Un promedio de glicoproteína de la envoltura viral Espigas de Electron cryotomography reconstrucciones utilizando Jsubtomo

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las estructuras de los complejos de glicoproteínas presentes en las superficies de los virus envueltos. Esto se logra primero localizando las partículas virales en los volúmenes tomográficos que previamente se han calculado a partir de datos de microscopía electrónica criogénica. El segundo paso consiste en crear dos modelos iniciales estadísticamente independientes de los complejos de glicoproteínas utilizando un subconjunto de datos definido manualmente.

A continuación, estos modelos se perfeccionan y luego se utilizan para detectar automáticamente todos los complejos de glicoproteínas en las partículas virales. El paso final consiste en refinar la estructura del complejo de glicoproteínas utilizando el conjunto completo de datos. Finalmente, se emplean herramientas de visualización molecular para interpretar la estructura final.

El análisis estructural tridimensional de estas espículas de glicoproteínas es invaluable para comprender la patogénesis viral, así como para el diseño de fármacos. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la cristalografía de rayos X, es que permite resolver estructuras de proteínas de membrana en su entorno natural de membrana. Esta técnica puede ayudar a abordar temas clave en biología estructural.

Por ejemplo, la estructura de muchos virus que contienen membranas. Aunque esta técnica puede proporcionar información sobre complejos de glicoproteínas en estos virus, también puede aplicarse a otros sistemas, como proteínas de membrana incorporadas en liposomas. El procedimiento será demostrado por dos miembros de mi grupo, Slee y David Bittel.

Para comenzar, abra un archivo de autograma en B show. Seleccione manualmente las partículas virales en las micrografías definiendo la coordenada central de una partícula viral mediante la herramienta de selección de partículas. Repita este paso hasta que todas las variantes hayan sido procesadas.

Guarde las coordenadas del virus en un archivo star. Proceda a repetir este proceso para todos los tomogramas. A continuación, ejecute J sub tomo py en modo de extracción para extraer las subunidades en archivos de volumen individuales; utilice los archivos star guardados como archivos de entrada para generar dos modelos iniciales independientes.

Primero, abra el archivo del mapa de subvolumen ovárico. En B se muestra. Seleccione un subconjunto de picos en los subvolúmenes Varian definiendo la coordenada central de un pico mediante la herramienta de selección de partículas, accesible a través de la ventana de la caja de herramientas.

Repita este paso hasta que se hayan procesado todas las espículas claramente distintas. Guarde las coordenadas de las espículas en un archivo star. Repita este paso hasta que se hayan procesado aproximadamente 200 espículas de glicoproteínas.

Después de asignar vistas a las variaciones según se describe en el protocolo del texto, cree una máscara en el espacio real usando J sub tomo. Cree máscara py. Luego, genere una máscara en el espacio recíproco usando J sub tomo create wedge mask py.

La máscara del espacio recíproco se utiliza para excluir regiones en la zona del cuña perdida, resultante de la recopilación de datos tomográficos de un solo eje. A continuación, cree dos promedios iniciales utilizando J.Sub tomo para crear promedios. PY utilizando un archivo de selección guardado como archivo de entrada.

Utilice la ización para reducir el ruido en los promedios iniciales mediante alineación iterativa y promediado de los dos modelos generados previamente con J sub tomo iterate gold PY. Los detalles de ambas etapas de este proceso se encuentran en el protocolo escrito. Evalúe el grado de simetría en la estructura examinando el archivo de mapa filtrado de baja frecuencia resultante en kyira. Por ejemplo, si la espiga es un complejo trimérico, debería observarse simetría triple.

Continúe el refinamiento de la estructura según se detalla en el protocolo del texto. A continuación, genere semillas ubicadas de manera uniforme sobre la superficie de Varian para la coincidencia de plantillas y asigne un vector de vista inicial a las semillas ejecutando JVs py. Utilice los archivos star generados previamente como archivos de entrada para generar aproximadamente 1,5 veces más semillas que el número esperado de espículas.

Este vector de vista aproxima la dirección del pico más cercano a cada punto semilla. A continuación, genere dos promedios independientes de la superficie del virus como antes. Luego refine la posición de las semillas según se detalla en el protocolo escrito.

Finalmente, genere archivos marcadores com a partir de los archivos star de semillas refinadas utilizando jvs.py. Examine las semillas abriendo los archivos CMM y los archivos de mapa de viriones asociados. En kyira.

Asegúrese de que las semillas refinadas estén alineadas correctamente con respecto a la membrana viral. Los marcadores refinados pueden colorearse según sus coeficientes de correlación cruzada. Localice automáticamente todas las espigas en los subvolúmenes Varian mediante coincidencia de plantillas local alrededor de las semillas refinadas, alinee y promedie las espigas localizadas, y utilice los promedios generados a partir de un subconjunto de espigas seleccionadas manualmente como plantillas iniciales. Se pueden encontrar más detalles sobre este proceso en el protocolo de texto. Para visualizar los resultados, abra la estructura refinada de la espiga en Kyira para su visualización.

Proceda a ajustar las estructuras atómicas. Luego, cree un modelo compuesto del virión utilizando j Subo Create model DO py. Finalmente, abra el modelo compuesto para su visualización en kyira.

El modelo inicial se refinó utilizando 205 picos seleccionados manualmente. Tres veces. La simetría del pico más central fue evidente sin aplicar ninguna simetría y se impuso en las rondas posteriores de refinamiento para detectar todos los picos manualmente en las superficies de Varian. Se generaron 106 semillas para cada vion en un radio de 43 nanómetros y con un espaciado de 20 grados, y sus posiciones se refinaron iterativamente con respecto a la membrana.

Se utilizaron los parches de espículas glucoproteicas con mejor correlación para calcular el promedio final. El promedio se resolvió a una resolución de 35 angstroms. Reveló una estructura de espícula trimérica en el centro, además de algunas contribuciones provenientes de seis espículas vecinas.

Los modelos compuestos de las varis se calcularon colocando la estructura en las posiciones conocidas que revelaron la ubicación de las espigas sobre la superficie de la Varian. En ocasiones, eran evidentes parches localmente ordenados de espigas. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar únicamente los mejores datos y verificar cuidadosamente todos los resultados intermedios.

Tras seguir este procedimiento, las estructuras de cristalografía de rayos X pueden ajustarse en el promedio final para obtener una vista más precisa de las interacciones proteína-proteína. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo promediar estructuras de glicoproteínas virales de envoltura utilizando J Omo.