Name: Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Aprende a caracterizar efectos mediados por receptores GABA B en interneuronas parvalbúminas del hipocampo usando grabaciones patch-clamp de célula completa. Este método permite clasificar morfológicamente las neuronas inhibidoras.

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Los autores desean agradecer a Ina Wolter por su excelente asistencia técnica. VGAT-Venus ratas transgénicas fueron generadas por los Dres. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi y Y. Kawaguchi en el Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas, Okazaki, Japón, usando pCS2-Venus proporcionada por el Dr. A. Miyawaki.

Declaración de Ética: Todos los procedimientos y de los animales de mantenimiento se realizaron de conformidad con las directrices institucionales, la Ley Alemana de Bienestar Animal, el Consejo Europeo de la Directiva 86/609 / CEE relativa a la protección de los animales, y las directrices de las autoridades locales (Berlín, T-0215/11 ) 1 Preparación de rebanadas de hipocampo aguda- <ol><li> Tome una rata transgénica (17 a 24 días de edad), que expresa la proteína Venus / YFP fluorescente bajo el promotor VGAT, que las etiquetas de la mayoría de las interneuronas inhibitorias corticales 13. Decapita a la rata. Rápidamente diseccionar el cerebro (&lt;40 seg) en semicongelado, carbogenated (95% O 2/5% CO 2) fluido a base de sacarosa artificial cefalorraquídeo (sacarosa-ACSF, Figura 1A). </li><li> Evaluar el cerebro de rata diseccionado para la fluorescencia Venus / YFP con una lámpara de 505 nm y filtro de emisión de 515 LED, montado en un par de gafas. </li><li> Retire la tercera frontal de la corteza y Cerebellum; a continuación, separar los hemisferios, todos con un bisturí. Retire la superficie dorsal de la corteza para proporcionar una superficie plana para pegar el cerebro hacia abajo, como se ha descrito previamente 14. </li><li> Cortar rodajas transversales (300 m) de la formación del hipocampo en un vibratome, los hemisferios deben estar rodeados con semicongelado, carbogenated sacarosa-ACSF (Figura 1B) 14. Retire regiones adicionales de rostral corteza, mesencéfalo y el tronco cerebral. Transferir cada rebanada a una cámara de retención sumergida ACSF que contiene sacarosa, que se carbogenated y se calentó a 35 ° C. </li><li> Deja las rebanadas de recuperar a 35 º C durante 30 minutos desde el momento de la última rebanada de entrar en la ACSF calentado. Haga esto con el fin de reactivar los procesos metabólicos y facilitar el resellado de los procesos neuronales cortadas. A continuación, traslado a la temperatura ambiente para el almacenamiento (Figura 1C). </li></ol> 2. Fabricación y Llenado de pipetas de registro <ol><li> Pupipetas de parche ll de capilares de vidrio, de modo que se consigue una resistencia de la pipeta de 2-4 mW cuando se llena con filtrado (filtro de jeringa, tamaño de poro: 0,2 micras) solución intracelular contenía 0,1% de biocitina (para el etiquetado intracelular). Mantenga la solución intracelular enfriado en hielo para evitar la degradación de sus componentes. </li><li> Llenar pipetas de parche para la identificación de las corrientes postsinápticas con una solución que contiene un bajo Cl fisiológicamente relevante - concentración (E R (Cl) = -61 mV; véase la lista de solución). </li><li> Para grabaciones pareadas para identificar las respuestas mediadas por el receptor presináptica, llenar pipetas de parche con solución intracelular con Ca 2 + de la capacidad tampón de baja para evitar la interferencia con la liberación del transmisor presinápticamente, así como 4 veces mayor concentración de Cl - (E R (Cl) = -20 mV) para mejorar la relación señal-ruido de IPSCs observados 5 que permiten una evaluación precisa de resp farmacológicaonsiveness. Tenga en cuenta que el cambio de concentración de Cl - puede alterar la cinética de IPSC 15. </li></ol> 3. Whole Cell Patch-clamp grabación de FS-ins <ol><li> Carbogenate la ACSF y se alimentan a través del sistema de perfusión a la cámara de grabación, por medio de una bomba peristáltica (que también elimina ACSF de la cámara de registro a través de una línea de succión, la Figura 2A). Encienda todos los equipos de la configuración en la preparación para la grabación. </li><li> Transferir una rebanada a la cámara de registro y mantenerlo en su lugar con un anillo de platino encadenan con fibras individuales de seda. Coloque la rebanada de modo que el estrato piramidal (str.) De CA1 corre verticalmente a través del campo de visión, permitiendo el acceso con 2 pipetas tanto a la str. radiatum y str. oriens simultáneamente (Figuras 2C y 4A). </li><li> Coloque la cámara en la configuración e iniciar la perfusión de carbogenated y caliente (32-34 º C) Una grabaciónCSF a un caudal de 5-10 ml / min. </li><li> Evaluar la calidad rebanada bajo la óptica DIC-IR a 40X aumento del objetivo, y visualizar con una cámara CCD se ve en una pantalla. Supongamos buena calidad rebanada si un gran número de células piramidales CA1, moderadamente contrastados redondos (CA1 PC) se puede ver en str. pyramidale a profundidades de 20-30 micras por debajo de una superficie lisa y ligeramente de cráteres (Figura 2C). Rebanadas de mala calidad contienen un gran número de muy contrastados, células reducidas o inflamadas, con una superficie de loncha desigual. </li><li> Identificar FS putativos interneuronas bajo iluminación de epifluorescencia que las que expresan Venus / YFP (Figura 2B), con gran somata multipolar en o cerca de la str. pyramidale. Seleccione las celdas razonablemente profundo dentro de la rebanada (50-100 m, Figura 2C) con el fin de preservar mejor su integridad morfológica. </li><li> Monte el electrodo de registro en el soporte de la pipeta en el cabezal de la platina; a continuación, la aplicaciónLY una presión positiva baja (20-30 mBar) a través de la línea de tubo. Bajar la pipeta a la superficie de la rodaja, ligeramente desplazada del centro de la neurona seleccionada. </li><li> Obtener configuración de la grabación de células enteras como se describió previamente 14,16 y ver también las figuras 2D y 2E: <ol><li> Haz objetivo a una celda: Aumenta la presión a 70-80 mbar y bajar rápidamente la pipeta a través de la rebanada justo por encima del soma de la celda seleccionada (Figura 2D, arriba). </li><li> Acércate a la célula: Pulse la pipeta contra la membrana de la célula para producir un &quot;hoyuelo&quot; en él (Figura 2D, arriba). Realice este paso con rapidez, a fin de evitar el etiquetado biocitina de las células vecinas. </li><li> Crear un sello giga-ohm: Suelte la presión y al mismo tiempo aplicar un comando de 20 mV de tensión a la pipeta. Un sello de giga-ohm (1-50 GΩ; Figura 2D, abajo y la figura 2E medio) typicaliado se desarrolla rápidamente. Una vez sellados, aplicar el potencial de membrana en reposo esperado (típicamente entre -70 y -60 mV) como un comando de voltaje. </li><li> Romper a través del parche: Una vez sellada, rompa el parche de membrana con un breve pulso de presión negativa; consiguiendo de esta manera la configuración de célula completa (Figura 2E, parte inferior). </li></ol></li><li> Compensar la capacitancia de célula entera y resistencia en serie (R S). R s es normalmente 5-20 mW y estable durante un máximo de 120 min. Abandonar las células si el potencial de membrana (V M) en caso de ruptura a través de más despolarizado que -50 mV; R S es inicialmente mayor que 30 mW; o cambios R S por más de 20% en el transcurso de la grabación. </li><li> Identificar FS-ins por su respuesta (en el modo de corriente-clamp) para una familia de hiper a despolarizante pulsos de corriente (-250 a 250 pA, Figura 2F, arriba). FS-ins relativamente han despolarizado V M (normalmente -50 to -60 mV), la membrana corta constante de tiempo (&lt;20 ms) y responder a un 500 pA despolarizante de inyección de corriente con un tren de potenciales de acción (AP) a frecuencias&gt; 100 Hz 11 (Figura 2F, parte inferior), que son notablemente diferentes a las de CA1 PC (Figura 2F, medio). </li></ol> 4. extracelular estimulación eléctrica para evocar respuestas mediadas por R GABA B <ol><li> Para observar las respuestas evocadas sinápticamente, colocar un electrodo de estimulación extracelular (un parche pipeta llena de NaCl 2 M; Resistencia: 0,1-0,3 mW) en el corte en la frontera de str. radiatum y str. -lacunosum moleculare. Coloque el electrodo de 200-300 micras lateral a la soma para prevenir la estimulación eléctrica directa de la célula y minimizar los artefactos de estimulación (figura 3A). </li><li> Una vez que el electrodo de estimulación se coloca, obtener la grabación de células enteras dela célula y elegido evaluar el fenotipo fisiológico en modo de corriente-clamp como en la sección 3.9 (Figura 3B). </li><li> Con la neurona registrada en de fijación de voltaje (V M -65 mV), entregar la estimulación eléctrica de los axones presinápticos a 50 V (~ 500 μA estímulo eficaz) cada 20 segundos, utilizando un aislado estimulador de voltaje constante. Utilice solo los estímulos (100 microsegundos de duración, la figura 3C, la parte superior) para observar GABA B R IPSCs mediadas, y intercalar con los trenes de múltiples estímulos (a 200 Hz) para producir una mayor liberación del transmisor. </li><li> Bath aplica ionotrópicos antagonistas de los receptores de glutamato (AMPA del receptor: DNQX [10 M]; receptor NMDA: d-AP5 [50 M]) para revelar el aislado monosináptico IPSC (Figura 3C, media alta). Además de aislar el IPSC mediada R GABA B con la aplicación de un bloqueador de GABA A R (gabazine [10 M]; Figura 3C l medioower). </li><li> Confirmar la resultante lenta corriente de salida (Figura 3C inferior, expandido) como se GABA B R-mediada por la posterior aplicación de CGP-55845 [5 M] (Figura 3C inferior, sustentada en gris) </li></ol> 5. Emparejados Grabaciones de sinápticamente acoplados FS-IN y CA1 PCs <ol><li> Evaluar el control presináptica mediada por R GABA B de la transmisión sináptica inhibitoria con grabaciones simultáneas, realizadas entre sinápticamente acoplados pares IN y PC como se describe a continuación. </li><li> En primer lugar, establecer una grabación de células enteras de un interneuron presináptica (como en la sección 3) y confirmar el fenotipo FS (Figura 4A). </li><li> Entonces parchear un CA1 PC vecino (20-100 micras distancia, la figura 4A) y aplicar breve supraumbral despolarizante pulsos de corriente (1 ms de duración, 1-5 nA amplitud) a la presináptica IN (celebrada en modo de corriente-clamp) para obtener puntos de acceso. Si un co sinápticaConexion está presente, los puntos de acceso en el resultado IN en IPSCs en el PC CA1, que se celebró en el voltaje-clamp (compensar R S hasta aproximadamente el 80%). </li><li> Si es necesario, llene un nuevo electrodo de registro y grabar desde otros PCs CA1 hasta que se encuentre una conexión. </li><li> Una vez que se establece una conexión, provocar pares de puntos de acceso en el presináptica FS-IN para evaluar tanto la respuesta sináptica unitaria y comportamiento dinámico. Utilice un típico protocolo de dos pulsos de 2 estímulos despolarizantes con un intervalo de 50 ms (Figura 4B). </li><li> Recoge los rastros de control en las condiciones de base. A continuación, aplicar los GABA B baclofeno R agonista selectivo (10 m) para la perfusión ACSF, activando así Rs GABA B, seguido por el antagonista CGP-55845 (5 M), para bloquear totalmente los efectos mediados por el receptor. Recoger ~ 50 trazas durante el estado estacionario de cada condición de medicamento (Figura 4B y C). </li><li> Una vez que la grabación haya terminado, sellar la membrana somática formando una outside-cabo parche: Lentamente retirar la pipeta desde el cuerpo celular en V-abrazadera y como los R S aumenta, reducir el V M a -40 mV. Haga esto para facilitar la formación del parche fuera de salida; a continuación, extraiga la pipeta de la bañera. </li></ol> 6. Análisis de las propiedades electrofisiológicas <ol><li> NOTA: Una multitud de diferentes paquetes de software están disponibles para la adquisición de datos electrofisiológicos. Aquí, WinWCP, se utiliza un programa de Windows en el paquete gratuito Strathclyde Electrofisiología Software, que permite la grabación de hasta 16 canales de entrada analógica y la salida de 10 señales digitales. </li><li> Filtro de paso bajo de todos los datos a 5-10 kHz y muestra a 20 kHz. </li><li> Analizar los datos fisiológicos con un análisis conjunto off-line. NOTA: Stimfit, un paquete de software de fuente abierta, que incluye un terminal de Python, se utiliza en este caso; sin embargo otras alternativas pueden ser utilizadas fácilmente en su lugar. <ol><li> Analizar membrana pasiva propiedades de neuronas registradas, adquiridas en la pinza de corriente, de potencial de reposo de la membrana. </li><li> Medir la media potencial de reposo de membrana de la línea de base de las respuestas registradas desde el comienzo de la grabación. </li><li> Calcular la resistencia de entrada, utilizando la ley de Ohm, de la respuesta de tensión a los impulsos de corriente hiperpolarizantes más pequeños (≤ -50 Pa). Para mejorar la relación señal a ruido, múltiples trazas promedio. Nota: los ejemplos son típicamente promedios de 10 a 50 barridos individuales. </li></ol></li><li> Estimar el tiempo de membrana constante aparente ajustando una curva monoexponencial a la decadencia de las respuestas a los más pequeños pulsos de corriente de hiperpolarización. </li><li> Analizar potencial de acción de forma de onda para determinar el umbral, la amplitud (umbral a pico) y la duración (anchura medida a media altura) provocada por nivel de umbral de despolarización impulsos de corriente. </li><li> Analizar GABA B R IPSCs mediados de grabaciones de fijación de voltaje. Filtro traza fuera de línea en500 Hz (filtro Gaussiano) y evaluar la amplitud de pico y la latencia de la respuesta mediada por GABA B R (en los promedios de al menos 10 restos). </li><li> Detectar el efecto de GABA B Rs en la salida inhibitorio de SIN como un cambio en la amplitud de pico de las IPSCs mediadas-R GABA A medidos entre el pico y la línea de base anterior. Calcular la amplitud media de ≥50 trazas para el período de control y el estado de equilibrio de todas las épocas farmacológicos. </li></ol> 7. Visualización e inmunocitoquímica de FS-Ins <ol><li> A raíz de las grabaciones, fijar las rebanadas por inmersión en paraformaldehído al 4% con 0,1 M tampón fosfato (PB, pH = 7,35) O / N a 4 ° C. </li><li> Si rebanadas necesarias pueden ser transferidos a PB y almacenarse hasta ~ 1 semana antes de procesar. </li><li> Lavar abundantemente en rodajas PB fresco y posteriormente en 0.025 M PB con 0,9% de NaCl (PBS, pH = 7,35). </li><li> Para reducir anticuerpo unión no específica, bloquear las rodajas de FOr 1 hora a RT en una solución que contiene 10% de suero normal de cabra (NGS), 0,3% de Triton-X100 (un detergente para permeabilizar membranas) y 0,05% NaN 3, hecha en PBS. </li><li> Para etiquetar para la expresión PV, utilizar un anticuerpo monoclonal de ratón anti-PV diluido en una solución que contiene 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN 3, en PBS. Incubar anticuerpos primarios durante 2-3 días a 4 ° C 12. Enjuague rebanadas a fondo en PBS. </li><li> Aplicar anti-ratón secundaria de anticuerpos fluorescentes (por ejemplo Alexafluor-546.) Junto con la estreptavidina-proteína de unión a biotina, conjugado con un fluorocromo (por ejemplo, Alexafluor-647); y se incuban en una solución que contiene 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% NaN 3, diluido en PBS e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Liberalmente enjuague rebanadas 2-3x con PBS seguidos por 2-3 enjuagues en PB. Montar las rebanadas en el portaobjetos de vidrio. Use un 300 micras agar espaciador para evitar el corte de colapsar. Rebanadas cubres con un fluomedio de montaje ciento y el sello con el clavo-barniz. </li></ol> 8. Imaging y Reconstrucción de Visualized FS-Ins <ol><li> Visualice las rebanadas utilizando un microscopio confocal de barrido, con el reportero fluorochome emocionados con la línea de láser adecuado (diodo láser 635 nm para Alexafluor-647; Helio-Neón 543 nm para Alexafluor-546 etiquetado para PV y Argon 488 o 515 nm para Venus / YFP). </li><li> Tomar imágenes a una resolución apropiada Z-(típicamente 0,5-1 micras pasos, usando un objetivo 20X) para producir una pila Z de toda la célula. Múltiples pilas normalmente se requiere que toda la imagen de la célula, que puede ser cosida digitalmente fuera de línea utilizando FIJI / software ImageJ (Figura 5A). </li><li> Reconstruir la celda de la pila de imágenes unidas utilizando un método de seguimiento semi-automático (simple plugin de Neurite Tracer en paquete de software FIJI / ImageJ 17, Figura C). </li><li> Por último, evaluar la PV-inmunoreactividad de la interneuron con una lente de objetivo de alta apertura numérica (60X silicio-inmersión, NA = 1,3). Hacer imágenes del soma, dendritas proximales y axón proximal, o, alternativamente, de terminales de los axones si lavado somática de PV es demasiado fuerte. Las células se consideran inmunorreactivas para PV si inmuno-etiquetado se ve para alinearse con las estructuras Biocitina marcado (Figura 5B). </li></ol>

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<li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit%2C+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic%2C+basket%2C+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Se describe un método que combina técnicas electrofisiológicas y neuroanatómicas para caracterizar funcionalmente neuronas morphologically- y neuroquímicamente identificados in vitro; en particular, los diversos tipos de INS inhibitorias corticales. Los aspectos clave del procedimiento son: (1) pre-selección de INS potenciales; (2) el registro intracelular y la visualización de las neuronas; y, finalmente, (3) el análisis morfológico y inmunocitoquímica de IEE registrados. Aunque este estudio se ha ocupado de PV-ins en ...

Circuitos neuronales del hipocampo han sido durante mucho tiempo objeto de un intenso escrutinio, con respecto tanto a la anatomía y la fisiología, debido a su papel esencial en el aprendizaje y la memoria, así como la navegación espacial en los seres humanos y roedores. Igualmente, la organización laminar prominente, pero simple del hipocampo hace de esta región un tema favorito de estudios sobre las propiedades estructurales y funcionales de las redes corticales. Circuitos del hipocampo se componen de células excitatorias principales (&gt; 80%) y una más pequeña (10-20%), pero muy diversa cohorte de interneuronas inhibidoras 1-3. Las interneuronas liberan ácido γ-aminobutírico (GABA) desde sus terminales de los axones que actúa en ionotrópicos rápido receptores GABA A (GABA A Rs) y los receptores de GABAB metabotrópicos lentas (Rs GABA B) 4. Estos mecanismos inhibitorios se equilibran de excitación y regulan la excitabilidad de las células principales, y por lo tanto laIR temporización y el patrón de descarga. Sin embargo, liberado de interneuronas GABA actúa no sólo en las células principales, sino también en los propios 5,6 interneuronas. Receptores pre y postsinápticos median la regulación por retroalimentación y las interacciones mutuas inhibitorias entre los diversos tipos de interneuronas. Estos mecanismos inhibitorios en las redes de interneuronas se cree que son fundamentales para la generación y conformación de los patrones de actividad de la población, en particular las oscilaciones a diferentes frecuencias 7. Grabación de patch-clamp de célula entera es un método bien establecido para el examen de las propiedades intrínsecas y las interacciones sinápticas de las neuronas. Sin embargo, debido a la gran diversidad de tipos de interneuronas, la investigación de las interneuronas inhibidoras requiere la identificación rigurosa de las células grabadas. Como los tipos de interneuronas del hipocampo se caracterizan por rasgos distintivos morfológicos y la expresión de marcadores neuroquímicos, anatómica combinada y inmunocitoquímica eXAMEN puede proporcionar un medio para determinar la identidad precisa 6,8,9 interneuron. En el presente trabajo se describe un enfoque experimental en el que su conjunto de células patch-clamp grabaciones de las neuronas individuales o pares sinápticamente acoplados se combinan con el etiquetado intracelular, seguido de post-hoc de análisis morfológico y inmunocitoquímica, lo que permite la caracterización de lenta GABA B receptor mediada efectos inhibitorios en interneuronas identificados. A modo de ejemplo, nos centramos en uno de los principales tipos de interneuronas, un subconjunto de las llamadas &quot;células cesto&quot; (BC), que inerva el soma y dendritas proximales de sus metas post-sinápticas y se caracteriza por un &quot;Rematar rápida&quot; (FS) descargar patrón, un axón cubriendo densamente la capa de cuerpo de la célula, y la expresión de la proteína parvalbúmina de unión a calcio (PV) 10,11. Estas interneuronas muestran grandes corrientes postsinápticas inhibitorias, así como pre prominentemodulación sináptica de su producción sináptica, en respuesta a la activación de GABA B R 12. La combinación de las técnicas descritas aquí se puede aplicar igualmente bien para investigar los mecanismos intrínsecos o sinápticas en una variedad de otros tipos de neuronas identificadas.

<table><tbody><tr><td>Ratas transgénicas vGAT-venus</td><td></td><td></td><td>ver Uematsu, &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2008</td></tr><tr><td>Gafas Venus (515 nm)</td><td>BLS Ltd., Hungría</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herramientas de disección</td><td>&lt;em&gt;es decir&lt;/em&gt; FST</td><td></td><td>Para extracción del cerebro</td></tr><tr><td>Vibrátomo</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>O cualquier vibrátomo de gama alta con mínima oscilación vertical</td></tr><tr><td>Cámaras para almacenar cortes</td><td></td><td></td><td>Hechas a medida en el laboratorio</td></tr><tr><td>Microscopio vertical IR-DIC</td><td>Olympus, Japón</td><td>BX50WI</td><td>Con sistema micromanipulador; &lt;em&gt;por ejemplo&lt;/em&gt; Luigs y Neumann, Kleindiek &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Till Photonics</td><td>VX55</td><td></td></tr><tr><td>Sistema LED de 505 nm</td><td>Cairn Research</td><td>Sistema OptiLED</td><td>O lámpara de mercurio u otro sistema LED &lt;em&gt;por ejemplo&lt;/em&gt; CooLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Alternativamente 2 amplificadores Axopatch 200B&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Software de adquisición WinWCP</td><td>John Dempster, Universidad de Strathclyde</td><td></td><td>Se podría usar cualquier software de adquisición de calidad, &lt;em&gt;por ejemplo&lt;/em&gt; EPHUS, pClamp, Igor, etc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tractor de electrodos</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>Usado con filamento tipo caja</td></tr><tr><td>vidrio borosilicatado para pipetas</td><td>Hilgenberg, Alemania</td><td>1405020</td><td>2 mm de diámetro externo, 1 mm de diámetro interno, sin filamento</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>Minipuls</td><td>Se podrían usar otras bombas o alimentación por gravedad</td></tr><tr><td>Termómetro digital</td><td></td><td></td><td>Hecho a medida</td></tr><tr><td>Manómetro digital</td><td>Supertech, Hungría</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/&quot; target=&quot;_blank"&gt;Estimulador aislado de voltaje constante&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds2a-isolated-constant-voltage-stimulatorstimulus-isolator/&quot; target=&quot;_blank"&gt;DS-2A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Biocitina</td><td>Invitrogen</td><td>B1592</td><td>También conocida como &amp;epsilon;-Biotinoil-L-Lisina&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sal disódica de DL-AP5(V)</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120271</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica de DNQX</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120169</td><td>Alternativamente NBQX o CNQX</td></tr><tr><td>Gabazina (SR95531)</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120042</td><td>Alternativamente bicuculina metioduro</td></tr><tr><td>R-Baclofeno</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120325</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de CGP-55,845</td><td>Tocris</td><td>1248</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal anti-PV de ratón</td><td>Swant, Suiza</td><td>235</td><td>Concentración de trabajo 1:5.000-1:10.000</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario anti-ratón&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>Si se usa un roedor Venus o GFP, es recomendable usar un canal rojo (&lt;em&gt;es decir&lt;/em&gt; 546 nm).</td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos para microscopía</td><td></td><td></td><td>Cualquier marca de alta calidad</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td></td><td></td><td>Habitualmente 22 x 22 mm</td></tr><tr><td>Separadores de agar</td><td></td><td></td><td>Bloque de agar, cortado en el vibrátomo a 300 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Olympus, Japón</td><td>Fluoview FV1000</td><td>O cualquier sistema comparable</td></tr><tr><td>Fiji (Fiji es solo ImageJ)</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td>Ver Schindelin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2012</td></tr></tbody></table>

plenario de células patch-clamp grabaciones de morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Interneuronas GABAérgicas inhibitorias juegan un papel central dentro de los circuitos neuronales del cerebro. Las interneuronas representan un pequeño subconjunto de la población neuronal (10-20%), pero muestran un alto nivel de heterogeneidad fisiológica, morfológica, y neuroquímicos, que refleja la diversidad de sus funciones. Por lo tanto, la investigación de las interneuronas ofrece importantes conocimientos sobre los principios de organización y funcionamiento de los circuitos neuronales. Esto, sin embargo, requiere un enfoque fisiológico y neuroanatómico integrado para la selección e identificación de tipos de interneuronas individuales. De células enteras de grabación de cortes de cerebro agudos de animales transgénicos, que expresan proteínas fluorescentes bajo los promotores de marcadores-interneuron específica de patch-clamp, proporciona un método eficiente para apuntar y caracterizar propiedades intrínsecas y sinápticas de tipos específicos interneuron electrofisiológicamente. Combinado con tinte de etiquetado intracelular, este enfoque se puede ampliar con mo post-hocanálisis rphological y inmunocitoquímica, que permite la identificación sistemática de las neuronas registradas. Estos métodos se pueden adaptar para adaptarse a una amplia gama de cuestiones científicas sobre las propiedades funcionales de los diversos tipos de neuronas corticales.

A condición de que la calidad del corte es considerablemente buena, la grabación tanto de CA1 PC y FS-ins se puede conseguir con dificultad mínima. La línea de rata transgénica que expresa Venus / YFP bajo el promotor VGAT 13 no identifica inequívocamente FS-ins, o incluso chalecos. Sin embargo grabaciones del INS en los alrededores de str. pyramidale, donde la densidad de FS-ins es típicamente alta 1, da como resultado una alta probabilidad de seleccionar FS-ins (Figura 2B).</stro...

Redes corticales son controlados por un conjunto pequeño, pero diverso de interneuronas inhibidoras. Investigación funcional de interneuronas por lo tanto requiere la grabación específica y la identificación rigurosa. Aquí se describe un enfoque combinado que involucra conjunto de células grabaciones de pares individuales o sinápticamente acoplados de neuronas con el etiquetado intracelular, post-hoc morfológica y inmuno análisis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar los efectos mediados por el receptor GABA B en interneuronas del hipocampo identificadas como positivas para parvalbúmina. Esto se logra primero produciendo cortes agudos de alta calidad del hipocampo. El segundo paso consiste en utilizar un microscopio de video para seleccionar neuronas basándose en la expresión venosa de YFP y en las características conocidas de las neuronas positivas para parvalbúmina.A continuación, se obtienen registros de parche en célula completa y se utiliza estimulación extracelular o grabaciones emparejadas para examinar los efectos mediados por los receptores GABA B. El paso final consiste en visualizar las neuronas y confirmar que las neuronas registradas son efectivamente positivas para albúmina par, y que son neuronas inhibitorias parasomáticas o dendríticas. En última instancia, este método permite la caracterización de los efectos inhibitorios mediados por los receptores GABA B y posibilita la clasificación inequívoca de las interneuronas registradas.Este método puede responder preguntas clave en el campo de las interneuronas. Por ejemplo, cómo las interneuronas se comunican entre sí, cómo su

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe una técnica llamada electrofisiología de pinza de parche de célula completa, que es un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas de Mauthner y otras células reticuloespinales en embriones de pez cebra.

Electrofisiología de pinza de parche de célula completa: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

Este video muestra una técnica para el registro de patch-clamp desde la superficie de la membrana dendrítica. Esto ayuda a examinar directamente las propiedades eléctricas de las dendritas y los canales iónicos subyacentes dependientes de voltaje en las neuronas dopaminérgicas.

Grabaciones de patch-clamp de la dendrita de una neurona dopaminérgica en un corte de cerebro

El video muestra un protocolo para estudiar las interacciones sinápticas y las respuestas neuronales en un corte de cerebro de hipocampo de ratón transfectado. Consiste en iluminar neuronas sensoriales de largo alcance para desencadenar potenciales de acción y registrar los potenciales postsinápticos excitatorios resultantes en la neurona registrada mediante la técnica de patch-clamp de célula completa.

Fotoestimulación y registros de pinza de parche de células enteras de neuronas en cortes de hipocampo de ratón

Este video muestra el procedimiento para realizar registros electrofisiológicos en neuronas de sustancia gelatinosa (SG) de cortes de médula espinal, utilizando técnicas de patch-clamp de células enteras para analizar los patrones de disparo de las neuronas. Este método permite el estudio de las respuestas neuronales a estímulos en las neuronas SG de la médula espinal.

Registro de pinza de parche de célula entera en una neurona gelatinosa de una sustancia de un corte de médula espinal

Este video muestra el procedimiento para mapear las conexiones sinápticas asegurando un corte de cerebro, colocando pipetas para lograr configuraciones de células completas y estimulando las neuronas presinápticas para registrar respuestas postsinápticas, dilucidando así la conectividad neuronal.

Registro de las conexiones neuronales en cortes cerebrales agudos

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

registros de pares son registros simultáneos de pinza de parche de célula completa de dos neuronas conectadas sinápticamente, lo que permite una caracterización electrofisiológica y farmacológica precisa de las sinapsis entre neuronas individuales. Aquí describimos la metodología detallada y los requisitos para establecer esta técnica en cultivos organotípicos de cortes de hipocampo en cualquier laboratorio equipado para electrofisiología.

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

registros de patch-clamp y el llenado simultáneo de biocitona intracelular de neuronas sinápticamente acopladas en cortes agudos de cerebro permiten un análisis correlacionado de sus propiedades estructurales y funcionales. El objetivo de este protocolo es describir los pasos técnicos esenciales del registro electrofisiológico a partir de microcircuitos neuronales y su posterior análisis morfológico.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

Este protocolo se describen los pasos básicos de procedimiento para la realización de patch-clamp grabaciones de células enteras. Esta técnica permite el estudio del comportamiento eléctrico de las neuronas, y cuando se realiza en secciones de cerebro, permite la evaluación de varias funciones neuronales de las neuronas que todavía están integrados en los circuitos cerebrales relativamente bien conservadas.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Los registros subcelulares de patch-clamp ofrecen la posibilidad de investigar las propiedades funcionales de las dendritas. Sin embargo, estas finas estructuras no son fácilmente accesibles debido a su pequeño diámetro. El protocolo aquí descrito tiene como objetivo facilitar la recopilación de registros estables y fiables de las dendritas de las neuronas dopaminérgicas en cortes in vitro.

Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

El presente protocolo describe cómo aislar y purificar la microglía primaria del hipocampo de ratones adultos, seguido de instrucciones para realizar registros de patch-clamp de células completas en estas células agudamente aisladas.

Aislamiento y registro de microglía del hipocampo de ratones adultos

Aprende a caracterizar efectos mediados por receptores GABA B en interneuronas parvalbúminas del hipocampo usando grabaciones patch-clamp de célula completa. Este método permite clasificar morfológicamente las neuronas inhibidoras.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

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