracelulares exhiben surcos complementarios.

Las uniones en hendidura aparecen en preparaciones de fractura por congelación de una variedad de tejidos y se representan mediante matrices densas de partículas en las caras de fractura plasmáticas y fosas complementarias en la fractura extracelular. Las caras mostradas aquí son un ejemplo de congelación rápida con grabado profundo y sombreado rotatorio. La célula epitelial ha sido fracturada a través del citoplasma y una cara de fractura plasmática es evidente detrás de las puntas de flecha que se observan.

Una verdadera superficie celular revelada mediante el ataque subsiguiente una vez dominado. Esta técnica puede realizarse en un ciclo que dura aproximadamente tres horas y produce de uno a tres especímenes si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los pasos individuales son muy interdependientes y que un error en un paso puede hacer que el resultado sea inadecuado para el examen y la evaluación tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular y molecular exploraran cómo las mutaciones genéticas confieren anomalías estructurales en las células, de maneras que provocan condiciones patológicas y enfermedades.