Name: Un ensayo de comportamiento simple para Pruebas de función visual en Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprende a evaluar la función visual en renacuajos de Xenopus laevis mediante un ensayo de comportamiento simple y económico. Este método permite medir preferencias de natación en tanques bicolor para estudiar procesos sensoriales.

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Este trabajo fue financiado por becas de los Institutos Nacionales de Salud: EY015748, EY017964 (MEZ), y EY019517 (ASV). Este trabajo también fue apoyado por la investigación para prevenir la ceguera sin restricciones de subvención al Departamento de Oftalmología y los Leones de la central de Nueva York. También nos gustaría dar las gracias a nuestro técnico en animales, Matthew Mellini, por su excelente cuidado de los animales y por intervenir para protagonizar un video.

Cuidado de los Animales La Xenopus laevis renacuajos utilizadas en este estudio fueron cultivados, criados y tratados de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Upstate Medical University IACUC y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. . 1 Configuración Pre-comportamiento: Los renacuajos <ol><li> Obtener embriones de Xenopus fertilizados de una fuente disponible comercialmente o in vitro fertilizar oocitos, como se describió anteriormente 6. </li><li> Coloque blástula a embriones en estadio de la placa neural a 18 ˚ C en 60 mm placas de Petri que contienen 0.1X MMR [10 Modificado solución (MMR) de las acciones de Ringer X Marc (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES; 1 M de NaCl; se ajustó a pH 7,5, sometido a autoclave y se almacenó a temperatura ambiente)] con antibiótico gentamicina 50 mg / ml. Cambie 0.1X MMR cada día y quitar cualquier embriones muertos. </li><li> Una vez que los embriones alcanzan el estadio Nieuwkoop y Faber ~ 27 al 30 julio, cambiar the embriones en 0.1X MMR sin antibiótico para permitir el crecimiento bacteriano intestinal. </li><li> Crecer los renacuajos hasta que alcanzan la etapa de alimentación (etapa 45) y moverlos a 100 mm placas de Petri llenas de 0.1X MMR. Aliméntelos sobrenadante polvo de ortiga cada dos días durante una semana, el cambio de la 0,1 X MMR en el día intermedio. </li><li> Después de una semana en el plato de Petri de 100 mm, desplazar a los animales a medio galón tanques llenos de agua rana [0,5 g / L océano instantánea y 2 mM de sodio fosfato dibásico (Na 2 HPO 4: mw 141.96) pH 6,8]. Darles de comer como en el paso 2.4, pero cambie el agua sólo 2-3 veces por semana, cuando el agua está turbia. Mantener a los animales en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas light/12 con las luces de encender a las 6 am. </li><li> Coloque el depósito de medio galón con los sujetos de prueba en una superficie blanca, como un underpad mesa de laboratorio, por lo menos 12 hr O / N, antes de la prueba. </li><li> Renacuajos de prueba en las etapas 45 y 50 tal como se describe en el paso 3 a continuación. </li></ol> . 2 Configuración Pre-comportamiento: Equipot <ol><li> Ponga a un lado un área de laboratorio para el ensayo de comportamiento. Debe estar en una zona tranquila y con poco tráfico con iluminación fluorescente estándar. </li><li> Preparar los bancos de ensayo para los animales. Los tanques de prueba de medio galón anidados se componen de dos partes: un tanque interno que contendrá el agua y renacuajos; y un tanque exterior con el estímulo visual. <ol><li> Para el interior del tanque, hacer una pequeña marca en las esquinas exteriores con un Sharpie, 5 cm desde la parte inferior; esta es la línea de agua (Figura 1A, línea punteada verde). </li><li> También, para el tanque interior, llena los divets en el tanque (en las esquinas y el centro) con un compuesto inerte, como Sylgard elastómero. NOTA: Los renacuajos se quedarán en estas zonas si no se llenan pulg </li><li> Para el tanque exterior, cubra exactamente la mitad de la parte exterior de un tanque con cinta aislante color negro y la otra mitad con el tejido blanco de papel Figura 1B. </li></ol></li><li> Coloque los tanques en ella inoculación de la placa giratoria. </li><li> Configuración de la cámara web / trípode de modo que está por encima de los bancos de ensayo. Ajustar la cámara para permitir la visualización de la zona de pruebas, como se muestra en la figura 1C. </li><li> Conecte la cámara web a un ordenador con el software QuickTime Player instalado 5. Encienda la cámara. En QuickTime Player, en Archivo, seleccione &#39;Nueva grabación de la película. &quot; La configuración del ensayo de comportamiento será visible en el equipo de inmediato. </li><li> Coloque un paño de algodón ligero en toda la instalación para reducir las señales externas que podrían afectar el comportamiento de renacuajo, así como, reducir la luz reflejada en la superficie del agua. </li><li> Asegúrese de que la luminancia bajo las medidas de tela entre 35-50 cd / m 2. </li></ol> 3. Ensayo de Comportamiento <ol><li> Llene el tanque de pruebas interior para la marca de 5 cm de agua realizada en el paso 1.2.1 con agua rana. </li><li> El uso de una pequeña red, mover suavemente al animal en el tanque de pruebas interno. </li><li> Abrir QuickTime software en la computadora y, usando el tanque exterior como guía, asegúrese de que la cámara es capaz de visualizar y grabar la zona de pruebas. </li><li> Escriba el nombre de un animal, la fecha y la hora en un pedazo de papel y grabar con la cámara. </li><li> Coloque el tanque de prueba en el tanque exterior con el lado negro de la cisterna a la derecha Figura 2. </li><li> Comience a grabar la película inmediatamente después de arreglar el tanque y ajustar el temporizador durante 2 min. </li><li> Cuando el temporizador de pitidos, retire el tanque de prueba interno, gire el depósito exterior 180 ° y coloque el tanque de prueba interna en el interior del tanque externo. Inicie el temporizador. Nota: el lado negro debe estar ahora en el otro lado. </li><li> Repita el paso 3.7, ocho veces más para un total de diez pruebas. Utilice la Figura 2 como guía, marcando cada ensayo. </li><li> Repita el ensayo de comportamiento en dos días separados. </li></ol> 4. Retina Axotomía <ol><li> Coloque animal en 0.02% tricaína hasta que no respondena una pizca de la cola con un # 3 pinzas. </li><li> Derretir 1% de agarosa en 0.1X MMR y luego añadir a un 60 mm placa de Petri. Una vez enfriado, hacer una pequeña chuleta rectangular en la agarosa y añadir el renacuajo a la chuleta con un poco de 0,02% tricaína, de modo que el animal está parcialmente sumergido en el líquido. </li><li> Pierce la piel en un ángulo de 45 grados detrás de la región dorsal del ojo con una aguja de 25 G, mientras sostiene el animal contra el fórceps sobre el lado opuesto. </li><li> Teniendo cuidado de no cortar la vena, que se encuentra al lado del nervio óptico, el alcance cuidadosamente en el agujero por el n º 5 de fórceps, cortar el nervio óptico y darle la vuelta a un lado. Si hay sangrado grave por accidente cortando la arteria, luego coloque rápidamente al animal en un 2% tricaína la eutanasia. PRECAUCIÓN: solución tricaína 2% puede causar entumecimiento en los seres humanos. Esta solución debe ser manejado con guantes. </li><li> Para recuperar el animal después de la cirugía, colocar animal en 100 mm de placa de Petri con 0.7X MMR y 50 mg / ml de gentamicina durante 20 min. Next, transferencia de renacuajo a depósito de recuperación con agua rana. Deje reposar animales O / N. </li><li> A la mañana siguiente, probar la función visual como se describió anteriormente (pasos 3.1 a 3.9). </li></ol> 5. Analizar Resultados <ol><li> Después de que se completen los ensayos, medir la cantidad de tiempo que el renacuajo se queda en el lado negro de la cisterna. <ol><li> Ver manual de los vídeos mediante un software que muestra la hora y permite pausas frecuentes. Mira el tiempo de visualización de vídeo. Anote el inicio de la prueba de dos minutos, que es cuando el tanque interior anida con éxito dentro del tanque exterior y se eleva al cuadrado en vista de la cámara. </li><li> Use la posición de los ojos del renacuajo de definir de qué lado del tanque de los animales están nadando en. Definir cruzar de un lado del tanque al otro sólo cuando ambos ojos han cruzado la línea de negro / blanco. </li></ol></li><li> Anote el comienzo y el final de cada intervalo (en segundos) que el animal pasa en el lado negro. Haga una pausa y volverenrollar el video para asegurar la exactitud. Sume el sec dentro de cada ensayo. </li><li> Entrada estos números en la hoja de trabajo Comportamiento adjunto. La hoja de trabajo calcula la relación entre el tiempo que el animal pasó por el lado blanco, restando el tiempo invertido en el lado negro del tanque de la prueba total de 120 segundos y se divide por el tiempo total en segundos [(120 - total gastado en segundos el lado negro) / 120 seg]. Los promedios de hoja de cálculo de este ratio de más de los 10 ensayos. </li><li> Utilice la prueba T de un estudiante, a la par, dos colas de distribución para determinar si los juicios entre los días son significativas (P ≤ 0,05). </li></ol>

<ol><li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li>
<li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li>
<li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7 (8), (2009).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
<li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+%28ACT%29+assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li>
<li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li>
<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se presenta aquí un sencillo ensayo de comportamiento guiado por visión que puede ser fácilmente realizado en menos de una semana por personal de laboratorio mínimamente entrenados. Mientras otros ensayos requieren equipo especializado y la experiencia en el comportamiento animal, este ensayo permite una prueba rápida para determinar la función visual. Otro ensayo de comportamiento, el ensayo de evitación de Visual, se ha desarrollado para determinar cómo el tectum contribuye a la percepción visual en Xenopus <...

Xenopus laevis se han utilizado como un organismo modelo para estudiar la formación del ojo. Los ojos se desarrollan rápidamente, creciendo hacia la madurez en menos de una semana para los genes de prueba o vías que tienen un efecto sobre el desarrollo visual y la función. Para probar la función visual, la respuesta optocinético y optomotor se ha utilizado en el pez cebra y los renacuajos Xenopus, respectivamente 1,2. Debido a que los ojos de los renacuajos Xenopus son relativamente más pequeño que el pez cebra, este ensayo requiere el uso de equipo especializado y personal entrenado para detectar el comportamiento sutil cola-flip y de movimiento ocular en Xenopus. Un comportamiento más robusto en Xenopus es la preferencia para nadar en un tanque con un fondo blanco, que se describe en el presente documento 3. Al colocar un renacuajo en un medio tanque negro / mitad blanco, el renacuajo pre-metamórfica nada rápidamente hacia el lado blanco del tanque. Se utilizó previamente este ensayo para determinar si derivado de células pluripotentesojos eran funcionales 4. Aquí, se presenta una versión detallada de este ensayo, que se puede utilizar para probar la función visual de los renacuajos de Xenopus premetamórficas. Este ensayo es más sencillo que el ensayo de respuesta optomotor, ya que sólo requiere una cámara de vídeo montada digitales, software de la cámara digital y el equipo estándar en la mayoría de los laboratorios de Xenopus. Además, la respuesta registrada no requiere una formación especial a los resultados de conteo. Nuestros resultados representativos muestran que el mismo grupo de renacuajos, después de haber sido sometidos a axotomía de la retina doble, nadar al azar alrededor del tanque. También hemos incluido los resultados del ensayo de comportamiento de un renacuajo representante, mostrando como uno de los ojos puede ser probado para la respuesta visual. Una hoja de cálculo se ha incluido para que los números adquiridos durante el ensayo pueden ser insertados y se analizaron. Esta hoja de trabajo se puede utilizar para determinar si los renacuajos probados tienen una respuesta visual.

<table><tbody><tr><td>Tanque flexible de 1/2 galón con tapa</td><td>eNasco</td><td></td><td>SB19271M Tamaño: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"</td></tr> <tr><td>Cinta</td><td></td><td></td><td></td>aislante</tr><tr><td>negra Papel</td><td></td><td></td><td></td>de seda blanco</tr><tr><td>Plato giratorio de inoculación grande</td><td>VWR</td><td>50809-022</td><td>Tamaño: Dia 114.3 x &nbsp; H 76,2 mm (4 1/2&nbsp; x&nbsp; 3")</td></tr><tr><td>Almohadilla interior Durasorb</td><td>VWR</td><td>82004-836</td><td>Tamaño: 43,2 x 60,1 cm (17 x 24")</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1945-34155-CS</td><td></td></tr><tr><td>Trípode</td><td></td> estándar <td>Varios</td><td></td></tr><tr><td>Cámara iSight o webcam</td><td>Apple</td><td>M8817LL/A</td><td>Bueno para renacuajos más grandes, pero los pequeños son difíciles de ver</td></tr><tr><td>Ordenador portátil</td><td>Apple/PC</td><td>Varios</td><td>Utilizamos un MacBook de 13", 2 GHz Intel Core 2 Duo con MacOSX Lion 10.7.5</td></tr><tr><td>MiniDV videocámara handycam</td><td>SONY</td><td>DCR-HC42</td><td>Conectado por firewire a la computadora con un FireWire 400 alfa de 6 y 4 conductores&nbsp;</td></tr><tr><td>Estación Handycam</td><td>SONY</td><td>DCRA-C121</td><td>Se puede utilizar para conectar firewire a la cámara</td></tr><tr><td>Software QuickTime Player</td><td>Quicktime</td><td>versión 10.1</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 26 G (5/8" de longitud)</td><td>VWR</td><td>BD305115</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desechables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-528Z</td><td>Almacenado en RT</td></tr><tr><td>Sylgard 184 elastómero de silicona</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Solución madre = 100 g/L almacenado en RT</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0876</td><td>Solución madre = 0,4 M almacenado en RT</td></tr><tr><td>In vitro embriones fecundados</td><td>eNasco</td><td>LM00490MX</td><td>100 embriones/unidad</td></tr></tbody></table>

un ensayo de comportamiento simple para pruebas de función visual en<em&gt; xenopus laevis</em

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

La medición de la función visual en los renacuajos de la rana Xenopus laevis, permite la detección de la ceguera en los animales vivos. La respuesta es un optocinético, comportamiento reflexivo basado en visión que se ha observado en todos los vertebrados examinados. Tadpole ojos son pequeños, así que utiliza la respuesta flip cola como medida alternativa, que requiere de un técnico capacitado para registrar la respuesta sutil. Hemos desarrollado un ensayo alternativo comportamiento basado en el hecho de que los renacuajos prefieren nadar en el lado blanco de un tanque cuando se coloca en un tanque con lados negros y blancos. El ensayo que aquí se presenta es una alternativa de bajo costo, simple que crea una respuesta que se mide fácilmente. La instalación consiste en un trípode, cámara web y tanques de prueba anidados, fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios de Xenopus. Este artículo incluye una película que muestra el comportamiento de los renacuajos, antes y después de cortar el nervio óptico. Con el fin de probar la función de uno de los ojos, también incluimos repreresultados representativos de un renacuajo en la que cada ojo se sometió a la axotomía de la retina en días consecutivos. Los estudios futuros podrían desarrollar una versión automatizada de este ensayo para probar la visión de muchos renacuajos a la vez.

Informes anteriores han demostrado que los renacuajos de Xenopus premetamórficas prefieren nadar en la parte blanca de un / tanque blanco negro y llamado a este ensayo, el fondo del ensayo preferencia de color 3 Hemos cambiado este ensayo con el fin de probar la función visual de uno de los ojos de los renacuajos en menos de una semana. De esta manera, sus ojos se pueden recoger para el examen histológico. Mostramos aquí cómo la respuesta se debe a las señales visuales. E...

Xenopus laevis renacuajos prefieren nadar en la parte blanca de un / tanque blanco negro. Este comportamiento es guiado por su visión. Sobre la base de este comportamiento, se presenta un ensayo simple para probar la función visual de los renacuajos.

Un ensayo de comportamiento simple para Pruebas de función visual en<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función visual de las ranas mediante el registro del tiempo que el animal pasa en la mitad del tanque de prueba que está cubierta de negro. Esto se logra primero criando las ranas hasta las etapas 45 a 50. El segundo paso consiste en preparar un tanque dividido en mitades, una negra y otra blanca, junto con una cámara para el ensayo de comportamiento. A continuación, coloque un segundo tanque con una larva de rana en el tanque exterior. Para cada registro de larva de rana, anote el comportamiento guiado por la visión mientras se cambia el fondo de su entorno. El paso final consiste en realizar una exsudación retinal en las larvas de rana y luego repetir el ensayo de comportamiento.En última instancia, los datos de este ensayo sencillo y económico se utilizan para demostrar que las larvas tienen preferencia por nadar en un lado del tanque frente al otro, bajo pruebas de visión fototópica. La principal ventaja de usar este método frente a otras técnicas como la respuesta cinética óptica o el ensayo de flexión de la cola, es que se trata de un método económico y sencillo que emplea equipo fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios de opus. Para preparar las larvas, primero obtenga embriones fertilizados de Xenopus, coloque en soluciones de Ringer modificadas de Marc o MMR diluidas por un factor de 10 en placas de Petri de 60 milímetros con 50 microgramos por mililitro.Coloque embriones del estadio de blástula al estadio de placa neural con antibiótico gentamicina. Incube los estadios dos a 15 a 18 grados Celsius en las placas de Petri. Una vez que los embriones alcancen el estadio de copa neuromastónica de aproximadamente 27 a 30, transfórmelos a MMR 0,1 X sin antibióticos para permitir el crecimiento bacteriano intestinal.Cuando los renacuajos alcancen la etapa de alimentación, alrededor de la etapa 45, transfiérelos a placas de Petri de 100 milímetros con MMR 0,1 X. Al día siguiente, aliméntelos con el sobrenadante de polvo de ortiga. Después de una semana en la placa de Petri de 100 milímetros, llene un tanque de medio galón con agua para ranas.Traslade los animales al tanque y continúe con el horario de alimentación con el sobrenadante de polvo de ortiga, pero cambie el agua solo dos o tres veces por semana. Cuando los animales estén en tanques de medio galón, manténgalos en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con la luz encendiéndose a las 6:00 AM. Antes de la prueba, coloque el tanque de medio galón con los sujetos de prueba sobre una superficie blanca durante la noche, al menos 12 horas antes del ensayo. El ensayo de comportamiento debe realizarse en un área tranquila y con poco tránsito, con iluminación fluorescente estándar.Prepare dos tanques de prueba de medio galón para anidar en las esquinas exteriores de lo que será el tanque interior. Utilice un rotulador Sharpie para marcar la línea de agua a cinco centímetros por encima del fondo. Asimismo, para el tanque interior, identifique cualquier irregularidad en su interior.Llénalos con un compuesto inerte para evitar que las ranas en estado de renacuajo permanezcan en ellos. Ahora dirija la atención al segundo tanque exterior. Para el siguiente paso, obtenga cinta aislante negra y papel de seda blanco.Utilice la cinta para cubrir el exterior de una mitad del tanque y el papel de seda para cubrir el exterior de la otra, como se muestra aquí. Una vez preparados los tanques, configure una mesa giratoria de inoculación y coloque los tanques anidados sobre ella. Coloque un trípode y una cámara web de manera que la cámara pueda obtener imágenes del interior de los tanques desde arriba.Conecte la cámara web a una computadora con software de captura y reproducción de video. Encienda la cámara y prepárese para realizar una nueva grabación de video. A continuación, coloque un paño de algodón ligero sobre la cámara y los tanques.Para reducir las señales externas para los renacuajos, utilice un fotómetro y verifique que la luminancia bajo la tela esté entre 35 y 50 bujías por metro cuadrado. Comience el ensayo de comportamiento recuperando el tanque interno de pruebas. Llénelo con agua para ranas hasta la marca de cinco centímetros.Utilice una red para transferir un animal desde su recipiente de medio galón al tanque interno de prueba en el ordenador. Asegúrese de que el software de grabación esté abierto y grabando el área de prueba para fines de registro. Escriba el nombre del animal, la fecha y la hora en un trozo de papel.Coloque esto debajo de la cámara para la grabación. Una vez hecho esto, configure un temporizador para dos minutos. A continuación, oriente el tanque externo sobre la plataforma giratoria, de modo que el lado negro quede a la derecha.Ahora coloque el tanque de prueba dentro del tanque externo. En el área de grabación, cierre la cortina y utilice la pantalla del ordenador para verificar la orientación del tanque externo. Asegúrese de que se esté grabando el video e inicie el cronómetro.Cuando suene el temporizador, mantenga la cortina en su posición y retire el tanque interno de prueba. A continuación, gire el tanque externo 180 grados de modo que el lado negro quede ahora a la izquierda. Vuelva a colocar el tanque de prueba en el tanque externo e inicie el temporizador de dos minutos.De nuevo, retire el tanque interno. Gire el tanque externo 180 grados y sustituya el tanque interno cada dos minutos durante un total de 10 veces. Al finalizar, detenga la grabación de video.Devuelva la rana a su tanque de medio galón. Prepare un microscopio para realizar la exsudación de retinol. Llene una placa de Petri de 60 milímetros con 1 % aros fundido en 0,1 XMMR y deje que solidifique.Retire un pequeño trozo rectangular del aros del tamaño del renacuajo. Cuando esté listo para continuar, recupere el animal de prueba y colóquelo en Trica al 0,02 %. Continúe cuando no responda a un pellizco en la cola con pinzas número tres.Luego, transfiera el animal al recipiente. Proceda a montar la placa de Petri en el microscopio. Prepárese para sujetar al animal con pinzas en un lado.En el lado opuesto, utilice una aguja de calibre 25 para perforar la piel detrás de la región dorsal del ojo en un ángulo de 45 grados; cuidadosamente introduzca la pinza número cinco en el orificio y corte el nervio óptico evitando la vena adyacente. Gire el nervio hacia un lado, retire la pinza tras la cirugía. Recupere al animal colocándolo en una placa de Petri de 100 milímetros con 0,7 XMMR y 50 microgramos por mililitro.Gentamicina durante 20 minutos. Después, transfiera la renacuaja a un tanque de recuperación con agua para ranas. Coloque el tanque sobre una superficie blanca en preparación para la prueba.Deje que el animal descanse durante la noche. A la mañana siguiente, utilice el ensayo conductual para evaluar la función visual. Esta película muestra datos representativos del experimento.A la izquierda se muestran los animales antes de la cirugía; a la derecha, los mismos animales después de que se han seccionado los axones retinianos de ambos ojos. Esto se indica mediante el esquema en las esquinas inferiores. Se agitó el agua para mostrar que no se ha añadido nada que repele a los animales del lado negro o los atrae hacia el lado blanco.Las renacuajas antes de la cirugía responden al color de fondo en menos de 30 segundos, mientras que las renacuajas ciegas nadan sin rumbo por el tanque. Este gráfico muestra el porcentaje de tiempo pasado en las regiones blanca y negra para un solo animal bajo tres condiciones. Primero, se observó al animal antes de cualquier cirugía utilizando el ensayo.En dos días consecutivos después de seccionar el nervio óptico derecho, se observó su comportamiento durante dos días de pruebas. Finalmente, tras seccionar ambos nervios ópticos, hubo dos días más de observación con el ensayo. El animal pasó más días en el lado blanco del tanque cuando al menos un nervio óptico estaba intacto.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar la visión de las ranas en estado de renacuajo utilizando reactivos y equipo sencillos que se encuentran en la mayoría de los laboratorios de ranas. Buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Pruebas de sensibilidad visual de las lagartijas con un paradigma de condicionamiento operante que utiliza la reproducción de vídeo de puntos aleatorios kinematograms e invertebrados generadas por ordenador.

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Hemos desarrollado la respuesta de Visual-Motor para cuantificar la potencia del motor de larvas de pez cebra en respuesta a incrementos de la luz y disminuye. También se examinaron el pez cebra mutantes de visión, incluyendo la no respuesta optocinético (NRC) de los mutantes, lo que se pensaba que eran completamente ciegos cuando se probó por otro ensayo de la visión, el reflejo de optocinético.

Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

El VisioTracker es un sistema automatizado para el análisis cuantitativo de los resultados visuales de peces adultos de larvas y pequeños basados ​​en el registro de los movimientos oculares. Cuenta con un control total sobre propiedades de los estímulos visuales y análisis en tiempo real, permitiendo la investigación de alto rendimiento en áreas como el desarrollo del sistema visual y la función, la farmacología, los estudios neuronales del circuito y la integración sensoriomotora.

VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

Este video describe el ensayo de respuesta optocinética en pez cebra. El video mide los movimientos oculares reflejos en función del estímulo visual en movimiento y determina la agudeza visual en el pez cebra.

Ensayo de respuesta optocinética: un método para medir la agudeza visual en el pez cebra

El video describe el ensayo de evitación y tigmotaxis de las larvas de pez cebra. El video examina el comportamiento de las larvas de pez cebra en respuesta a estímulos aversivos visuales.

Ensayo de evitación y tigmotaxis del pez cebra: un método de alto rendimiento para examinar el comportamiento de las larvas en respuesta a estímulos visuales aversivos

El pez cebra ha sido una herramienta valiosa para muchas áreas de investigación. Aquí se demuestra un método para provocar una respuesta visual y calcular una agudeza visual funcional en el pez cebra adultos.

La respuesta optocinética como una medida cuantitativa de la agudeza visual en el pez cebra

Presentamos un método para el análisis electrorretinográfico (ERG) de larvas de pez cebra utilizando técnicas de micromanipulación y electrorretinografía. Este es un método simple y directo para analizar la función visual de las larvas de pez cebra in vivo.

Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso en vivo. Se describen metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de Xenopus larvas en condiciones normales de cría o después de la lesión.

Evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de Xenopus de vida

Para examinar la visión del ratón, llevamos a cabo una prueba inminente. Los ratones fueron colocados en una gran arena cuadrada con un monitor en su techo. El estímulo visual que se avecina constantemente evocaba la congelación o las reacciones de vuelo en los ratones.

Uso de estímulos visuales en ciernes para evaluar la visión del ratón

Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.

Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

La degeneración neuronal tanto en los ojos como en el cerebro como resultado de la diabetes se puede observar a través de pruebas de comportamiento realizadas en roedores. El laberinto en Y, una medida de la cognición espacial, y la respuesta optomotora, una medida de la función visual, proporcionan información sobre posibles diagnósticos y tratamientos.

Evaluación conductual de la función visual a través de la respuesta optomotora y la función cognitiva a través de Y-Maze en ratas diabéticas

Aprende a evaluar la función visual en renacuajos de Xenopus laevis mediante un ensayo de comportamiento simple y económico. Este método permite medir preferencias de natación en tanques bicolor para estudiar procesos sensoriales.

Un ensayo de comportamiento simple para Pruebas de función visual en

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