Un ensayo de comportamiento simple para Pruebas de función visual en

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función visual de las ranas mediante el registro del tiempo que el animal pasa en la mitad del tanque de prueba que está cubierta de negro. Esto se logra primero criando las ranas hasta las etapas 45 a 50. El segundo paso consiste en preparar un tanque dividido en mitades, una negra y otra blanca, junto con una cámara para el ensayo de comportamiento.

A continuación, coloque un segundo tanque con una larva de rana en el tanque exterior. Para cada registro de larva de rana, anote el comportamiento guiado por la visión mientras se cambia el fondo de su entorno. El paso final consiste en realizar una exsudación retinal en las larvas de rana y luego repetir el ensayo de comportamiento.

En última instancia, los datos de este ensayo sencillo y económico se utilizan para demostrar que las larvas tienen preferencia por nadar en un lado del tanque frente al otro, bajo pruebas de visión fototópica. La principal ventaja de usar este método frente a otras técnicas como la respuesta cinética óptica o el ensayo de flexión de la cola, es que se trata de un método económico y sencillo que emplea equipo fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios de opus. Para preparar las larvas, primero obtenga embriones fertilizados de Xenopus, coloque en soluciones de Ringer modificadas de Marc o MMR diluidas por un factor de 10 en placas de Petri de 60 milímetros con 50 microgramos por mililitro.

Coloque embriones del estadio de blástula al estadio de placa neural con antibiótico gentamicina. Incube los estadios dos a 15 a 18 grados Celsius en las placas de Petri. Una vez que los embriones alcancen el estadio de copa neuromastónica de aproximadamente 27 a 30, transfórmelos a MMR 0,1 X sin antibióticos para permitir el crecimiento bacteriano intestinal.

Cuando los renacuajos alcancen la etapa de alimentación, alrededor de la etapa 45, transfiérelos a placas de Petri de 100 milímetros con MMR 0,1 X. Al día siguiente, aliméntelos con el sobrenadante de polvo de ortiga. Después de una semana en la placa de Petri de 100 milímetros, llene un tanque de medio galón con agua para ranas.

Traslade los animales al tanque y continúe con el horario de alimentación con el sobrenadante de polvo de ortiga, pero cambie el agua solo dos o tres veces por semana. Cuando los animales estén en tanques de medio galón, manténgalos en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con la luz encendiéndose a las 6:00 AM. Antes de la prueba, coloque el tanque de medio galón con los sujetos de prueba sobre una superficie blanca durante la noche, al menos 12 horas antes del ensayo. El ensayo de comportamiento debe realizarse en un área tranquila y con poco tránsito, con iluminación fluorescente estándar.

Prepare dos tanques de prueba de medio galón para anidar en las esquinas exteriores de lo que será el tanque interior. Utilice un rotulador Sharpie para marcar la línea de agua a cinco centímetros por encima del fondo. Asimismo, para el tanque interior, identifique cualquier irregularidad en su interior.

Llénalos con un compuesto inerte para evitar que las ranas en estado de renacuajo permanezcan en ellos. Ahora dirija la atención al segundo tanque exterior. Para el siguiente paso, obtenga cinta aislante negra y papel de seda blanco.

Utilice la cinta para cubrir el exterior de una mitad del tanque y el papel de seda para cubrir el exterior de la otra, como se muestra aquí. Una vez preparados los tanques, configure una mesa giratoria de inoculación y coloque los tanques anidados sobre ella. Coloque un trípode y una cámara web de manera que la cámara pueda obtener imágenes del interior de los tanques desde arriba.

Conecte la cámara web a una computadora con software de captura y reproducción de video. Encienda la cámara y prepárese para realizar una nueva grabación de video. A continuación, coloque un paño de algodón ligero sobre la cámara y los tanques.

Para reducir las señales externas para los renacuajos, utilice un fotómetro y verifique que la luminancia bajo la tela esté entre 35 y 50 bujías por metro cuadrado. Comience el ensayo de comportamiento recuperando el tanque interno de pruebas. Llénelo con agua para ranas hasta la marca de cinco centímetros.

Utilice una red para transferir un animal desde su recipiente de medio galón al tanque interno de prueba en el ordenador. Asegúrese de que el software de grabación esté abierto y grabando el área de prueba para fines de registro. Escriba el nombre del animal, la fecha y la hora en un trozo de papel.

Coloque esto debajo de la cámara para la grabación. Una vez hecho esto, configure un temporizador para dos minutos. A continuación, oriente el tanque externo sobre la plataforma giratoria, de modo que el lado negro quede a la derecha.

Ahora coloque el tanque de prueba dentro del tanque externo. En el área de grabación, cierre la cortina y utilice la pantalla del ordenador para verificar la orientación del tanque externo. Asegúrese de que se esté grabando el video e inicie el cronómetro.

Cuando suene el temporizador, mantenga la cortina en su posición y retire el tanque interno de prueba. A continuación, gire el tanque externo 180 grados de modo que el lado negro quede ahora a la izquierda. Vuelva a colocar el tanque de prueba en el tanque externo e inicie el temporizador de dos minutos.

De nuevo, retire el tanque interno. Gire el tanque externo 180 grados y sustituya el tanque interno cada dos minutos durante un total de 10 veces. Al finalizar, detenga la grabación de video.

Devuelva la rana a su tanque de medio galón. Prepare un microscopio para realizar la exsudación de retinol. Llene una placa de Petri de 60 milímetros con 1 % aros fundido en 0,1 XMMR y deje que solidifique.

Retire un pequeño trozo rectangular del aros del tamaño del renacuajo. Cuando esté listo para continuar, recupere el animal de prueba y colóquelo en Trica al 0,02 %. Continúe cuando no responda a un pellizco en la cola con pinzas número tres.

Luego, transfiera el animal al recipiente. Proceda a montar la placa de Petri en el microscopio. Prepárese para sujetar al animal con pinzas en un lado.

En el lado opuesto, utilice una aguja de calibre 25 para perforar la piel detrás de la región dorsal del ojo en un ángulo de 45 grados; cuidadosamente introduzca la pinza número cinco en el orificio y corte el nervio óptico evitando la vena adyacente. Gire el nervio hacia un lado, retire la pinza tras la cirugía. Recupere al animal colocándolo en una placa de Petri de 100 milímetros con 0,7 XMMR y 50 microgramos por mililitro.

Gentamicina durante 20 minutos. Después, transfiera la renacuaja a un tanque de recuperación con agua para ranas. Coloque el tanque sobre una superficie blanca en preparación para la prueba.

Deje que el animal descanse durante la noche. A la mañana siguiente, utilice el ensayo conductual para evaluar la función visual. Esta película muestra datos representativos del experimento.

A la izquierda se muestran los animales antes de la cirugía; a la derecha, los mismos animales después de que se han seccionado los axones retinianos de ambos ojos. Esto se indica mediante el esquema en las esquinas inferiores. Se agitó el agua para mostrar que no se ha añadido nada que repele a los animales del lado negro o los atrae hacia el lado blanco.

Las renacuajas antes de la cirugía responden al color de fondo en menos de 30 segundos, mientras que las renacuajas ciegas nadan sin rumbo por el tanque. Este gráfico muestra el porcentaje de tiempo pasado en las regiones blanca y negra para un solo animal bajo tres condiciones. Primero, se observó al animal antes de cualquier cirugía utilizando el ensayo.

En dos días consecutivos después de seccionar el nervio óptico derecho, se observó su comportamiento durante dos días de pruebas. Finalmente, tras seccionar ambos nervios ópticos, hubo dos días más de observación con el ensayo. El animal pasó más días en el lado blanco del tanque cuando al menos un nervio óptico estaba intacto.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar la visión de las ranas en estado de renacuajo utilizando reactivos y equipo sencillos que se encuentran en la mayoría de los laboratorios de ranas. Buena suerte con sus experimentos.