Name: Un promedio de glicoproteína de la envoltura viral Espigas de Electron cryotomography reconstrucciones utilizando Jsubtomo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a promediar estructuras de glicoproteínas de envoltura viral mediante criotomografía electrónica y Jsubtomo. Este método computacional permite resolver complejos de membrana in situ con resolución de 35 angstroms.

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Este trabajo fue apoyado por la Academia de Finlandia (130750 y 218080 a J.T.H.), el Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z a T.A.B.), y por el MRC (MR/J007897/1 a J.T.H y T.A.B; MR/L009528/1 a T.A.B.).

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Los autores no tienen nada que revelar.

<html> El conocimiento de la estructura de espiga glicoproteína viral en la membrana del virión es esencial para la comprensión de la replicación del virus y el desarrollo de terapias para tratar y prevenir la infección. Electron crio-microscopía combinado con solo un promedio de partículas se ha convertido en el método más utilizado para resolver las estructuras de partículas de virus envueltos, incluyendo los picos de glicoproteína. Sin embargo, este método se limita a icosahedrally virus simétricas. Aquí, a través de la aplicación de la crio-tomografía de electrones y subtomogram promedio en Jsubtomo, hemos descrito un protocolo general para la determinación de los picos de glicoproteína en pleomórfico virus envueltos que no son susceptibles a otros métodos de biología estructurales actuales. Nuestros resultados representativos demuestran que la resolución de este método es suficiente para revelar conocimientos sobre arquitectura de dominio, oligomerización, y de mayor orden organización de espigas de glicoproteína en viriones intactos. jove_content &quot;&gt; El paso más crítico dentro de este protocolo está construyendo dos modelos de partida fiables que son estadísticamente independientes una de la otra. ejecución exitosa de este paso se supone que los picos de glicoproteína son suficientemente grandes y no está llena uno contra el otro con demasiada fuerza, de modo que los picos individuales puede ser reconocidos visualmente y manualmente recogidos en el tomografías, y dos modelos independientes en promedio. Si esto no es posible, dos modificaciones en el protocolo se puede intentar. Primera, dos modelos aleatorias independientes se pueden construir mediante la definición de primera dos subconjuntos aleatorios de subtomograms y luego promediando los subtomograms dentro de estos subconjuntos 30. segundo lugar, si una estructura de la espiga aislado ha sido derivado por otros medios, por ejemplo mediante cristalografía de rayos X, que puede ser utilizado como un modelo de partida. Sin embargo, se debe tener cuidado para bajos filtro de paso este modelo utilizando un punto de corte de baja resolución (50-70 Å), ya que los dos modelos resultantes en la próxima ronda de refinamiento voluntadestadísticamente independiente sólo más allá de esta resolución. Debido a esta advertencia, se recomienda el enfoque anterior. La resolución que se puede obtener a partir de este protocolo depende de cuatro factores principales: i. estrategia de recopilación de datos y la calidad de los datos de entrada, ii. número de los subtomograms, iii. exactitud de la alineación de los subtomograms, y iv. la heterogeneidad de las estructuras. Mientras que la primera y segunda limitación se puede superar en gran medida mediante el uso de detectores de alta de señal a ruido directa de electrones en combinación con tomografía CTF corregido y recolección de datos automatizado, la alineación de precisión se ve afectada más por el tamaño y forma de la estructura de la propia interés. Al aplicar este protocolo en pequeñas espigas que carecen de características destacadas, puede ser ventajoso para unir los fragmentos Fab a la punta para mejorar la precisión de la alineación y por lo tanto la resolución 31. Por último, si las estructuras para obtener el promedio de exposición múltiples conformaciones, sub-tomogrmétodos de clasificación am se pueden utilizar para promediar diferentes conformaciones separado. Con ese fin, Jsubtomo integra con el paquete Dynamo, ofreciendo clasificación poderosa subtomogram 9. El protocolo anterior es complementaria a la cristalografía de rayos X de las glicoproteínas virales aisladas. Estructuras cristalográficas pueden ensamblarse en promedios sub-tomografía para obtener la orientación precisa de la glicoproteína con respecto a la membrana del virión. La aplicación de esta metodología, sin duda, seguirá arrojar luz sobre la estructura del virus envuelto y biopatología.

Electron crio-tomografía es una técnica de imagen electrónica de crio-microscopía que permite el cálculo de una en tres dimensiones (3D) la reconstrucción de muestras biológicas complejas. Muestras adecuadas varían de complejos purificados macromoleculares 1, filamentos 2, vesículas recubiertas 3, y virus de membrana pleomórficas 4 a 5 células procariotas enteros e incluso zonas delgadas de células enteras eucariotas 6. Tras la recogida de datos de una serie de posiciones, volúmenes tomográficos 3D, o tomografías, puede calcularse utilizando varios paquetes de software establecidas, incluida Bsoft 7 y 8 IMOD. Dos aspectos inherentes al estudio de muestras biológicas por el límite de la crio-tomografía de electrones de la interpretación biológica de los volúmenes correspondientes tomográficas. En primer lugar, debido a la dosis de electrones limitada que se puede aplicar a materiales biológicos antes de introducir el daño por radiación significativa, signa-l-a ruido en los datos tomográficos son típicamente muy baja. En segundo lugar, como resultado de la geometría de inclinación limitado de la muestra durante la recolección de datos, algunos puntos de vista del objeto permanecen ausente, dando lugar a un denominado artefacto &#39;falta de cuña&#39; en el volumen tomográfica. Sin embargo, ambas de estas limitaciones se pueden superar si el volumen tomográfica contiene la repetición de estructuras idénticas, tales como complejos macromoleculares, que pueden ser promediados con éxito 9-12. Antes de un promedio de estructuras de reconstrucciones tomograma, objetos de interés deben ser encontrados y alineados con la misma orientación. Localización de tales estructuras se puede lograr mediante la correlación cruzada de una estructura de plantilla en el volumen tomográfica utilizando un enfoque a menudo referido como plantilla de juego 13. La plantilla utilizada en este proceso de correspondencia se puede derivar de la crio-microscopía de electrones de electrones o crio-tomografía combinado con reconstrucción 3D, o puede ser un mapa de densidad simulado desdeuna estructura atómica. Varios paquetes computacionales se han desarrollado para llevar a cabo estas tareas 11. Promediando de espigas de glicoproteína de membrana de virus, como el VIH-1, ha sido un enfoque particularmente exitoso para el estudio de su estructura 14-16. La comprensión de la estructura es integral tanto para revelar las bases moleculares de las interacciones virus-huésped y guiar el desarrollo del diseño y la vacuna antiviral. Mientras que la cristalografía macromolecular es la técnica de elección para alta resolución (generalmente mejor que 4 Å) análisis estructural de las glicoproteínas virales individuales y sus complejos, las estructuras de rayos X resultantes de este método son de proteínas aisladas del ambiente membranosa natural sobre el virión . Por lo tanto, los detalles importantes, tales como la arquitectura más alto orden de glicoproteínas virales, en el contexto del virión, siguen siendo deficiente. Por otro lado, electrón crio-microscopía y la reconstrucción de una sola partículade la totalidad de los virus envueltos se limita a viriones con simetría icosaédrica 17,18. Por lo tanto cryotomography Electron combinado con la alineación sub-volumen ha surgido como una técnica complementaria que permite el estudio de los picos de glicoproteína de forma irregular, virus pleomórficos in situ. Hemos desarrollado un software llamado Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) para la detección, la alineación, y un promedio de sub-volúmenes tomográficos. Jsubtomo se ha utilizado en la determinación de la estructura de un número de estructuras celulares y virales 19-26. Aquí, presentamos un protocolo detallado, que permite la determinación de la superficie viral estructuras pico. Para evitar un exceso de refinamiento de estructuras promediadas mediante la correlación de ruido, el esquema de refinamiento &#39;estándar de oro&#39; se adoptó 10,27. Por último, se discuten las estrategias para la visualización e interpretación de los resultados típicos.

<table><tbody><tr><td>Jsubtomo (ver 1.3.1)</td><td>Universidad de Oxford</td><td>n/a</td><td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td></tr><tr><td>Bsoft (ver 1.8.7)</td><td>NIAMS, NIH</td><td>n/a</td><td>bsoft.ws</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF</td><td>n/a</td><td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td></tr></tbody></table>

un promedio de glicoproteína de la envoltura viral espigas de electron cryotomography reconstrucciones utilizando jsubtomo

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Los virus envueltos utilizan glicoproteínas de la membrana en su superficie para mediar en la entrada en las células huésped. Análisis estructural tridimensional de estas glicoproteína &#39;picos&#39; es a menudo un reto técnico, pero importante para la comprensión de la patogénesis viral y en el diseño de fármacos. Aquí, un protocolo se presenta para la determinación estructural repunte viral a través de un promedio de cálculo de los datos de la crio-tomografía electrónica. Electron crio-tomografía es una técnica en la microscopía electrónica utilizada para obtener reconstrucciones tridimensionales de tomografía de volumen, o tomografías, de muestras biológicas pleomórficas, como los virus de la membrana en un estado casi nativo, congelado-hidratado. Estas tomografías revelan estructuras de interés en tres dimensiones, aunque a baja resolución. Promediado Computacional de sub-volúmenes, o sub-tomografías, es necesario obtener una resolución más alta detalle de repetir motivos estructurales, tales como puntas de glicoproteína viral. Un enfoque computacional detallada para aliGning y un promedio de sub-tomografías utilizando el paquete de software Jsubtomo se perfila. Este enfoque permite la visualización de la estructura de espigas glicoproteína viral a una resolución en el intervalo de 20-40 Å y el estudio del estudio de las interacciones de orden superior-pico-a pico sobre la membrana del virión. Los resultados típicos se presentan para el virus de Bunyamwera, un virus con envuelta de la familia Bunyaviridae. Esta familia es un grupo estructuralmente diverso de patógenos que suponen una amenaza para la salud humana y animal.

Se demuestra la aplicación de la promediación de flujo de trabajo sub-tomografía descrito anteriormente para el complejo de glicoproteína de la envoltura del virus de Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) usando un conjunto de datos previamente publicados 24. Parámetros de recolección y refinamiento de datos se enumeran en la Tabla 1. Una tomografía representativo se muestra en la Figura 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parámetro (unidad) </td><td> Valor </td></tr><tr><td> La recolección de datos </td><td></td></tr><tr><td> Voltaje (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Ampliación calibrada (X) </td><td> 111000 </td></tr><tr><td> Tamaño de píxel (Å) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Dosis estimada (e - / Å 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (micras) </td><td> 4,0-4,5 </td&gt; </tr><tr><td> Primera cero CTF (A) un </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Rango de inclinación (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> Muestreo Inclinación (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> De datos y el refinamiento </td><td></td></tr><tr><td> Las tomografías </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Los viriones </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Semillas por virión </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Número total de semillas </td><td> 3074 </td></tr><tr><td> Picos detectados </td><td> 1346 </td></tr><tr><td> Pinchos después de la eliminación de superposiciones </td><td> 1401 </td></tr><tr><td> Pinchos después de la selección basada correlación cruzada </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> Espigas incluidos en el promedio final </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> Simetría </td><td> C3 </td></tr><tr><td> Muestreo angular (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Resoluciónrango utilizado en el refinamiento (Å) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Estimación final de resolución (A) b </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: la recopilación de datos y estadísticas Bunyamwera refinamiento. un CTF, función de transferencia de contraste. b Calculado usando Fourier correlación shell entre dos estructuras de forma independiente refinados en un umbral de 0.143. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2:. Rebanada a través de una tomografía de los viriones Bunyamwera Varias vistas laterales pico evidente en la periferia de cada virión se indican con flechas. La tomografía ha sido filtrado de paso bajo a 60 Å. Barra de escala 100 nm. En primer lugar, estamos perfeccionando un modelo inicial con 205 picos recogidos manualmente ( <strong&gt; Figura 3). La simetría de tres veces del centro-pico más era evidente sin aplicar ninguna simetría (Figura 3B) y se impuso en las rondas posteriores de refinamiento (Figura 3C). Para la detección de todos los picos de forma automática en las superficies de virión, se generaron 106 semillas para cada virión en el radio de 43 nm y el espaciamiento de 20 grados (Figura 4A) y iterativamente refinado sus posiciones con respecto a la membrana (Figura 4B). <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: El perfeccionamiento de la estructura inicial de la plantilla. (A) cilíndrica promedio (C100) plantilla construida a partir de las posiciones definidas manualmente de picos. (B) densidad promediada después de cinco rondas de refinamiento sin ninguna simetría (C1) impuso muestra una espiga con triplecaracterísticas simétricas. La resolución del modelo es de 48 Å. (C) Promedio de la espiga se resolvió en 41 Å después de cinco rondas de refinamiento con simetría triple. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4:. Refinamiento de las semillas AB) Un subconjunto de las semillas antes (A) y después (B) el refinamiento se muestran en una densidad virión en la Figura 2 Semillas en (B) han sido codificados por color con base en el respectivo cruzada. coeficientes de correlación (Azules, baja correlación; rojo, alta correlación). Los mejores parches correlacionar glicoproteína pico (superior al 75% después de la eliminación de superposiciones; ~ 1,000 picos) se utilizaron para calcular el promedio final. El promedio se resolvió a 35 Å de resolución (Figura 5). Se reveló una estructura trimérica pico en el medio, enAdemás de alguna contribución de seis picos vecinos. Modelos de compuestos de los viriones, calculados mediante la colocación de la estructura en las posiciones conocidas, revelaron colocación de los picos en la superficie del virión (Figura 6A). Ocasionalmente, los parches ordenados localmente de picos eran evidentes (Figura 6B). <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5: Estructura de refinado de un parche de la capa de glicoproteína pico después de la adaptación de la plantilla. (AB) Dos mapas &#39;incluso&#39; y &#39;extraño&#39;, reconstruido a partir de dos mitades de los datos se muestran. Los dos mapas muestran un notable grado de similitud, la verificación de la validness del enfoque. La orientación alrededor del eje largo pico es diferente ya que los dos mapas se han reconstruido totalmente independientemente uno de otro. (C) Media de los dos mapas se muestra enla resolución final de 35 Å. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6: Colocación de los picos en el virión Bunyamwera. (A) Modelo Compuesto de un virión. Ver vectores (palos) indican las orientaciones de los picos. Los colores indican la correlación cruzada entre cada pico y la estructura de la plantilla (azul, baja correlación; rojo, alta correlación). (B) Un primer plano de un parche ordenada de los picos.

Se presenta un enfoque para determinar las estructuras de los complejos de glicoproteínas de la membrana viral utilizando una combinación de criotomografía electrónica y promediado de subtomografía con el paquete computacional Jsubtomo.

Un promedio de glicoproteína de la envoltura viral Espigas de Electron cryotomography reconstrucciones utilizando Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las estructuras de los complejos de glicoproteínas presentes en las superficies de los virus envueltos. Esto se logra primero localizando las partículas virales en los volúmenes tomográficos que previamente se han calculado a partir de datos de microscopía electrónica criogénica. El segundo paso consiste en crear dos modelos iniciales estadísticamente independientes de los complejos de glicoproteínas utilizando un subconjunto de datos definido manualmente.A continuación, estos modelos se perfeccionan y luego se utilizan para detectar automáticamente todos los complejos de glicoproteínas en las partículas virales. El paso final consiste en refinar la estructura del complejo de glicoproteínas utilizando el conjunto completo de datos. Finalmente, se emplean herramientas de visualización molecular para interpretar la estructura final.El análisis estructural tridimensional de estas espículas de glicoproteínas es invaluable para comprender la patogénesis viral, así como para el diseño de fármacos. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la cristalografía de rayos X, es que permite resolver estructuras de proteínas de membrana en su entorno natural de membrana. Esta técnica puede ayudar a abordar temas clave en biología estructural.Por ejemplo, la estructura de muchos virus que contienen membranas. Aunque esta técnica puede proporcionar información sobre complejos de glicoproteínas en estos virus, también puede aplicarse a otros sistemas, como proteínas de membrana incorporadas en liposomas. El procedimiento será demostrado por dos miembros de mi grupo, Slee y David Bittel.Para comenzar, abra un archivo de autograma en B show. Seleccione manualmente las partículas virales en las micrografías definiendo la coordenada central de una partícula viral mediante la herramienta de selección de partículas. Repita este paso hasta que todas las variantes hayan sido procesadas.Guarde las coordenadas del virus en un archivo star. Proceda a repetir este proceso para todos los tomogramas. A continuación, ejecute J sub tomo py en modo de extracción para extraer las subunidades en archivos de volumen individuales; utilice los archivos star guardados como archivos de entrada para generar dos modelos iniciales independientes.Primero, abra el archivo del mapa de subvolumen ovárico. En B se muestra. Seleccione un subconjunto de picos en los subvolúmenes Varian definiendo la coordenada central de un pico mediante la herramienta de selección de partículas, accesible a través de la ventana de la caja de herramientas.Repita este paso hasta que se hayan procesado todas las espículas claramente distintas. Guarde las coordenadas de las espículas en un archivo star. Repita este paso hasta que se hayan procesado aproximadamente 200 espículas de glicoproteínas.Después de asignar vistas a las variaciones según se describe en el protocolo del texto, cree una máscara en el espacio real usando J sub tomo. Cree máscara py. Luego, genere una máscara en el espacio recíproco usando J sub tomo create wedge mask py.La máscara del espacio recíproco se utiliza para excluir regiones en la zona del cuña perdida, resultante de la recopilación de datos tomográficos de un solo eje. A continuación, cree dos promedios iniciales utilizando J.Sub tomo para crear promedios. PY utilizando un archivo de selección guardado como archivo de entrada.Utilice la ización para reducir el ruido en los promedios iniciales mediante alineación iterativa y promediado de los dos modelos generados previamente con J sub tomo iterate gold PY. Los detalles de ambas etapas de este proceso se encuentran en el protocolo escrito. Evalúe el grado de simetría en la estructura examinando el archivo de mapa filtrado de baja frecuencia resultante en kyira. Por ejemplo, si la espiga es un complejo trimérico, debería observarse simetría triple.Continúe el refinamiento de la estructura según se detalla en el protocolo del texto. A continuación, genere semillas ubicadas de manera uniforme sobre la superficie de Varian para la coincidencia de plantillas y asigne un vector de vista inicial a las semillas ejecutando JVs py. Utilice los archivos star generados previamente como archivos de entrada para generar aproximadamente 1,5 veces más semillas que el número esperado de espículas.Este vector de vista aproxima la dirección del pico más cercano a cada punto semilla. A continuación, genere dos promedios independientes de la superficie del virus como antes. Luego refine la posición de las semillas según se detalla en el protocolo escrito.Finalmente, genere archivos marcadores com a partir de los archivos star de semillas refinadas utilizando jvs.py. Examine las semillas abriendo los archivos CMM y los archivos de mapa de viriones asociados. En kyira.Asegúrese de que las semillas refinadas estén alineadas correctamente con respecto a la membrana viral. Los marcadores refinados pueden colorearse según sus coeficientes de correlación cruzada. Localice automáticamente todas las espigas en los subvolúmenes Varian mediante coincidencia de plantillas local alrededor de las semillas refinadas, alinee y promedie las espigas localizadas, y utilice los promedios generados a partir de un subconjunto de espigas seleccionadas manualmente como plantillas iniciales. Se pueden encontrar más detalles sobre este proceso en el protocolo de texto. Para visualizar los resultados, abra la estructura refinada de la espiga en Kyira para su visualización.Proceda a ajustar las estructuras atómicas. Luego, cree un modelo compuesto del virión utilizando j Subo Create model DO py. Finalmente, abra el modelo compuesto para su visualización en kyira.El modelo inicial se refinó utilizando 205 picos seleccionados manualmente. Tres veces. La simetría del pico más central fue evidente sin aplicar ninguna simetría y se impuso en las rondas posteriores de refinamiento para detectar todos los picos manualmente en las superficies de Varian. Se generaron 106 semillas para cada vion en un radio de 43 nanómetros y con un espaciado de 20 grados, y sus posiciones se refinaron iterativamente con respecto a la membrana.Se utilizaron los parches de espículas glucoproteicas con mejor correlación para calcular el promedio final. El promedio se resolvió a una resolución de 35 angstroms. Reveló una estructura de espícula trimérica en el centro, además de algunas contribuciones provenientes de seis espículas vecinas.Los modelos compuestos de las varis se calcularon colocando la estructura en las posiciones conocidas que revelaron la ubicación de las espigas sobre la superficie de la Varian. En ocasiones, eran evidentes parches localmente ordenados de espigas. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar únicamente los mejores datos y verificar cuidadosamente todos los resultados intermedios.Tras seguir este procedimiento, las estructuras de cristalografía de rayos X pueden ajustarse en el promedio final para obtener una vista más precisa de las interacciones proteína-proteína. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo promediar estructuras de glicoproteínas virales de envoltura utilizando J Omo.

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Investigación

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