Un ensayo de comportamiento simple para Pruebas de función visual en Xenopus laevis

El objetivo general de este procedimiento es probar la función visual de los renacuajos registrando la cantidad de tiempo que el animal pasa en la mitad del tanque de prueba que está cubierto de negro. Esto se logra criando primero renacuajos a las etapas 45 a 50. El segundo paso es configurar un tanque mitad negro, mitad blanco junto con una cámara para el ensayo de comportamiento.

A continuación, coloque un segundo tanque con un renacuajo en el tanque exterior. Para cada registro de renacuajo, se cambia el comportamiento guiado por la visión como fondo en su entorno. El paso final es realizar una exsodomía de retina en los renacuajos y luego repetir el ensayo de comportamiento.

En última instancia, los datos de este ensayo simple y económico se utilizan para mostrar que los renacuajos prefieren nadar en un lado del tanque sobre el otro, bajo pruebas de visión fotográfica. La principal ventaja de utilizar este método sobre otras técnicas como la respuesta cinética óptica o el ensayo de inversión de la cola, es que es un método barato y sencillo que utiliza equipos fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios. Para preparar los renacuajos, primero se obtienen embriones de xenopus fertilizados, marcas, ringers modificados o MMR diluidos por un factor de 10 en placas de Petri de 60 milímetros con 50 microgramos por mililitro.

El antibiótico gentamicina coloca la blástula en los embriones en etapa de placa neural. Etapas dos a 15 a 18 grados centígrados en las placas de Petri. Una vez que los embriones alcancen una nueva etapa de 27 a 30 años, cámbielos a 0.1 XMMR sin antibióticos para permitir el crecimiento bacteriano intestinal.

Cuando los renacuajos alcancen la etapa de alimentación alrededor de la etapa 45, muévalos a placas de Petri de 100 milímetros con 0.1 XMMR. Al día siguiente, aliméntalos con sobrenadante de polvo de ortiga. Después de una semana en la placa de Petri de 100 milímetros, llene un tanque de medio galón con agua de rana.

Mueva a los animales al tanque y continúe con el programa de alimentación del sobrenadante de polvo de ortiga, pero cambie el agua solo dos o tres veces por semana. Cuando los animales estén en tanques de medio galón, manténgalos en un ciclo de 12 horas de luz, 12 horas de oscuridad con las luces que se encienden a las 6:00 a.m. Antes de la prueba, coloque el tanque de medio galón con los sujetos de prueba sobre una superficie blanca durante la noche durante al menos 12 horas antes de la prueba. El ensayo de comportamiento debe realizarse en un área tranquila y de poco tráfico con iluminación fluorescente estándar.

Prepare dos tanques de prueba de medio galón en las esquinas exteriores de lo que será el tanque interior. Use un rotulador para marcar la línea de flotación a cinco centímetros por encima del fondo. También para el tanque interior, identifique cualquier hendidura en su interior.

Llénalos con un compuesto inerte para evitar que los renacuajos permanezcan en ellos. Ahora dirija la atención al segundo tanque exterior. Para el siguiente paso, consigue cinta aislante negra y papel de seda blanco.

Use la cinta para cubrir el exterior de una mitad del tanque y el papel de seda para cubrir el exterior de la otra como se muestra aquí. Una vez que los tanques estén preparados, configure una plataforma giratoria inoculadora y coloque los tanques anidados en ella. Coloque un trípode y una cámara web para que la cámara pueda obtener imágenes del interior de los tanques desde arriba.

Conecte la cámara web a una computadora con software de captura y reproducción de video. Encienda la cámara y prepárese para realizar una nueva grabación de vídeo. A continuación, coloque un paño de algodón ligero sobre la cámara y los tanques.

Para reducir las señales externas a los renacuajos, use un medidor de luminancia y verifique que la luminancia debajo de la tela esté entre 35 y 50 velas por metro cuadrado. Inicie el ensayo de comportamiento recuperando el tanque de prueba interno. Llénalo con agua de rana hasta la marca de cinco centímetros.

Use una red para transferir un animal de su contenedor de medio galón al tanque de prueba interno en la computadora. Asegúrese de que el software de grabación esté abierto y registrando el área de prueba para el mantenimiento de registros. Escribe el nombre del animal, la fecha y la hora en una hoja de papel.

Colócalo debajo de la cámara para grabar. Una vez hecho esto, preestablezca un temporizador durante dos minutos. A continuación, oriente el tanque exterior en la plataforma giratoria, de modo que el lado negro quede a la derecha.

Ahora coloque el tanque de prueba en el tanque exterior. En el área de grabación, cierre la cortina y use la pantalla de la computadora para asegurarse de la orientación del tanque exterior. Asegúrese de que el video se esté grabando e inicie el temporizador.

Cuando el temporizador emita un pitido, mantenga la cortina en su posición y retire el tanque de prueba interior. A continuación, gire el tanque exterior 180 grados para que el lado negro quede ahora a la izquierda. Regrese el tanque de prueba al tanque exterior y encienda el temporizador de dos minutos.

Nuevamente, retire el tanque interior. Gire el tanque exterior 180 grados y reemplace el tanque interior cada dos minutos por un total de 10 veces. Cuando termine, detenga la grabación de video.

Regrese el renacuajo a su tanque de medio galón. Prepare un microscopio para realizar la exsodomía con retinol. Llene una placa de Petri de 60 milímetros con 1%aros derretidos en 0.1 XMMR y deje que se solidifique.

Retira un pequeño trozo rectangular del tamaño del renacuajo. Cuando esté listo para continuar, recupere el animal de prueba y colóquelo en 0.02%Trica. Continúe cuando no responda a un pellizco de cola con las pinzas número tres.

Luego transfiera el animal al plato. Proceda montando la placa de Petri en el microscopio. Prepárese para sujetar al animal con pinzas en un lado.

En el lado opuesto, use una aguja de calibre 25 para perforar la piel detrás de la región dorsal del ojo en un ángulo de 45 grados, alcance cuidadosamente el orificio con el número cinco, pinzas y corte el nervio óptico evitando la vena al lado. Apartar el nervio y retraer las pinzas después de la cirugía. Recupera al animal colocándolo en una placa de Petri de 100 milímetros con 0,7 XMMR y 50 microgramos por mililitro.

Gentamicina durante 20 minutos. Después de eso, transfiera el renacuajo a un tanque de recuperación con agua de rana. Coloque el tanque sobre una superficie blanca en preparación para la prueba.

Deja que el animal descanse toda la noche. A la mañana siguiente, use el ensayo conductual para evaluar la función visual. Esta película muestra datos representativos del experimento.

A la izquierda están los animales antes de la cirugía, a la derecha están los mismos animales después de que se hayan cortado los axones de la retina de ambos ojos. Esto se indica mediante el esquema en las esquinas inferiores. El agua fue alterada para mostrar que no se ha añadido nada para repeler a los animales del lado negro o atraerlos hacia el lado blanco.

Los renacuajos antes de la cirugía responden al color de fondo en menos de 30 segundos, mientras que los renacuajos ciegos nadan sin rumbo alrededor del tanque. Este gráfico muestra el porcentaje de tiempo que se pasa en las regiones blanca y negra para un solo animal en tres condiciones. En primer lugar, se observó al animal antes de cualquier cirugía mediante el ensayo.

En dos días consecutivos después de que se cortara el nervio óptico derecho, se observó su comportamiento durante dos días de pruebas. Finalmente, después de que se cortaron ambos nervios ópticos, hubo dos días más de observación con el ensayo. El animal pasó más días en el lado blanco del tanque cuando al menos un nervio óptico estaba intacto.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar la visión de los renacuajos utilizando reactivos y equipos simples que se encuentran en la mayoría de los laboratorios de ranas. Buena suerte con tus experimentos.