Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño

La electroforesis es una técnica en la que se aplica una corriente eléctrica a células vivas para abrir poros transitorios en la membrana celular. A través de estos poros, colorantes y otras moléculas que normalmente no atraviesan la membrana celular pueden entrar en la célula; los poros se vuelven a cerrar rápidamente, sin causar daño a la célula. Describiremos cómo se pueden electropermeabilizar células adheridas mientras crecen sobre un portaobjetos recubierto parcialmente con un material eléctricamente conductor y transparente.

El material es óxido de indio y estaño, y al conducir corriente eléctrica, abre poros que permiten la entrada de un colorante en la célula. Luego es posible examinar si las células tienen uniones en hendidura o no, y cuántas uniones en hendidura existen. Estos canales pequeños conectan los interiores de células adyacentes y permiten el paso de moléculas pequeñas. Desde hace mucho tiempo se reconoce que la comunicación mediante uniones en hendidura tiene diversas funciones importantes en la célula, incluyendo la transformación neoplásica y la metástasis.

Bienvenido a esta presentación de proyectos celulares sobre cómo realizar la electroforesis de células adherentes utilizando el Insitu. Esta imagen muestra lo que seremos capaces de hacer: el colorante fluorescente de color amarillo se introdujo en células que crecen sobre un vidrio transparente y conductor. Hasta esta línea, la línea es más fácil de ver bajo contraste de fase.

Aquí lo tiene. Puede observarse que el colorante ha difundido a través de las uniones en hendidura desde las células de la izquierda, que fueron cargadas con el colorante mediante electro poración, hacia las células de la derecha. Resultando en este gradiente de fluorescencia, las células son tryps.

Se inizan y luego se transfieren a un tubo para centrifugar. Es muy importante que las células se distribuyan bien, ya que crecen en la cámara. Por esta razón, lo mejor es centrifugar las células para eliminar cualquier rastro de tripsina.

El medio con trazas de tripsina se aspira, las células se resuspenden en aproximadamente un mililitro de medio de crecimiento y luego se siembran en la cámara. La pipeta contiene la suspensión celular; retire la tapa de la cámara y agregue las células gota a gota en la cámara para facilitar su transporte. La cámara se coloca en una placa de Petri de seis centímetros.

La cámara vuelve al incubador para que las células crezcan. Las células sembradas se extenderán adecuadamente y crecerán hasta tocarse entre sí y formar uniones en hendidura. Cuando las células estén listas para la electroestimulación, configure el generador de pulsos in situ en las condiciones deseadas.

Consulte el manual para obtener la descripción del sencillo proceso de configuración. Cuando se establezca el voltaje en el insitu, la luz roja del teclado se encenderá. Saque del baño de agua las dos botellas calentadas de DMEM sin calcio: una es DMEM sin calcio, pero con suero dializado, y la otra es DMEM.

Sin calcio, tenga listas las pipetas cargadas más sueltas con colorante amarillo en el pipeteador. En lugar del suspiro, retire las células del incubador. Elimine el medio invirtiéndolo inicialmente en el vaso de lavado.

Luego, aplique sobre el tejido una vez con DMEM sin calcio, sin intentar eliminar completamente todo el DMEM porque las células podrían secarse. Añada con cuidado el amarillo de luciferina sobre la barrera para no perturbar las células, pero con suficiente rapidez para que las células no se sequen. Utilice 200 microlitros para cada mitad de la cámara.

Coloque la tapa en la cámara de insitu y luego cárguela en el portaobjetos. Asegúrese de que las lengüetas del extremo de la cámara encajen en las ranuras del portaobjetos empujándolo. Introduzca la cámara en el soporte de la cámara.

Presione el botón de pulso en el teclado del generador de pulsos. El LED en el generador de pulsos y en el soporte de la cámara parpadeará en rojo durante el proceso de electrotransferencia y luego parpadeará en verde para indicar que el ciclo de inicio ha finalizado. Retire el deslizador hacia atrás debajo del soporte de la cámara y saque la cámara.

Aspire la mayor parte del amarillo de luciferina para volver a utilizarlo, pero tenga cuidado de no secar las células. Añada DMEM sin calcio. Con suero dializado, el suero ayuda a que el poro cierre la cámara, que luego regresa al incubador para que ocurra la transferencia del amarillo de luciferina a través de las uniones en hendidura.

El tiempo debe ser consistente de un experimento a otro. El estándar es tres minutos. Vierta el medio en el vaso de desecho.

Añada solución fijadora de formaldehído al 4 % con una pipeta Pasteur o una pipeta, espere a temperatura ambiente durante al menos dos minutos. Vierta el formaldehído y enjuague varias veces. Las células quedan fijadas al vidrio con PBS, por lo que existe un bajo riesgo de que se desprendan durante el lavado.

Para poder observar las células en contraste de fases, es importante colocar una lámina de cobertura encima de la cámara. Llene la cámara con PBS formando un menisco convexo. Evitando burbujas de aire, coloque la lámina de cobertura.

No se preocupe si el PBS se desborda. Simplemente absorba el exceso de PBS con papel absorbente. Necesita un microscopio fluorescente invertido, preferiblemente con contraste de fases y un bloque de filtros para amarillo de luciferina. Con contraste de fases, busque el borde del área electroporada.

Verá dos líneas bajo las células fluorescentes. En la mitad del portaobjetos se observará una fluorescencia intensa. La línea más cercana a las células brillantes corresponde al borde del área electroporada.

Cualquier fluorescencia adicional se debe a la transferencia de lucifer yellow a través de uniones en hendidura. Por ejemplo, esta imagen de células epiteliales muestra células que han sido electroporadas en el lado izquierdo de la imagen, transfiriendo lucifer yellow a células vecinas no electroporadas, creando un gradiente de células luminiscentes que se extiende desde el borde del recubrimiento conductor hacia la derecha. Esta imagen muestra el mismo campo de células en contraste de fase.

Tenga en cuenta que puede observar la línea X con mucha claridad. Se puede realizar manualmente una medida cuantitativa de la cantidad de transferencia por uniones en hendidura ocurrida, trabajando con las imágenes de fluorescencia y de contraste de fase de las células electroporadas. Las estrellas a lo largo del borde del área conductora se consideran células donantes.

Se han electropermeabilizado y han captado el gen para el color amarillo. Transmiten luc para el color amarillo a las células vecinas de la derecha, las cuales lo pasan adelante. Aún más allá, en cantidades decrecientes.

La proporción entre los puntos y las estrellas, 41 a ocho en este caso, puede generar un número para comparar en qué medida es la transferencia por uniones en hendidura en esta situación. 5,1 es el índice de uniones en hendidura. Una alternativa al marcado y conteo manual de células consiste en utilizar software de análisis de imágenes para medir las cantidades relativas de fluorescencia a lo largo del lado no electroporado del borde celular de una célula electroporada.

Estas células no tienen uniones en hendidura. Aquí está el borde derecho del área electroporada. Observe que no hay un gradiente de fluorescencia, lo que indica la ausencia de uniones en hendidura bajo contraste de fase.

Puede observarse claramente todas las células. Tenga en cuenta que la línea X también es claramente visible. En este ejemplo.

Todas las células en la cámara fueron estimuladas con factor de crecimiento epidérmico EGF, y diez minutos después se fijaron y analizaron para detectar fosfo arc. Observe que las células teñidas a la derecha no han sido electroporadas, y las células a la izquierda hasta esta línea han sido electroporadas. Las células no electroporadas muestran tinción marrón con un anticuerpo contra fosfo irk y inmunoperoxidasa.

Las células electropermeabilizadas no muestran tinción, ya que el péptido fosforilado electropermeabilizado ha bloqueado el dominio SSH2 de Grb2 e inhibido la fosforilación de EGF por IRK. Observe la región de tres a cuatro longitudes celulares a la derecha de la línea, donde las células no han sido electropermeabilizadas pero tampoco muestran tinción. Estas son células que han adquirido el péptido bloqueante de sus vecinas electropermeabilizadas mediante uniones en hendidura (gap junctions).

Esta es la demostración más contundente posible de que la inhibición de la señal debe deberse al péptido y no puede ser un artefacto de la electroforesis. Dado que estas células no han sido electroportadas, este es el mismo campo mostrado en contraste de fases. Observe la ausencia de cualquier cambio en la morfología tras la electroforesis.

En algunos pacientes, la comunicación por uniones en hendidura puede cuantificarse con precisión en una gran variedad de células cultivadas. La introducción de péptidos para interrumpir vías de señalización específicas es un enfoque potente para evaluar la relevancia en células vivas de interacciones proteína-proteína que se han identificado con proteínas purificadas. Esto puede ser el primer paso importante en el desarrollo de fármacos peptidómicos.