Un promedio de glicoproteína de la envoltura viral Espigas de Electron cryotomography reconstrucciones utilizando Jsubtomo

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las estructuras de los complejos de glicoproteínas presentes en las superficies de los virus con envoltura. Esto se logra localizando primero las partículas del virus en los volúmenes tomográficos que se han calculado previamente a partir de los datos de criomicroscopía electrónica. El segundo paso es crear dos modelos iniciales estadísticamente independientes de los complejos de glicoproteínas utilizando un subconjunto de datos definido manualmente.

A continuación, estos modelos se refinan y luego se utilizan para detectar automáticamente todos los complejos de glicoproteínas en las partículas del virus. El paso final es refinar la estructura del complejo de glicoproteínas utilizando el conjunto completo de datos. En última instancia, se utilizan herramientas de visualización molecular para interpretar la estructura final.

El análisis estructural tridimensional de estos picos de glicoproteínas es invaluable para comprender la patogénesis viral, así como para el diseño de fármacos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la cristalografía de rayos X, es que esta técnica permite resolver estructuras de proteínas de membrana en el entorno natural de la membrana. Esta técnica puede ayudar a abordar temas clave en biología estructural.

Por ejemplo, la estructura de muchos virus que contienen membranas. Aunque esta técnica puede proporcionar información sobre los complejos de glicoproteínas en estos virus, también se puede aplicar a otros sistemas, como las proteínas de membrana incorporadas en los liposomas. El procedimiento será demostrado por dos miembros de mi grupo, Slee y David Bittel.

Para comenzar, abra un archivo de autógrafo en B show. Elija partículas de virus manualmente en los gramos definiendo la coordenada central de una partícula de virus con la herramienta de selección de partículas. Repita este paso hasta que se hayan procesado todas las variantes.

Guarde las coordenadas del virus en un archivo de estrella. Proceda a repetir este proceso para todos los tomos. A continuación, ejecute J sub tomo py en modo de extracción Para extraer vari en subvolúmenes en archivos de volumen individuales, utilice los archivos de estrella guardados como archivos de entrada para generar dos modelos iniciales independientes.

Primero, abra el archivo de mapa de subvolumen ovárico. En el espectáculo B. Elija un subconjunto de picos en los subvolúmenes de Varian definiendo la coordenada central de un pico utilizando la herramienta de selección de partículas a la que se puede acceder a través de la ventana de la caja de herramientas.

Repita este paso hasta que se hayan procesado todos los picos claramente distintos. Guarde las coordenadas de los picos en un archivo de estrella. Repita este paso hasta que se hayan procesado aproximadamente 200 picos de glicoproteína.

Después de asignar vistas a los varians como se describe en el protocolo de texto, cree una máscara de espacio real usando J sub tomo. Crear mascarilla py. A continuación, genere una máscara de espacio recíproca utilizando J sub tomo create wedge mask py.

La máscara de espacio recíproco se utiliza para excluir regiones en la región de cuña faltante, resultante de la recopilación de datos tomográficos de un solo eje. A continuación, cree dos promedios iniciales utilizando J.Sub tomo create averages. PY utilizando un archivo de selección guardado como archivo de entrada.

El uso de la ización para reducir el ruido en los promedios iniciales es alinear y promediar iterativamente los dos modelos generados previamente con J sub tomo iterar oro PY. Los detalles de ambas etapas de este proceso se pueden encontrar en el protocolo de texto. Evalúe el grado de simetría en la estructura examinando el archivo de mapa filtrado de paso bajo resultante en kyira. Por ejemplo, si la espiga es un complejo trimérico, la triple simetría debería ser evidente.

Continuar con el refinamiento de la estructura como se detalla en el protocolo de texto. A continuación, genere semillas ubicadas uniformemente en la superficie de Varian para la coincidencia de plantillas y asigne un vector de vista inicial a las semillas mediante la ejecución de JVs py. Utilice los archivos de estrella generados anteriormente, ya que los archivos de entrada generan aproximadamente 1,5 veces más semillas que el número esperado de picos.

Este vector de vista aproxima la dirección de la espiga más cercana a cada punto de semilla. A continuación, genere dos promedios independientes de la superficie del virus como antes. A continuación, refina la posición de las semillas como se detalla en el protocolo de texto.

Por último, genere archivos de marcador com de los archivos de estrella de semilla refinados utilizando jvs.py. Examine las semillas abriendo los archivos CMM y los archivos de mapa de viriones asociados. En kyira.

Asegúrese de que las semillas refinadas estén alineadas correctamente en relación con la membrana del virus. Los marcadores refinados se pueden colorear en función de su correlación cruzada: los coeficientes localizan automáticamente todos los picos en los subvolúmenes de Varian utilizando la coincidencia de plantillas locales alrededor de las semillas refinadas, alinean y promedian los picos localizados, utilizan los promedios generados a partir de un subconjunto de picos seleccionados manualmente como plantillas iniciales. Los detalles adicionales de este proceso se pueden encontrar en el protocolo de texto para visualizar los resultados, abra la estructura refinada del pico en kyira para su visualización.

Proceda a ajustar las estructuras atómicas. A continuación, cree un modelo compuesto del virión utilizando j Subo Crear modelo DO py. Por último, abra el modelo compuesto para su visualización en kyira.

El modelo inicial se refinó utilizando 205 espigas seleccionadas manualmente. Triple. La simetría de la espiga más central era evidente sin aplicar ninguna simetría y se impuso en las rondas posteriores de refinamiento para detectar todas las espigas manualmente en las superficies de Varian. Se generaron 106 semillas para cada vion con un radio de 43 nanómetros y un espaciado de 20 grados, y sus posiciones se refinaron iterativamente en relación con la membrana.

Para calcular el promedio final se utilizaron los mejores parches de pico de glicoproteínas correlacionados. El promedio se resolvió a 35 angstrom. Reveló una estructura de espigas triméricas en el medio, además de alguna contribución de seis espigas vecinas.

Los modelos compuestos del varis calculados colocando la estructura en las posiciones conocidas revelaron la colocación de picos en la superficie de Varian. Ocasionalmente, se evidenciaban parches de espigas ordenados localmente. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar solo los mejores datos y verificar cuidadosamente todos los resultados intermedios.

Siguiendo este procedimiento, las estructuras de cristalografía de rayos X se pueden ajustar en el promedio final para obtener una visión más precisa de las interacciones proteína-proteína. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo promediar las estructuras de glicoproteínas de la envoltura viral usando J Omo.