Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar los efectos mediados por el receptor GABA B en las interneuronas positivas para parvalbúmina del hipocampo identificadas. Esto se logra produciendo primero cortes agudos de hipocampo de alta calidad. El segundo paso es utilizar un microscopio de vídeo para seleccionar las neuronas en función de la expresión venosa de YFP y las características conocidas de las neuronas paral albúmina positivas.

A continuación, se obtienen registros de pinza de parche de célula completa y se utilizan registros de estimulación extracelular o emparejados para examinar los efectos mediados por el receptor GABA B. El paso final es visualizar las neuronas y confirmar que las neuronas registradas son de hecho par albúmina positivas, y son neuronas parasomáticas o inhibidoras dendríticas. En última instancia, este método permite la caracterización de los efectos inhibidores mediados por el receptor GABA B y permite la clasificación inequívoca de las interneuronas registradas.

Este método puede responder a preguntas clave en el campo interneuronal. Por ejemplo, cómo las interneuronas se comunican entre sí, cómo su excitabilidad, su salida sináptica está controlada por sistemas neuromoduladores. Aunque este método proporciona información sobre el GABAérgico, el control del hipocampo en las neuronas, también se puede aplicar a otras regiones del cerebro, sistemas neuromoduladores o tipos de células.

Tome el cerebro de una rata transgénica de 17 a 24 días de edad que expresa YFP venoso fluorescente mantenido en sacarosa de carbúngeno semicongelada, A usando un bisturí, retire el tercio frontal de la corteza, el cerebelo, y separe los hemisferios. Retire la superficie dorsal de la corteza para proporcionar una superficie plana para pegar el cerebro para seccionarlo. Pega los hemisferios en la etapa de viome con el baño de viome relleno de sacarosa nativa de carbógeno rozen.

Un líquido cefalorraquídeo cortó cortes transversales de 300 micrómetros de la formación del hipocampo. Transfiera cada rebanada a una cámara de retención sumergida que contenga sacarosa de carbógeno, A CSF a 35 grados Celsius. 30 minutos Después de colocar la última rebanada en la sacarosa calentada, un líquido cefalorraquídeo transfiera las rodajas a temperatura ambiente para su almacenamiento.

Extraiga las pipetas de parche de los capilares de vidrio para lograr una resistencia de pipeta de dos a cuatro mega ohmios. Cuando esté lleno, transfiera una rebanada de hipocampo a la cámara de grabación, manteniéndola en su lugar con un anillo de platino ensartado con fibras individuales de seda. Coloque la cámara en la configuración de registro y comience la perfusión con CSF de registro A calentado por carbógeno a un caudal de cinco a 10 mililitros por minuto.

Utilice una cámara de vídeo para evaluar la calidad del corte con óptica I-R-D-I-C con un aumento de objetivo de 40x. Suponga que la rebanada es de buena calidad. Si se observa un gran número de células parametálicas redondas moderadamente contrastadas en el parámetro del estrato a profundidades de 20 a 30 micrómetros por debajo de una superficie lisa y ligeramente llena de cráteres.

Utilizando iluminación epifluorescente, identifique las interneuronas putativas de pico rápido como aquellas que expresan YFP venoso con grandes somáticos multipolares en o cerca del estrato parama. A continuación, llene las pipetas de parche con una solución que contenga una concentración de cloruro baja y fisiológicamente relevante para la identificación de corrientes postsinápticas y colóquela en el soporte de pipetas en la etapa principal. A continuación, aplique una presión positiva baja a través de la línea de tubos.

Baje la pipeta hasta la superficie de la rebanada, ligeramente desplazada hacia el centro de la neurona seleccionada. Aumente la presión a 70 a 80 milibares y baje rápidamente la pipeta a través del corte hasta justo por encima del soma de la celda seleccionada. Presione la pipeta contra la membrana celular para producir un hoyuelo en ella.

Realice este paso rápidamente. Para evitar el etiquetado de biotina de las células vecinas, cree un sello de giga ohmios liberando la presión y aplicando simultáneamente un comando de voltaje negativo de 20 milivoltios a la pipeta. Una vez que comience el sellado, reduzca el comando de voltaje al potencial de membrana en reposo esperado, generalmente entre menos 70 y menos 60 milivoltios.

Ahora aplique un pulso corto de presión negativa para romper el parche de membrana, logrando así la configuración de toda la celda. Usando el modo de pinza de corriente, identifique las interneuronas de pico rápido por su respuesta a una familia de pulsos de corriente hiperpolarizantes a despolarizantes. Para observar las respuestas sinápticamente evocadas, coloque un electrodo de estimulación extracelular en el corte en el borde del registro molecular del estrato de radio y del estrato laun oum.

En el modo de pinza de voltaje, use un estimulador de voltaje constante aislado para entregar trenes simples o de 200 hercios de cinco estímulos eléctricos de 50 voltios a los axones presinápticos cada 20 segundos. A continuación, aplique antagonistas ionotrópicos de los receptores de glutamato en el baño para revelar los monos aislados. IPSC sináptico.

Aísle aún más el IPSC mediado por el receptor GABA B con la aplicación de un antagonista del receptor GABA A. Para comenzar las grabaciones emparejadas. Primero, establecer un registro de toda la célula de una interneurona presináptica como antes y confirmar el fenotipo de pico rápido.

A continuación, conecte una celda parametálica CA dentro de una distancia de 20 a 100 micrómetros de la interneurona que sostiene la interneurona presináptica. En modo de pinza amperimétrica. Aplique pulsos breves de corriente despolarizante del umbral SRA para provocar potenciales de acción en la interneurona.

Si hay una conexión sináptica, los potenciales de acción en la interneurona dan como resultado IPC en la celda parametálica sujeta a voltaje. Una vez que se establece una conexión, se provocan pares de potenciales de acción en la interneurona presináptica de pico rápido con un protocolo de pulso emparejado típico de dos estímulos despolarizantes con un intervalo de 50 milisegundos. Después de recoger las trazas de control, aplique el agonista selectivo del receptor GABA B baclofeno al LCR A perfundido, activando así los receptores GABA B.

A continuación, aplique el antagonista CGP 55 8 45 para bloquear completamente los efectos mediados por el receptor. Una vez que se complete la grabación, retire lentamente la pipeta del cuerpo de la celda en una pinza de voltaje. A medida que aumenta la resistencia medida en serie, reduzca el voltaje de la membrana a menos 40 milivoltios para sellar la membrana somática formando un parche de afuera hacia afuera.

Después de las grabaciones, fije las rodajas por inmersión en formaldehído al 4% con tampón de fosfato 0,1 molar durante la noche a cuatro grados centígrados con tampón de fosfato de lavado, luego en solución salina tamponada con fosfato y bloquee con 10% de suero de cabra normal 0.03% TRITTON X 100 y 0.05% azida de sodio durante una hora a temperatura ambiente para etiquetar la expresión de albúmina par, utilizar un anticuerpo monoclonal de ratón antiparvalbúmina diluido en una solución que contenga 5 % de suero de cabra normal, 0,3 % TRITTON X 100 y 0,05 % de azida de sodio en PBS, incubar los anticuerpos primarios durante dos o tres días a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, enjuague bien las rodajas en PBS, aplique anticuerpos secundarios fluorescentes anti-US junto con una tira de proteína de unión a biotina conjugada con un fluorocromo e incube en una solución que contenga 3 % de suero de cabra normal, 0,1 % tritton X 100 y 0,05 % de sodio diluido en PBS, incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, enjuague generosamente las rodajas dos o tres veces con PBS, seguido de dos o tres enjuagues en tampón de fosfato.

Monte las rebanadas en portaobjetos de vidrio y use un espaciador de agar de 300 micrómetros para evitar que la rebanada colapse. A continuación, cubra el deslizamiento de las rodajas con un medio de montaje fluorescente y séllelo con esmalte de uñas. Evaluar la inmunorreactividad de la interneurona par albúmina con un gran aumento y apertura numérica.

Las células del cristalino objetivo se consideran inmunorreactivas para la albúmina par. Si se observa que el inmunomarcaje se alinea con las estructuras marcadas con biotina, tome una serie de imágenes del eje Z con un microscopio confocal de barrido láser, imágenes fluorescentes de Aden para la identificación morfológica y la reconstrucción tridimensional. A continuación, reconstruya la imagen en neurona en tres dimensiones, incorporando la arborización dendrítica y axonal.

Aquí se muestra la respuesta sináptica compuesta de una interneurona de pico rápido en respuesta a un solo estímulo extracelular. Aplicación de los antagonistas ionotrópicos de los receptores de glutamato, los aislados DNQX y A PV, la corriente postsináptica inhibidora monos sináptica o la aplicación IPSC del antagonista del receptor gabaa. Gazin abolió el componente rápido del IPSC.

Un tren de cinco estímulos reveló un IPSC lento mediado por el receptor GABA B, que fue bloqueado por la aplicación posterior de CGP. Estas trazas muestran potenciales de acción en las PSC pre-sinápticas, interneuronas de pico rápido y I unitarias de corta latencia en células parametálicas CA uno bajo condiciones de control después del baño, la aplicación de baclofeno y la posterior aplicación de CGP. Tenga en cuenta que el baclofeno reduce la amplitud de la IPSC en aproximadamente un 50%, mientras que el antagonista del receptor GABA B resultó en una recuperación casi completa de la amplitud de la IPSC.

Un gráfico de curso de tiempo de la amplitud de IPSC muestra el efecto de la interneurona de pico rápido de baclofeno y CGPA, mostrada a un aumento de 20x, tenía un somata ubicado en el borde del estrato, radio y parama de la área ca uno, con dendritas que corren verticalmente y abarcan todas las capas. Si bien la mayor parte del axón se encuentra dentro y alrededor de la capa del cuerpo celular, como es típico de las células de cesta, una imagen de aumento de 60x muestra cestas típicas de axones que se forman alrededor de una supuesta salata parametálica, que están marcadas con el asterisco naranja. Aquí se muestra una reconstrucción tridimensional de la misma interneurona con el soma y las dendritas en negro y el axón en rojo.

Las capas de la ca one se delinean en azul una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en un día con análisis morfológico postdoctoral realizado en varios cortes a la vez después de su desarrollo. Este enfoque combinado allanó el camino para que los investigadores de los microcircuitos del hipocampo y cortical exploraran la diversidad morfológica, fisiológica, así como la interrelación de la función y la estructura de los tipos de neuronas.