Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño

La electroporación es una técnica en la que se aplica una corriente eléctrica a las células vivas para abrir poros transitorios en la membrana celular. A través de estos poros, los tintes y otras moléculas que normalmente no atraviesan la membrana celular pueden entrar en la célula. Los poros se vuelven a cerrar rápidamente, sin dañar la célula. Describiremos cómo se pueden electroporar las células adheridas a medida que crecen en un portaobjetos que está recubierto en parte con material conductor de electricidad y transparente.

El material es óxido de indio y estaño, y a medida que conduce la corriente eléctrica, abre poros que permiten que un tinte ingrese a la célula. Entonces es posible examinar si las células tienen uniones de brecha o no, y cuántas uniones de brecha son pequeños canales que conectan el interior de las células vecinas y permiten el paso de moléculas pequeñas. Desde hace mucho tiempo se ha reconocido que la comunicación de la unión gap tiene una variedad de funciones importantes en la célula, incluida la transformación neoplásica y la metástasis.

Bienvenidos a esta presentación de proyectos de células sobre cómo realizar la electroporación de células adherentes utilizando el Insitu. Esta imagen muestra, lo que podremos hacer, que el tinte fluorescente suelto para el amarillo, se introdujo en células que crecían en un vidrio transparente y conductor. Hasta esta línea, la línea es más fácil de ver bajo contraste de fase.

Aquí está. Puede ver que el tinte se ha difundido a través de las uniones de los espacios de las células de la izquierda, que se han cargado con tinte por electroporación a las células de la derecha. El resultado es este gradiente de fluorescencia, las células son tripos.

Inizado y luego transferido a un tubo en centrífuga. Es muy importante que las células estén bien distribuidas a medida que crecen en la cámara. Por esta razón, es mejor centrifugar las células para eliminar cualquier rastro de tripsina.

El medio con trazas de tripsina se succiona, las células se resuspenden en aproximadamente un mililitro de medio de crecimiento y luego se colocan en la cámara. La pipeta contiene la suspensión de células, retire la tapa de la cámara y pipetee las células gota a gota en la cámara para que sea más fácil de transportar. La cámara se coloca en una placa de Petri de seis centímetros.

La cámara regresa a la incubadora para que las células crezcan. Las células plateadas se extenderán bien y crecerán para tocarse entre sí y formar uniones de separación. Cuando las celdas estén listas para el desfile eléctrico, configure el generador de pulsos in situ en las condiciones deseadas.

Consulte el manual para obtener una descripción del proceso de configuración simple. Cuando se establece el voltaje en el insitu, se encenderá la luz roja del teclado. Saca los dos frascos calentados de DMEM sin calcio del baño de agua: uno es DMEM sin calcio, pero con suero dializado, y el otro es DMEM.

Sin calcio, tenga las pipetas listas para cargar más sueltas para el amarillo en la pipeta. En lugar del suspiro, saca las células de la incubadora. Retire el medio invirtiéndolo en el vaso de precipitados de lavado al principio.

A continuación, aplícalo en el tejido, lávalo una vez con DMEM sin calcio, no intentes eliminar absolutamente todo el DMEM porque las células pueden secarse. Agregue el amarillo Lucifer cuidadosamente sobre la barrera para no perturbar las células, pero lo suficientemente rápido para que las células no se sequen. Utilice 200 microlitros para cada mitad de la cámara.

Coloque la tapa en la cámara in situ, luego cárguela en el control deslizante. Asegúrese de que las lengüetas de los extremos de la cámara encajen en las ranuras del control deslizante empujando el control deslizante. Inserte la cámara en el soporte de la cámara.

Presione el botón de pulso en el teclado del generador de pulsos. El LED del generador de impulsos y del soporte de la cámara parpadeará en rojo durante el proceso de electroporación y luego parpadeará en verde para indicar que el ciclo de inicio se ha completado. Tire del control deslizante hacia atrás debajo del soporte de la cámara y retire la cámara.

Aspire la mayor parte del amarillo Lucifer para volver a usarlo, pero tenga cuidado de no secar las células. Añadir DMEM sin calcio. Con el suero dializado, el suero ayuda al poroso a cerrar la cámara y regresa a la incubadora para que ocurra la transferencia de amarillo de Lucifer a través de las uniones de brecha.

El tiempo debe ser coherente de un experimento a otro. El estándar es de tres minutos. Vierta el medio en el vaso de precipitados.

Agregue una solución de fijación de formaldehído al 4% con una pasta o pipeta, espere a temperatura ambiente durante al menos dos minutos. Vierta el formaldehído y enjuague un par de veces. Con PBS, las celdas se fijan al vidrio, por lo que hay poco peligro de que se desprendan durante el lavado.

Para poder ver las células bajo contraste de fase, es importante colocar un cubreobjetos en la parte superior de la cámara. Llene la cámara con PBS formando un menisco orgulloso. Evitando burbujas de aire, coloque el cubreobjetos.

No se preocupe si el PBS se desborda, simplemente absorba el PBS adicional en el pañuelo. Necesita un microscopio fluorescente invertido, preferiblemente con contraste de fase y con un bloque de filtro para el amarillo Lucifer. Bajo contraste de fase, busque el borde del área electroporada.

Verá dos líneas debajo de las células de fluorescencia. En la mitad del portaobjetos estará fluorescente intensamente. La línea más cercana a las células incandescentes es el borde del área electroporada.

Cualquier fluorescencia más allá de eso se debe a la transferencia de amarillo de Lucer a través de las uniones de separación. Por ejemplo, esta imagen de células epiteliales muestra células que han sido electro en el lado izquierdo de la imagen, transfiriendo el amarillo de Lucifer a las células vecinas no electroporadas, creando un gradiente de células brillantes desde el borde de la capa conductora hacia la derecha. Esta imagen muestra el mismo marco de celdas bajo contraste de fase.

Ten en cuenta que puedes ver la línea X muy claramente. Se puede realizar manualmente una medida cuantitativa de la cantidad de transferencia de unión de brecha trabajando con las imágenes fluorescentes y de contraste de fase de las células electroporadas. Las estrellas a lo largo del borde del área conductora se consideran células donantes.

Han sido electroporados y se han recogido sueltos para obtener el amarillo. Pasan luc por amarillo a las celdas vecinas a la derecha, que lo transmiten. Todavía más en cantidades decrecientes.

La relación de los puntos con respecto a las estrellas 41 a ocho en este caso puede producir un número para comparar qué tan extensa es la transferencia de unión de brecha en este caso. 5.1 es el índice de unión de brecha. Una alternativa al marcado y conteo manual de celdas es utilizar software de análisis de imágenes para medir las cantidades relativas de brillo a lo largo del lado no elegido del borde de una celda electroporada.

Estas celdas no tienen uniones de separación. Aquí está el borde derecho del área electroporada. Tenga en cuenta que no hay gradiente de fluorescencia, lo que indica la ausencia de uniones de brecha bajo contraste de fase.

Puedes ver claramente todas las celdas. Tenga en cuenta que la línea X también es claramente visible. En este ejemplo.

Todas las células de la cámara se estimularon con el factor de crecimiento epidérmico EGF, y 10 minutos después se fijaron y sondearon para el arco de fosfo. Tenga en cuenta que las células teñidas de la derecha no se han electroporado, y las células de la izquierda hasta esta línea se han electroporado. Las células no electroporadas muestran una tinción marrón con un anticuerpo phospho irk e inmunoperoxidasa.

Las células electroporadas no muestran tinción ya que el péptido fosfo electroporado ha bloqueado el dominio SSH dos de agarre dos e inhibido la fosforilación de irk del EGF. Observe la región de tres a cuatro celdas de longitud a la derecha de la línea donde las celdas no eran electro pero no muestran tinción. Se trata de células que han adquirido péptido de bloqueo de sus vecinas electroporadas a través de uniones de brecha.

Esta es la demostración más poderosa posible de que la inhibición de la señal debe deberse al péptido y no puede ser un artefacto de la electroporación. Dado que estas celdas no están electroporadas, este es el mismo marco que se muestra bajo contraste de fase. Nótese la ausencia de cualquier cambio en la morfología después de la electroporación.

En algunos pacientes, la comunicación de la unión gap puede ser cuantitativa con precisión en una gran variedad de células cultivadas. La introducción de péptidos para interrumpir vías de señalización específicas es un enfoque poderoso para evaluar la relevancia en las células vivas de las proteínas, interacciones proteicas que se han identificado con proteínas purificadas. Este puede ser el primer paso importante en el desarrollo de fármacos de cúpula peptídica.