Name: Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprende a realizar electroporación de células adheridas sobre láminas de óxido de indio y estaño para evaluar la comunicación intercelular a través de uniones gap. Este método permite introducir colorantes y estudiar la funcionalidad de las uniones gap en biología celular.

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Agradecemos a Lowell Cochran por su ayuda experta en videografía. Se agradece la asistencia financiera de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), la Fundación Canadiense de Cáncer de Mama (CBCF, Capítulo de Ontario), el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), la Alianza Canadiense de Investigación del Cáncer de Mama, los Centros de Excelencia de Ontario, la Acción contra el Cáncer de Mama de Kingston y el fondo de legado de Clare Nelson a través de subvenciones a LR. SG recibió una beca NSERC. MG contó con el apoyo de una beca postdoctoral del Programa de Cáncer de Mama del Ejército de los Estados Unidos, el Ministerio de Investigación e Innovación de la Provincia de Ontario y el Comité Asesor de Investigación de la Universidad de Queen.

1. Plating las células en las cámaras de electroporación <ol><li> En una campana de flujo laminar, trypsinize las células utilizando una técnica estéril como de costumbre. NOTA: Es muy importante eliminar por centrifugación todos los rastros de la tripsina, ya que pueden impedir la propagación de las células en el cristal, por lo tanto, la formación de adherentes y uniones gap. </li><li> Pipetear 1 ml de la suspensión de células en las cámaras de electroporación estériles proporcionadas con el en electroporador situ (Figura 1), y colóquelo en un 37 o C, CO 2 incubadora. NOTA: La adhesión celular se puede mejorar en placas sobre fibronectina, colágeno, poli-lisina o de células y el tejido adhesivo (ver Tabla de Materiales). </li><li> Cuando las células han formado una capa confluente de que estén listos para el examen GJIC. </li></ol> 2. Procedimiento electroporación La electroporación para el examen GJIC puede llevarse a cabo fuera de una campana de flujo laminar,ya que toma sólo unos pocos minutos. Si se requieren tiempos de incubación más largos para un experimento específico, entonces puede llevarse a cabo enteramente en una campana de flujo laminar. En todos los casos, las cámaras donde se cultivan las células deben ser estériles. <ol><li> Prepare una solución de color amarillo ml 5 mg / Lucifer: Disolver 10 mg de polvo LY (suministrado con el electroporador) en 2 ml de medio de cultivo libre de calcio. Para los experimentos que requieren tiempos de incubación más largos, filtro-esterilizar la solución y se almacena a 4 º C. </li><li> Aspirar el medio de cultivo y se lavan las células con medio libre de calcio, teniendo cuidado de no rayar la monocapa o secar las células. Si se secan las células por lo general tienen núcleos oscuros y recoger LY sin electroporación. El efecto es más pronunciado en el centro de la diapositiva que está más expuesta a corrientes de aire (Figura 4F). </li><li> Con una pipeta Eppendorf, pipeta la solución de colorante a las células (400 l para toda la cámara), en el borde de la cámara, ber cuidado de no tocar la capa de células. </li><li> Coloque la cámara en el soporte suministrado con el electroporador y aplicar un pulso de la fuerza apropiada (ver Discusión). </li><li> Aspirar cuidadosamente algo de la solución LY. Puede ser reutilizado una segunda vez para experimentos menos importantes. </li><li> Añadir DMEM libre de calcio que contiene 10% de suero dializado. </li><li> Se incuban las células durante 3-5 minutos en la incubadora para permitir la transferencia de colorantes a través de uniones. NOTA: La inclusión de suero dializado en este punto ayuda de cierre de los poros. </li><li> Lavar el colorante no incorporado con DMEM libre de calcio para la observación de células vivas. Alternativamente, las células pueden fijarse en esta etapa, a través de la adición de 4% de formaldehído al pozo, después se lavaron con PBS (solución salina tamponada con fosfato). En todos los casos el lavado debe eliminar todo el fondo. NOTA: En experimentos preliminares para determinar las condiciones óptimas, si el voltaje es demasiado bajo, entonces es posible hacer que las células se recuperan en el incubator durante unos minutos y electroporar la misma diapositiva una segunda vez, para ahorrar en el coste de diapositivas. </li></ol> 3. Examen microscópico <ol><li> Observar las células bajo iluminación de fluorescencia, usando un microscopio invertido equipado con el filtro apropiado para el tinte que se utiliza. Para Lucifer amarillo, excitación es 423nm, 555nm emisión, filtro WBV para un microscopio Nikon IX70. </li><li> Eliminar los efectos de menisco mediante la colocación de un cubre de vidrio en la parte superior del plástico y, después de llenar a la cima con el líquido, para examinar la morfología celular bajo contraste de fase. Para obtener mejores imágenes, el pozo puede ser separado de la corredera, y el cubreobjetos colocado en el bastidor. Para las células fijas, el pozo puede ser llenado con glicerol para la observación microscópica, mientras que para las células vivas que debe ser llenado con medio de crecimiento. NOTA: Lavado y fotografiar es más fácil si las células se fijan con formaldehído tras la transferencia del colorante (paso 2.7). Si las células no sont fijo, la fluorescencia se elimina de las células dentro de aproximadamente 60 min dependiendo de la introdujo en células fijadas, mientras que la fluorescencia se mantiene durante varias horas tipo de célula, la tensión y la cantidad de LY. Sin embargo, la fluorescencia se desvanece o se disipa después de O / N de incubación, incluso en células fijadas. Por esta razón, las fotografías deben tomarse pronto después de la electroporación (Figura 2). </li></ol> 4. La cuantificación de la comunicación intercelular <ol><li> Fotografiar las células con un objetivo de 20x bajo de fluorescencia y de contraste de fase (Figura 3). </li><li> Identificar y marcar con una estrella las células sometidas a electroporación en la frontera con la zona de no-electroporación (Figura 2, flecha, borde electroporación). </li><li> Identificar y marcar con un punto células fluorescentes en el lado no-electroporación, donde el colorante ha transferido a través de uniones (Figuras 3A y 3B). </li><li> Se divide el número total decélulas fluorescentes en la zona de no-electroporación por el número de células sometidas a electroporación a lo largo del borde (Figuras 3A y 3B). NOTA: La transferencia de al menos 200 células del borde contiguas a electroporación se calcula para cada experimento. El número obtenido es el valor GJIC. </li></ol>

<ol><li>Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaptis%2C+L+%22Electroporation+protocols%22">Electroporation protocols</a>. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).</li>
<li>Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+phosphotyrosine-binding+domain+inhibitors+on+insulin+receptor+signalling+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking.</a> Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).</li>
<li>Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+epithelial+tubules+by+growth+factor+HGF+depends+on+the+STAT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway.</a> Nature. 391, 285-288 (1998).</li>
<li>Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+signal+transducers+from+oncogenic+MET+mutants+abrogates+cell+transformation+and+inhibits+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).</li>
<li>Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ets+up-regulates+met+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ets up-regulates met transcription.</a> Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+affecting+Stat3+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques affecting Stat3 activity levels.</a> Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).</li>
<li>Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+human+T+cell+anergy%3A+blocking+of+IL-2+gene+transcription+by+activated+Rap1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1.</a> Science. 278 (5335), 124-128 (1997).</li>
<li>Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+Ras+activation%3B+electroporation+of+%5Balpha-32%5DGTP%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP.</a> DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).</li>
<li>Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+compounds+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells.</a> DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+nucleotides%3A+assessment+of+Ras+activity+and+32P-labelling+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+A+Laboratory+Handbook%2C+Celis%2C+Ed%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins.</a> Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).</li>
<li>Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+crk+II+in+actin+cytoskeleton+organization+and+mitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis.</a> J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).</li>
<li>Raptis, L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+adherent+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of adherent cells in situ.</a> DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).</li>
<li>Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+surface+tethered+enzyme+improves+efficiency+in+gene-directed+enzyme+prodrug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy.</a> Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).</li>
<li>Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3B+regulation+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+the+SRC+oncogene+product+and+its+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors.</a> Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).</li>
<li>Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li>
<li>Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-loading+and+dye+transfer%3A+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+intercellular%2C+junctional+communication%3B+electroporation+of+adherent+cells+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide.</a> DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).</li>
<li>Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+in+situ+electroporation+on+two+co-planar+indium-tin+oxide+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes.</a> Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+assay+for+intercellular%2C+junctional+communication+in+cultured+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells.</a> Lab Invest. 78, 639-640 (1998).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+communication+in+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gap junctional communication in lung carcinoma cells.</a> Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).</li>
<li>Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+activity+is+required+for+gap+junctional+permeability+in+normal+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts.</a> DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).</li>
<li>Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+a+positive+regulator+of+gap+junctional+intercellular+communication+in+cultured%2C+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 12, 605(2012).</li>
<li>Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+is+involved+in+gap+junction+closure+in+mouse+fibroblasts+or+preadipocytes+but+not+in+differentiated+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes.</a> DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).</li>
<li>Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+permeability+of+gap+junction+channels+to+probes+of+different+size+is+dependent+on+connexin+composition+and+permeant-pore+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities.</a> Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).</li>
<li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+Adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac%2FCdc42+and+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res+7%22%5BJournal%5D)">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).</li>
<li>Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+growth+factor-stimulated+mitogenesis+by+a+cell-permeable+Grb2-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide.</a> J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+Growth+Factor-stimulated+ERK1%2F2+activation+in+intact+cells+by+electroporation+of+a+Grb2-SH2+binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide.</a> Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).</li>
<li>Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+molecular+permeability+of+connexin+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assaying the molecular permeability of connexin channels.</a> Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).</li>
<li>Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gap+junctional+intercellular+communication+based+on+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).</li>
<li>Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+phenotype+and+expression+of+polyomavirus+middle+T+antigen+in+rat+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).</li>
<li>Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+membrane-associated+protein+kinase+C+activity+correlates+to+tumorigenicity+but+not+anchorage-independence+in+a+clone+of+mouse+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells.</a> Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).</li>
<li>Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li>
<li>Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+required+for+full+neoplastic+transformation+by+the+Simian+Virus+40+Large+Tumor+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen.</a> Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).</li>
</ol>

El autor correspondiente es el inventor de una patente de la Universidad de Queen, que ha sido licenciada a Cell Projects Inc. La compañía o la Universidad no tenían influencia sobre el contenido del documento.

Los pasos críticos en el protocolo Material de electroporados La pureza del material que se va a electroporación es muy importante. Si las células son muy planas, se deben utilizar concentraciones más altas de entonces el colorante de seguimiento (hasta 20 mg / ml para LY) y en tales casos, la pureza es incluso más importante que en las células con una forma más esférica 1. Además LY han empleado una gran variedad de otros colorantes o moléculas nonpermeant, ...

La aplicación de corriente eléctrica a una célula provoca la formación de poros en la membrana celular, mediante un proceso denominado electroporación. Los poros permiten el paso de una variedad de moléculas nonpermeant través de la membrana. El campo eléctrico puede ser controlada con precisión, de modo que los poros formados son muy pequeñas y volver a cerrar rápidamente, con la mínima perturbación a la fisiología celular. Curiosamente, las células adherentes pueden ser cultivadas en un portaobjetos de vidrio recubierto con óxido de indio-estaño conductora y transparente (ITO) y electroporación in situ, que está en la superficie donde crecen, sin ser individual para ser a electroporación en suspensión. Las células pueden crecer muy bien en esta superficie, y como están unidos y extendidos, la observación microscópica detallada es posible. Usando esta técnica, moléculas pequeñas nonpermeant se pueden introducir de forma instantánea y en esencialmente el 100% de las células, lo que hace esta técnica especialmente adecuada para estudios sobre la activación de un borradoronents de una vía después de la estimulación del ligando de un receptor (revisado en 1). La electroporación se ha utilizado principalmente para la introducción de ADN (también llamado electrotransfección). Sin embargo, la electroporación in situ puede ser valiosa para la introducción de una gran variedad de moléculas, tales como péptidos, oligonucleótidos 2-4, tales como ARN antisentido, oligonucleótidos de doble cadena de ADN de señuelo para inhibir la unión del factor de transcripción, o siRNA 3,5, 6, 7-10 nucleótidos radiactivos, proteínas 11 12 o profármacos 13. Después de la electroporación, las células pueden ser lisadas para los análisis bioquímicos o fijaron y se tiñeron con anticuerpos. El recubrimiento de ITO conductor es muy delgada, 800-1,000Å, de modo que el crecimiento celular no se ve perturbado por la diferencia de altura de las dos superficies, ya que las células crecen a través del borde del revestimiento conductor. Esto ofrece la ventaja de que no electropevaporaron células pueden ser cultivadas lado a lado con los electroporación, para servir como controles. El mismo enfoque se puede utilizar para el examen de la unión brecha, la comunicación intercelular (GJIC), como se describe en el vídeo. Gap cruces son canales que conectan los interiores de células adyacentes 14. Unión Gap, la comunicación intercelular juega un papel importante en la formación de tumores y metástasis, mientras que los oncogenes tales como Src suprimen GJIC 15,16. Para examinar GJIC un colorante fluorescente como el amarillo Lucifer (LY) a menudo se introduce en células cultivadas a través de microinyección o raspar de carga 17 y la difusión del colorante en las células vecinas se observa microscópicamente bajo iluminación de fluorescencia. Estas técnicas, sin embargo, invariablemente causan daño celular. Describimos ahora una técnica donde las células se cultivan en un portaobjetos de vidrio que está parcialmente recubierto con ITO 18. Un pulso eléctrico se aplica en la presencia de LY (u otros colorantes) cautilizando su penetración en las células que crecen en la parte conductora de la corredera, mientras que la migración de colorante a las células adyacentes no se observó microscópicamente electroporación través de la iluminación de fluorescencia. Para evitar células sensibles perturbadores que pueden tender a separarse de la monocapa, un conjunto fue diseñado que no requieren un electrodo que se coloca en la parte superior de las células para aplicar la corriente eléctrica 19. Este enfoque ofrece la posibilidad de cuantificar la GJIC en un gran número de células, sin ninguna perturbación detectable con el metabolismo celular, como se indica por la ausencia de un efecto sobre la duración de la fase G1 después de la estimulación de suero 12, el aumento de los niveles de los fos proteína protooncogén (Raptis, inédito) o dos quinasas asociadas con el estrés celular, el cerdo p38 o JNK / SAPK quinasa 1. Este enfoque hace posible el examen de la relación entre los niveles de expresión de oncogenes, transformación y GJIC 18, así como el efecto de Src y Stat3 sobre GJIC en una variedad de tipos de células, incluyendo células recién cultivadas a partir de muestras de tumor de pulmón 20-23. Además, en la electroporación in situ con la configuración descrita que carece de un electrodo superior ha sido empleado con éxito para la demostración de cierre de brecha de la salida a la diferenciación adipocítico, aunque la unión celular al sustrato se reduce en esa etapa 19,24.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td> <td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin Hidrocona de Calcio</td><td>(Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ternero de donante&nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat.# B15-008</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat.# A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroporación</td><td>Cell Projects Ltd Reino Unido: http://www.cellprojects.com/</td> <td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd Reino Unido</td><td>ACE-04-CC</td><td>4 pocillos</td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd Reino Unido</td><td>ACE-08-CC</td><td>8 pocillos</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Cell Projects Ltd Reino Unido</td><td>ACE-25-LY</td><td>Alta pureza</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>Adhesivo para células y tejidos</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Poli-Lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo funcional para gap junctional examen; la electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

En esta técnica, las células se cultivan en un portaobjetos de vidrio que está parcialmente recubierto con óxido de indio-estaño (ITO), un material transparente y conductor de electricidad. Una variedad de moléculas, como péptidos u oligonucleótidos, pueden introducirse en prácticamente el 100% de las células de una manera no traumática. Aquí, describimos cómo se puede utilizar para estudiar la comunicación intercelular de unión gap. El amarillo Lucifer penetra en las células cuando un pulso eléctrico, aplicado a la superficie conductora en la que están creciendo, hace que se formen poros a través de la membrana celular. Esto es electroporación. Las células que crecen en la superficie de vidrio no conductora inmediatamente adyacente a la región electroporada no absorben el amarillo Lucifer por electroporación, pero adquieren el tinte fluorescente a medida que se les pasa a través de uniones de separación que las unen a las células electroporadas. Los resultados de la transferencia de colorante de una célula a otra se pueden observar microscópicamente bajo iluminación de fluorescencia. Esta técnica permite una cuantificación precisa de la comunicación de las uniones entre huecos. Además, se puede utilizar para la introducción de péptidos u otras moléculas no permeadas, y la transferencia de pequeños péptidos electroporados a través de uniones gap para inhibir la señal en las células adyacentes no electroporadas es una poderosa demostración de inhibición de señal.

La Figura 2 muestra células de hígado de rata T51B epitelial 22, electroporación con LY y fotografiados bajo de fluorescencia (panel A y B), o de contraste de fase (C), la iluminación siguientes fijación y lavado. En el panel A, el borde de la zona de electroporación está marcado en rojo. El gradiente de la fluorescencia a la derecha de la línea roja indica la transferencia a través de uniones. En la figura 3A y 3B, la cuantificación de la brecha ocasiones la...

Esta presentación demuestra un método mediante el cual la electroporación de células adherentes y cultivadas se utiliza para el estudio de la comunicación intercelular y de unión, mientras las células crecen en un portaobjetos recubierto con óxido de indio-estaño conductor y transparente.

Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

La electroforesis es una técnica en la que se aplica una corriente eléctrica a células vivas para abrir poros transitorios en la membrana celular. A través de estos poros, colorantes y otras moléculas que normalmente no atraviesan la membrana celular pueden entrar en la célula; los poros se vuelven a cerrar rápidamente, sin causar daño a la célula. Describiremos cómo se pueden electropermeabilizar células adheridas mientras crecen sobre un portaobjetos recubierto parcialmente con un material eléctricamente conductor y transparente.El material es óxido de indio y estaño, y al conducir corriente eléctrica, abre poros que permiten la entrada de un colorante en la célula. Luego es posible examinar si las células tienen uniones en hendidura o no, y cuántas uniones en hendidura existen. Estos canales pequeños conectan los interiores de células adyacentes y permiten el paso de moléculas pequeñas. Desde hace mucho tiempo se reconoce que la comunicación mediante uniones en hendidura tiene diversas funciones importantes en la célula, incluyendo la transformación neoplásica y la metástasis.Bienvenido a esta presentación de proyectos celulares sobre cómo realizar la electroforesis de células adherentes utilizando el Insitu. Esta imagen muestra lo que seremos capaces de hacer: el colorante fluorescente de color amarillo se introdujo en células que crecen sobre un vidrio transparente y conductor. Hasta esta línea, la línea es más fácil de ver bajo contraste de fase.Aquí lo tiene. Puede observarse que el colorante ha difundido a través de las uniones en hendidura desde las células de la izquierda, que fueron cargadas con el colorante mediante electro poración, hacia las células de la derecha. Resultando en este gradiente de fluorescencia, las células son tryps.Se inizan y luego se transfieren a un tubo para centrifugar. Es muy importante que las células se distribuyan bien, ya que crecen en la cámara. Por esta razón, lo mejor es centrifugar las células para eliminar cualquier rastro de tripsina.El medio con trazas de tripsina se aspira, las células se resuspenden en aproximadamente un mililitro de medio de crecimiento y luego se siembran en la cámara. La pipeta contiene la suspensión celular; retire la tapa de la cámara y agregue las células gota a gota en la cámara para facilitar su transporte. La cámara se coloca en una placa de Petri de seis centímetros.La cámara vuelve al incubador para que las células crezcan. Las células sembradas se extenderán adecuadamente y crecerán hasta tocarse entre sí y formar uniones en hendidura. Cuando las células estén listas para la electroestimulación, configure el generador de pulsos in situ en las condiciones deseadas.Consulte el manual para obtener la descripción del sencillo proceso de configuración. Cuando se establezca el voltaje en el insitu, la luz roja del teclado se encenderá. Saque del baño de agua las dos botellas calentadas de DMEM sin calcio: una es DMEM sin calcio, pero con suero dializado, y la otra es DMEM.Sin calcio, tenga listas las pipetas cargadas más sueltas con colorante amarillo en el pipeteador. En lugar del suspiro, retire las células del incubador. Elimine el medio invirtiéndolo inicialmente en el vaso de lavado.Luego, aplique sobre el tejido una vez con DMEM sin calcio, sin intentar eliminar completamente todo el DMEM porque las células podrían secarse. Añada con cuidado el amarillo de luciferina sobre la barrera para no perturbar las células, pero con suficiente rapidez para que las células no se sequen. Utilice 200 microlitros para cada mitad de la cámara.Coloque la tapa en la cámara de insitu y luego cárguela en el portaobjetos. Asegúrese de que las lengüetas del extremo de la cámara encajen en las ranuras del portaobjetos empujándolo. Introduzca la cámara en el soporte de la cámara.Presione el botón de pulso en el teclado del generador de pulsos. El LED en el generador de pulsos y en el soporte de la cámara parpadeará en rojo durante el proceso de electrotransferencia y luego parpadeará en verde para indicar que el ciclo de inicio ha finalizado. Retire el deslizador hacia atrás debajo del soporte de la cámara y saque la cámara.Aspire la mayor parte del amarillo de luciferina para volver a utilizarlo, pero tenga cuidado de no secar las células. Añada DMEM sin calcio. Con suero dializado, el suero ayuda a que el poro cierre la cámara, que luego regresa al incubador para que ocurra la transferencia del amarillo de luciferina a través de las uniones en hendidura.El tiempo debe ser consistente de un experimento a otro. El estándar es tres minutos. Vierta el medio en el vaso de desecho.Añada solución fijadora de formaldehído al 4 % con una pipeta Pasteur o una pipeta, espere a temperatura ambiente durante al menos dos minutos. Vierta el formaldehído y enjuague varias veces. Las células quedan fijadas al vidrio con PBS, por lo que existe un bajo riesgo de que se desprendan durante el lavado.Para poder observar las células en contraste de fases, es importante colocar una lámina de cobertura encima de la cámara. Llene la cámara con PBS formando un menisco convexo. Evitando burbujas de aire, coloque la lámina de cobertura.No se preocupe si el PBS se desborda. Simplemente absorba el exceso de PBS con papel absorbente. Necesita un microscopio fluorescente invertido, preferiblemente con contraste de fases y un bloque de filtros para amarillo de luciferina. Con contraste de fases, busque el borde del área electroporada.Verá dos líneas bajo las células fluorescentes. En la mitad del portaobjetos se observará una fluorescencia intensa. La línea más cercana a las células brillantes corresponde al borde del área electroporada.Cualquier fluorescencia adicional se debe a la transferencia de lucifer yellow a través de uniones en hendidura. Por ejemplo, esta imagen de células epiteliales muestra células que han sido electroporadas en el lado izquierdo de la imagen, transfiriendo lucifer yellow a células vecinas no electroporadas, creando un gradiente de células luminiscentes que se extiende desde el borde del recubrimiento conductor hacia la derecha. Esta imagen muestra el mismo campo de células en contraste de fase.Tenga en cuenta que puede observar la línea X con mucha claridad. Se puede realizar manualmente una medida cuantitativa de la cantidad de transferencia por uniones en hendidura ocurrida, trabajando con las imágenes de fluorescencia y de contraste de fase de las células electroporadas. Las estrellas a lo largo del borde del área conductora se consideran células donantes.Se han electropermeabilizado y han captado el gen para el color amarillo. Transmiten luc para el color amarillo a las células vecinas de la derecha, las cuales lo pasan adelante. Aún más allá, en cantidades decrecientes.La proporción entre los puntos y las estrellas, 41 a ocho en este caso, puede generar un número para comparar en qué medida es la transferencia por uniones en hendidura en esta situación. 5,1 es el índice de uniones en hendidura. Una alternativa al marcado y conteo manual de células consiste en utilizar software de análisis de imágenes para medir las cantidades relativas de fluorescencia a lo largo del lado no electroporado del borde celular de una célula electroporada.Estas células no tienen uniones en hendidura. Aquí está el borde derecho del área electroporada. Observe que no hay un gradiente de fluorescencia, lo que indica la ausencia de uniones en hendidura bajo contraste de fase.Puede observarse claramente todas las células. Tenga en cuenta que la línea X también es claramente visible. En este ejemplo.Todas las células en la cámara fueron estimuladas con factor de crecimiento epidérmico EGF, y diez minutos después se fijaron y analizaron para detectar fosfo arc. Observe que las células teñidas a la derecha no han sido electroporadas, y las células a la izquierda hasta esta línea han sido electroporadas. Las células no electroporadas muestran tinción marrón con un anticuerpo contra fosfo irk y inmunoperoxidasa.Las células electropermeabilizadas no muestran tinción, ya que el péptido fosforilado electropermeabilizado ha bloqueado el dominio SSH2 de Grb2 e inhibido la fosforilación de EGF por IRK. Observe la región de tres a cuatro longitudes celulares a la derecha de la línea, donde las células no han sido electropermeabilizadas pero tampoco muestran tinción. Estas son células que han adquirido el péptido bloqueante de sus vecinas electropermeabilizadas mediante uniones en hendidura (gap junctions).Esta es la demostración más contundente posible de que la inhibición de la señal debe deberse al péptido y no puede ser un artefacto de la electroforesis. Dado que estas células no han sido electroportadas, este es el mismo campo mostrado en contraste de fases. Observe la ausencia de cualquier cambio en la morfología tras la electroforesis.En algunos pacientes, la comunicación por uniones en hendidura puede cuantificarse con precisión en una gran variedad de células cultivadas. La introducción de péptidos para interrumpir vías de señalización específicas es un enfoque potente para evaluar la relevancia en células vivas de interacciones proteína-proteína que se han identificado con proteínas purificadas. Esto puede ser el primer paso importante en el desarrollo de fármacos peptidómicos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Se describe aquí cómo realizar una microinyección de una sola célula de Lucifer amarillo para visualizar la comunicación celular a través de las uniones gap-en las células vivas, y proporcionar algunos consejos útiles. Esperamos que este documento ayudará a cada uno para evaluar el grado de acoplamiento celular debido a uniones gap funcionales. Todo lo descrito aquí podría ser, en principio, adaptado a otros colorantes fluorescentes con peso molecular inferior a 1.000 Daltons.

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