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El objetivo general de este protocolo es caracterizar los efectos de las proteínas del fluido seminal en el comportamiento de puesta de huevos de una especie hermafrodita simultánea. Esto se logra primero aislando a los individuos de un cultivo de laboratorio estandarizado, seguido de la disección de los órganos diana. En segundo lugar, se recogen los espermatozoides y se elabora una solución de tratamiento.

Después de esto, los caracoles son inseminados artificialmente. Luego se ponen en un ensayo biográfico. En condiciones estándar, las masas de huevos se recogen, se escanean y se colocan en BS individuales para eclosionar.

Después de unas semanas, las crías se cuentan y escanean, después de lo cual todas las imágenes se pueden analizar utilizando software gratuito. Este protocolo puede ayudar a responder preguntas sobre los procesos de selección sexual que están mediados por las proteínas del líquido seminal. Debido a que aquí estamos viendo hermafroditas simultáneos, también podemos abordar si estos procesos funcionan de manera similar o diferente como lo hacen en especies sexuales separadas.

Para este protocolo, utilizamos el gran IL in les, que mantenemos en la Universidad VU de Ámsterdam. Utilizamos esta especie para estudiar cuestiones sobre la selección sexual y la reproducción. En Hermaphroditas, debido a su tamaño corporal relativamente grande, es experimentalmente muy accesible.

Además, debido a que se utiliza en muchas disciplinas biológicas diferentes como especie modelo, sabemos mucho sobre la biología básica de estos animales. Mi nombre es Yumi. Soy doctor en el Departamento de Ciencias Ecológicas.

En plena universidad, demostraré los siguientes protocolos. Empecemos. Para realizar una biosa confiable, se usa más comúnmente un cultivo de laboratorio para excluir las variables que acechan.

El agua con bajo contenido de cobre se mantiene a 20 grados centígrados y el ciclo de luz y oscuridad es de 12 por 12 horas. En la Universidad VU, el cultivo de laboratorio se mantiene en tanques de instalaciones de cría con intercambio continuo de agua. En condiciones normales, los caracoles adultos se alimentan con lechuga a libido y se separan según su clase de edad.

Una vez que los caracoles se retiren del criadero, se considerarán en uso y no podrán ser devueltos a los tanques de cría. Antes de comenzar el procedimiento, necesitará un microscopio estereoscópico, una placa de disección con alfileres, tijeras quirúrgicas pequeñas, fórceps, una jeringa llena de solución de cloruro de magnesio y algunas toallas de papel para sacrificar al caracol, penetrar el pie con la aguja de inyección en un ángulo de 45 grados y aplicar presión suavemente de manera continua hasta que el caracol se relaje y permanezca extendido. Retire la aguja de inyección y asegúrese de que el caracol esté sacrificado.

A continuación, tome las pinzas y retire con cuidado la cáscara. Siguiendo la curvatura hasta la mitad, raspe suavemente el músculo ular de la cáscara. A continuación, retuerce suavemente el caracol para sacarlo de su concha siguiendo la dirección sinuosa de la concha.

Ahora el caracol ha sido retirado de su caparazón y el caparazón se puede desechar. Posteriormente, coloque el caracol en la placa de disección y coloque un alfiler en el extremo posterior del pie. A continuación, coloque un alfiler a través de la cabeza.

Pon un poco de tensión en el caracol y coloca el alfiler en el plato. Ahora el caracol está listo para la disección. Encienda la luz del microscopio estereoscópico y ajuste el microscopio.

Antes de realizar la primera incisión, es importante localizar el por. Esto será más adelante un punto de referencia. Haga una primera incisión justo debajo del borde del manto y corte hacia el porto femenino.

Haz un giro alrededor del poro bonno hacia la cabeza. Asegúrese de cortar solo la piel y no golpear ningún órgano y corte en línea recta. Para este estudio, diseccionaremos la glándula prostática y las vesículas seminales para el líquido seminal y los espermatozoides, respectivamente.

Tenga en cuenta que para almacenar esperma y líquido seminal completo, los caracoles deben aislarse durante una semana y alimentarse ad libido. La disección es la misma que se explicó anteriormente. Las vesículas seminales se encuentran en la parte posterior del animal.

A continuación, se suspenderá la glándula prostática en solución salina y se pondrá hielo. Después. Estos se mezclarán con las soluciones de tratamiento.

Antes de la inyección intravaginal, los espermatozoides recolectados se agregarán al líquido seminal o a las proteínas individuales en una dosis relevante. Para esta técnica de inseminación artificial, necesitará una jeringa de un mililitro que contenga la solución de prueba, coloque una aguja de inyección en las jeringas, asegurándose de que no haya burbujas pegadas en las jeringas para la inyección, use el tubo de silicona con cuidado. Deslice el tubo de silicona sobre la aguja de inyección.

Asegúrese de que el tubo esté perforado y retire el aire del tubo. Antes de la inyección, el caracol debe ser sedado. Esto seguirá el mismo protocolo que en el capítulo dos.

Al caracol se le administrará una dosis de dos a tres mililitros de 50 micro molares de cloruro de magnesio. Cuando el caracol esté debidamente sedado y relajado, colócalo en el molde para mantenerlo en una posición estable. A continuación, agarre el extremo del tubo de silicona con un par de pinzas finas y empújelo suavemente en el tubo femenino.

A continuación, aplique suavemente presión sobre la jeringa e inyecte con cuidado el volumen prescrito de la solución de prueba. Espere medio minuto para que la presión en el tubo se extienda al órgano femenino. Después de esto, retire con cuidado el tubo y coloque el caracol en su propio recipiente específico.

Después de todo, los caracoles han sido inseminados artificialmente. Pueden ser transportados a sus tanques experimentales y se puede iniciar el bioensayo bios. Los caracoles se recuperarán de la sedación después de unas horas. Bioensayos.

Para la selección sexual, los experimentos normalmente toman dos semanas antes de que se pueda iniciar la biosa. Es importante poner a todas las personas en sus propios contenedores y etiquetarlos. A continuación, mide la longitud de la concha de cada caracol.

Este es un buen indicador de su tamaño, que puede tener un efecto en el comportamiento sexual. Después de esto, los caracoles se colocan en un tanque experimental. Este tanque tiene las mismas condiciones estándar que la instalación de cría.

Como se discutió en el capítulo uno, es importante colocar los recipientes en la orientación correcta para que las aberturas sigan el flujo de agua en el tanque. Durante los bioensayos, los caracoles deben alimentarse regularmente. Una cantidad estándar de lechuga Los discos de lechuga se cortan con una perforadora de metal.

Una dosis suficiente es de dos discos cada dos días. Con la especie modelo, lumia stauss, los caracoles deben ser revisados para detectar masas de huevos cada dos días. Estas masas de huevos se recogerán para las mediciones.

Para el escaneo de los huevos, necesitará una computadora portátil que contenga el controlador del escáner, un escáner de cama plana, una escala milimétrica estándar, una cuchara de transferencia de masa de huevos y placas de vidrio para colocar encima de las masas de huevos. Primero, tome la cuchara y raspe las masas de huevos de las paredes del recipiente. Las masas de huevos que son opacas acaban de ser puestas y no se pueden usar.

En este evento de medición, coloque las masas de huevos en los platos de transferencia y repita estos pasos hasta que los platos estén llenos. Después de esto, coloque las masas de huevos en las baldosas de vidrio en el mismo orden que los platos de transferencia. Las masas de huevos se pegarán a la baldosa de vidrio, la voltearán y la colocarán con cuidado en el escáner plano justo debajo de la báscula.

A continuación, aplique presión sobre los platos para aplastar las masas de huevos. Esto incluso ahora agregará todos los óvulos, por lo que se escanearán igual de bien. Antes de escanear, se recomienda ajustar la configuración para obtener el mejor resultado.

Para el escaneo, es importante ajustar la resolución al máximo para hacer una vista previa del escaneo para posteriormente recortar el área de trabajo, y finalmente, ajustar el brillo y el contraste antes de realizar el escaneo final. Después del escaneo, las masas de huevos se colocarán en sus propios viales etiquetados para madurar y eclosionar. Estos viales tienen su agua renovada cada dos días para mantener el oxígeno en un nivel adecuado.

A medida que más caracoles eclosionan, se deben usar diferentes técnicas para refrescar el agua. Lo mejor es verter o desbordar al principio y luego succionar el agua con una pipeta de imagen abierta JA programa de hoja de cálculo. Para grabar primero los datos y una foto desde dentro de la imagen J, utilice la herramienta de zoom Para navegar a la escala milimétrica.

Acércate y ajusta la ventana para que un milímetro llene la pantalla. Dibuje una línea con la herramienta de línea entre las dos líneas del indicador. A continuación, navegue hasta analizar y, a continuación, establezca la escala.

En el menú emergente, verás que la longitud medida ajusta la distancia conocida a uno y a la unidad de a milímetros. Marque la casilla global y cierre la ventana. Ahora que se ha establecido la escala, podemos acercarnos a las primeras masas de huevos Hasta un 800%Utilice la herramienta elíptica para dibujar la circunferencia de los huevos.

Presione D para dibujar la circunferencia. Esto ayudará a evitar que se mida el mismo huevo dos veces. Presione M para medir la circunferencia.

Aparecerá una ventana emergente después de que se hayan recopilado suficientes datos. La ventana de datos se puede guardar como un archivo de Excel. Los datos también se pueden copiar directamente en una hoja de cálculo.

Si las medidas preferidas no se muestran en la ventana emergente, esto se puede ajustar y analizar. Establecer mediciones, contar los huevos individuales por masas de huevos, también se puede realizar con la ayuda del complemento de contador de celdas. Navega hasta los plugins.

A continuación, analice y seleccione el contador de celdas. Aparecerá la ventana del contador de celdas. Marque la casilla mantener original y presione inicializar.

Ha aparecido una nueva ventana de contador. Seleccione la herramienta cruz aquí de la barra de herramientas. A continuación, seleccione un tipo de contador en el menú de contador de celdas.

Al hacer clic en la ventana del contador de celdas, se contarán los huevos. El recuento total se puede encontrar junto al tipo de contador en el menú del contador de celdas. Se pueden contar múltiples masas de huevos con el contador de células.

Los tipos de contadores se pueden agregar y eliminar si se desea, este número debe copiarse manualmente a una hoja de cálculo o presionar los resultados, y aparecerá una ventana. Mostrando todos los resultados. Con este método, hemos demostrado cómo recolectar proteínas del líquido seminal, cómo probarlas de una manera significativa.

Hemos demostrado esto utilizando el extracto completo de la glándula prostática, pero, por supuesto, las proteínas individuales del líquido seminal se pueden analizar de la misma manera. Además, es posible observar otros procesos y la puesta de huevos. Los resultados de nuestros experimentos han demostrado que hay una sola proteína del líquido seminal llamada estatina avios que media una reducción en el carril de los huevos.

Además, encontramos que la transferencia de líquido seminal aumenta el tamaño o los postes. La estatina es la primera proteína fluida seminal completamente caracterizada en un hermafrodita simultáneo. Si bien los efectos del líquido seminal a menudo se han reportado en especies con sexos separados, nuestros resultados destacan que los fluidos seminales son igualmente importantes en los hermafroditas.